Síntese de Hidrogel Adesivo Forte, Gelatina O-Nitrosobenzaldeído

Resumo

O protocolo aqui apresentado mostra a síntese de um forte hidrogel adesivo gelatina o-nitrosobenzaldeído (gelatina-NB). A gelatina-RN tem uma capacidade de adesão tecidual rápida e eficiente, que pode formar uma forte barreira física para proteger as superfícies das feridas, por isso espera-se que seja aplicada no campo da biotecnologia de reparação de lesões.

Resumo

Os materiais adesivos tornaram-se biomateriais populares no campo da engenharia biomédica e de tecidos. Em nosso trabalho anterior, apresentamos um novo material - gelatina o-nitrosobenzaldeído (gelatina-NB) - que é utilizado principalmente para regeneração tecidual e foi validado em modelos animais de lesão corneana e doença inflamatória intestinal. Este é um novo hidrogel formado pela modificação da gelatina biológica com o-nitrosobenzaldeído (NB). A gelatina-RN foi sintetizada ativando-se o grupo carboxila do NB-COOH e reagindo com gelatina através do cloridrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (EDC) e N-hidroxisuccinimida (NHS). O composto obtido foi purificado para gerar o produto final, que pode ser armazenado de forma estável por pelo menos 18 meses. O RN tem uma forte adesão ao -NH₂ no tecido, o que pode formar muitas ligações C = N, aumentando assim a adesão da gelatina-RN à interface tecidual. O processo de preparação compreende etapas para a síntese do grupo NB-COOH, modificação do grupo, síntese de gelatina-NB e purificação do composto. O objetivo é descrever detalhadamente o processo específico de síntese de gelatina-RN e demonstrar a aplicação de gelatina-NB na reparação de danos. Além disso, o protocolo é apresentado para fortalecer e expandir ainda mais a natureza do material produzido pela comunidade científica para cenários mais aplicáveis.

Introdução

O hidrogel é um tipo de polímero tridimensional formado pelo inchaço da água. Em particular, o hidrogel derivado de uma matriz extracelular é amplamente utilizado no campo da biossíntese e da medicina regenerativa devido à sua excelente biocompatibilidade e eficácia terapêutica¹. Hidrogéis têm sido relatados para o tratamento de úlceras gástricas, neurite, infarto do miocárdio ^2,3,4 e outras doenças. Além disso, tem sido comprovado que a gelatina-RN pode promover o desfecho da inflamação da doença inflamatória intestinal (DII)⁵. Os hidrogéis tradicionais incluem goma gelana, gelatina, ácido hialurônico, polietilenoglicol (PEG), em camadas, hidrofóbicos/hidrofílicos, alginato/poliacrilamida, rede dupla e hidrogéis polianfotéricos⁶, todos com boa histocompatibilidade e propriedades mecânicas. No entanto, esses hidrogéis tradicionais são vulneráveis à umidade e ao ar no ambiente. Se eles são expostos ao ar por um longo tempo, eles vão perder água e secar; se estiverem imersos na água por um longo tempo, absorverão água e se expandirão⁷, reduzindo assim sua flexibilidade e função mecânica. Além disso, manter a adesão tecidual dos hidrogéis convencionais é um grande desafio⁸.

Com base nisso, projetamos e sintetizamos um hidrogel gelatina-NB em nanoescala, que é um novo hidrogel formado pela modificação da gelatina biológica com NB (Figura 1). O RN tem uma forte capacidade de adesão a -NH₂ no tecido, o que pode formar um grande número de ligações C = N, aumentando assim a adesividade da interface hidrogel-tecido. Esta forte adesão pode fazer com que o hidrogel adera firmemente à superfície do tecido, formando assim um revestimento molecular de nível nano. Em estudos anteriores da equipe, foi confirmado que esse tipo de revestimento de hidrogel modificado melhorou a adesão tecidual⁹; pode aderir de forma estável aos órgãos e tecidos da córnea e intestinal e desempenhar papéis anti-inflamatórios, isolamento de barreira e promoção da regeneração. O objetivo é apresentar o processo específico de síntese de gelatina-RN em detalhes aqui, para que a gelatina-NB possa ser aplicada em mais cenários de reparação de danos. Além disso, incentivamos outros pesquisadores a fortalecer e expandir ainda mais a natureza desse material para atender a mais cenários de aplicação.

Protocolo

Os ratos C57BL/6 foram comprados da Escola de Medicina da Universidade de Zhejiang, Sir Run Run Shaw Hospital. Os coelhos da Nova Zelândia foram comprados da Universidade de Zhejiang. Os animais foram mantidos em condições naturais do ciclo claro-escuro e receberam comida e água potável livremente. Todos os procedimentos experimentais foram aprovados eticamente pelas diretrizes institucionais das diretrizes padrão do Comitê de Ética da Universidade de Zhejiang (ZJU20200156) e do Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Hospital Sir Run Run Shaw da Escola de Medicina da Universidade de Zhejiang, que se conformaram ao Guia do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (SRRSH202107106).

1. Síntese do NB-COOH

1. Preparar 4-hidroxi-3-(metoxi-D3) benzaldeído (8,90 g, 58,5 mM, 1,06 equivalentes [eq.]), carbonato de potássio (10,2 g, 73,8 mM, 1,34 eq.) e 4-bromobutatrato de metila (9,89 g, 55,0 mM, 1,0 eq.) com base no protocolo proposto no estudo anterior¹⁰. Dissolver os compostos em 40 mL de N, N-dimetilformamida (DMF) e agitar à temperatura ambiente por 16 h.
2. Adicionar 200 ml de água a 0 °C à mistura e precipitá-la para obter um produto bruto.
3. Dissolva repetidamente o produto bruto em DMF e, em seguida, precipite por cinco ciclos. Precipitar o produto bruto e secá-lo a 80 °C durante 2 h para obter o produto inicial.

2. Modificação e processamento de produtos químicos

1. Efectuar a substituição ipso do éster metílico do ácido butanoico metil 4-(4-formil-2-metoxifenoxifenil) conforme descrito abaixo.
2. Adicionar 9,4 g de butanoato de metil 4-(4-formil-2-metoxifenoxi) (37,3 mM, 1 eq.) lentamente a uma solução pré-resfriada (-2 °C) de ácido nítrico a 70% (140 mL) e agitar a -2 °C por 3 h.
   NOTA: Dependendo da temperatura da reação de nitração, a substituição ipso da porção formila ocorrerá.
3. Filtrar a mistura (~9,0 g) com 200 ml de água a 0 °C e, em seguida, purificá-la em DMF para precipitar um produto sólido.
4. Hidrolisar o produto sólido em ácido trifluoroacético (TFA)/H₂O, 1:10 v/v (100 ml) a 90 °C e secar. Retirar o solvente com menos de 80 kPa para obter o produto intermédio final, um pó seco amarelo-pálido.
5. Dissolver o produto intermédio (7,4 g, 23,8 mM, 1,0 eq.) em tetraidrofurano (THF)/etanol, 1:1 v/v (100 ml). Em seguida, adicionar 1,43 g de NaBH₄ (35,7 mM, 1,5 eq.) lentamente a 0 °C. Após 3 h, retirar todos os solventes sob vácuo e suspender o resíduo numa solução de água e diclorometano 1:1 (50 ml cada).
6. Prepare o diclorometano para extrair o produto da camada aquosa. Remova a camada orgânica e seque sobre sulfato de magnésio.
7. Purificar o produto bruto por cromatografia em coluna de sílica gel utilizando DCM/MeOH numa proporção de 10:1 (1% de TEA). Finalmente, obtenha-se 5,31 g (18,6 mM, 78,3%) de pó amarelado relativamente puro NB-COOH.

3. Síntese de gelatina-NB

1. Preparar 5 g de gelatina para um lote de modificação. Preparar uma solução de gelatina homogénea dissolvendo 5 g de gelatina em 100 ml de água deionizada e conservar a 37 °C.
   NOTA: Aqui, os 33 x 10-5 moles originais ^ε-amino groups/g gelatina¹¹ são definidos.
2. Definir a razão alimentar (FR) como a razão molar entre os grupos RN e os grupos amino primários da gelatina. Neste estudo, 53 mg de RN com 1 g de gelatina foram definidos como FR_NB = 1.
3. Dissolver 1.060 mg de NB-COOH em 5 mL de dimetilsulfóxido (DMSO) para ativar os grupos carboxila de NB-COOH. Como o grupo NB é sensível à luz ultravioleta (UV) quando em solução, mantenha-o sempre longe da luz.
4. Adicionar 746 mg de cloridrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodimida (EDC) à solução de NB-COOH DMSO e agitar durante 5 minutos. Após a dissolução do EDC, adicione 448 mg de N-hidroxisuccinimida (NHS) e mexa por 5 min.
5. Utilizar uma ampola de gota para soltar lentamente a mistura a uma velocidade de 0,5 ml/min na solução de gelatina dissolvida com agitação vigorosa para reagir a 45 °C durante 4 h.

4. Purificação e armazenamento do produto

1. Dialisar a solução de gelatina-NB contra o excesso de água desionizada por pelo menos 3 dias, em seguida, coletar, congelar e liofilizar para obter as espumas de gelatina-NB. Mantenha as espumas em um exsicador no escuro para uso posterior.
2. Dissolver as espumas de gelatina-NB liofilizadas em água desionizada a 37 °C, imediatamente antes da utilização.

Resultados

A Figura 2A mostra um esquema das principais reações químicas envolvidas na síntese de gelatina-RN, que promove a integração tecidual por enxertia de grupos RN em gelatina. A Figura 2B mostra que o O-nitrobenzeno do hidrogel gelatina-NB se converte em um grupo NB imediatamente após a irradiação UV e, em seguida, o grupo aldeído ativo pode ser reticulado com um grupo amino para formar uma base de Schiff. A Figura 2C indica ...

Discussão

Os materiais adesivos são uma nova classe de materiais. Mais e mais pesquisadores estão comprometidos com a síntese de vários tipos de materiais adesivos e estão tentando encontrar suas aplicações em biotecnologia, engenharia de tecidos, medicina regenerativa e outros campos, o que levou a um desenvolvimento vigoroso nos últimos anos. Além de se concentrar na forte adesão de materiais adesivos, os pesquisadores também estão prestando mais atenção a outras propriedades, como injetabilidade, autocicatrizaçã...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-(3Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodimide hydrochloride (EDC)	Aladdin	L287553
4-Hydroxy-3-(methoxy-D3) benzaldehyde	Shanghai Acmec Biochemical Co., Ltd	H946072
DCM	Aladdin	D154840
Dichloromethane	Sigma-Aldrich	270997
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	20-139
dimethylformamide (DMF)	Sigma-Aldrich	PHR1553
gelatin	Sigma-Aldrich	1288485
magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M7506
MeOH	Sigma-Aldrich	1424109
methyl 4-(4-formyl-2-methoxyphenoxy methoxyphenyl) butanoic acid methyl ester	chemsrc	141333-27-9
methyl 4-bromobutyrate	Aladdin	M158832
NaBH4	Sigma-Aldrich	215511
N-hydroxysuccinimide (NHS)	Aladdin	D342712
nitric acid	Sigma-Aldrich	225711
potassium carbonate	Sigma-Aldrich	209619
SEM (Nova Nano 450)	Thermo FEI	17024560
THF/EtOH	Aladdin	D380010
trifluoroacetic acid (TFA)	Sigma-Aldrich	8.0826