Síntese de Hidrogéis de Matriz Extracelular de Cartilagem Descelularizada

Resumo

Este trabalho apresenta um novo método para a síntese de hidrogéis de matriz extracelular de cartilagem decelularizada (DC-ECM). Os hidrogéis DC-ECM têm excelente biocompatibilidade e fornecem um microambiente superior para o crescimento celular. Portanto, podem ser arcabouços celulares ideais e sistemas de liberação biológica.

Resumo

Os hidrogéis de matriz extracelular de cartilagem decelularizada (DC-ECM) são biomateriais promissores para a engenharia de tecidos e medicina regenerativa devido à sua biocompatibilidade e capacidade de mimetizar propriedades teciduais naturais. Este protocolo visa produzir hidrogéis DC-ECM que mimetizem intimamente a MEC nativa do tecido cartilaginoso. O protocolo envolve uma combinação de ruptura física e química e digestão enzimática para remover o material celular, preservando a estrutura e a composição da MEC. O DC-ECM é reticulado usando um agente químico para formar um hidrogel estável e biologicamente ativo. O hidrogel DC-ECM tem excelente atividade biológica, estrutura espacial e função de indução biológica, além de baixa imunogenicidade. Essas características são benéficas para promover a adesão, proliferação, diferenciação e migração celular e para criar um microambiente superior para o crescimento celular. Este protocolo fornece um recurso valioso para pesquisadores e clínicos na área de engenharia de tecidos. Os hidrogéis biomiméticos podem potencialmente melhorar o desenvolvimento de estratégias eficazes de engenharia tecidual para o reparo e regeneração da cartilagem.

Introdução

A engenharia de tecidos cartilaginosos é um campo em rápido desenvolvimento que busca regenerar tecido cartilaginoso danificado ou doente¹. Um dos principais desafios nesse campo é o desenvolvimento de arcabouços biomiméticos que possam suportar o crescimento e a diferenciação dos condrócitos, células responsáveis pela produção de^cartilagem2. A MEC do tecido cartilaginoso desempenha um papel crítico na regulação do comportamento dos condrócitos. DC-ECM é um arcabouço eficaz para aplicações de engenharia de tecidos³.

Várias técnicas foram desenvolvidas para produzir DC-ECM a partir de tecido cartilaginoso, incluindo métodos químicos, enzimáticos e físicos. No entanto, esses métodos frequentemente resultam na geração de hidrogéis de MEC insuficientemente biomiméticos, o que limita seu potencial para uso em aplicações de engenharia de tecidos ^4,5. Assim, há necessidade de um método mais eficaz para a produção de hidrogéis DC-ECM.

O desenvolvimento desta técnica é importante porque pode avançar no campo da engenharia de tecidos, fornecendo uma nova abordagem para a criação de arcabouços biomiméticos que podem apoiar a regeneração e reparação tecidual. Além disso, essa técnica poderia ser facilmente adaptada para produzir hidrogéis de MEC a partir de outros tecidos, ampliando assim suas potenciais aplicações.

No corpo mais amplo da literatura, tem havido um interesse crescente no uso de DC-ECM como arcabouço para aplicações de engenharia de tecidos⁶. Numerosos estudos têm demonstrado a eficácia dos hidrogéis DC-ECM em promover o crescimento e diferenciação celular em vários tecidos, incluindo a cartilagem ^7,8. Portanto, o desenvolvimento de um protocolo para a produção de hidrogéis DC-ECM que mimetizem intimamente a MEC natural do tecido cartilaginoso é uma contribuição significativa para o campo.

O protocolo apresentado neste trabalho aborda essa necessidade, fornecendo um novo método para a produção de hidrogéis DC-ECM que mimetizam intimamente a MEC natural do tecido cartilaginoso. O protocolo envolve a descelularização do tecido cartilaginoso, o isolamento da MEC resultante e a criação de um hidrogel por meio da reticulação da MEC com um polímero biocompatível. O hidrogel resultante tem mostrado resultados promissores no suporte ao crescimento e diferenciação de condrócitos.

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Protocolo

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital de Tongde da Província de Zhejiang.

1. Preparação do hidrogel DC-ECM

OBS: Neste estudo, a cartilagem foi obtida das articulações do joelho de porcos miniatura Bama com 12 meses de idade, evitando a coleta de tecido ósseo.

1. Pegue a cartilagem coletada, bloqueie e pique em pedaços de 1-2 mm³ com um bisturi.
2. Colocar 20 g da cartilagem picada em um tubo centrífugo de 50 mL e adicionar 20 mL de tampão hipotônico Tris-HCl (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0) para submergir completamente o tecido. Coloque o tubo de centrifugação num congelador de -80 °C durante 3 h e, em seguida, num forno a 37 °C durante 3 h. Repita a etapa de congelamento e aquecimento seis vezes. Nesta etapa, o tampão hipotônico Tris-HCl não necessita de substituição.
3. Agite o tubo centrífugo por 30 s usando um misturador de vórtice a uma velocidade de 1.000 rpm. Coloque uma peneira de aço inoxidável (tamanho dos poros: ~250 μm) em um novo tubo centrífugo de 50 mL.
4. Decantar lentamente a cartilagem decelularizada na peneira de aço inoxidável, lavar o tecido três vezes com PBS estéril e coletar a cartilagem.
5. Adicionar 10 mL de solução de tripsina (tripsina a 0,25% em PBS) e colocar o tubo em um agitador a 37 °C por 24 horas. Durante este período, substitua a tripsina a cada 4 h. Filtre a suspensão usando a peneira de aço inoxidável e preserve o tecido. A tripsina pode ser tratada durante a noite durante um dos processos de digestão, e isso não afetará a digestão final.
6. Lavar o tecido tripsinizado com tampão hipertônico (NaCl 1,5 M, Tris-HCl 50 mM, pH 7,6).
7. Adicionar 10 ml de solução de nuclease (50 U/ml desoxirribonuclease e 1 U/ml ribonuclease em Tris-HCl 10 mM, pH 7,5) e colocar o tubo num agitador a 37 °C durante 4 horas.
8. Remova a solução de nuclease, lave a cartilagem três vezes com PBS estéril e adicione solução hipotônica de Tris-HCl. Coloque o tubo de centrífuga em um agitador e enxágue por 20 h à temperatura ambiente (RT).
9. Remover a solução hipotônica de Tris-HCl, lavar a cartilagem três vezes com PBS estéril e adicionar solução de Triton X-100 a 1% para submergir o tecido por 24 h.
10. Retirar a solução de Triton X-100 e enxaguar completamente a cartilagem decelularizada com água destilada por 3 dias, trocando a água destilada a cada 12 h.
11. Mergulhe a cartilagem em solução de ácido peracético (PAA 0,1% em etanol 4%) por 4 h. Retire a solução de ácido peracético e lave a cartilagem três vezes com água destilada estéril.
12. Coloque a peneira de aço inoxidável (tamanho dos poros: ~250 μm) em um tubo de centrífuga de 50 mL. Decantar lentamente a cartilagem decelularizada na peneira de aço inoxidável e coletar a cartilagem. Testar o grau de decelularização e a retenção da matriz da cartilagem estimando o conteúdo de DNA, colágeno e glicosaminoglicanos (GAG).
13. Coloque a cartilagem decelularizada em uma tigela de moagem, adicione nitrogênio líquido e triture a cartilagem decelularizada para formar um pó. Tomar 2 g do pó de cartilagem decelularizada, adicionar 80 mL de ácido acético 0,5 M e 20 mg de pepsina e digerir por 24 h. Centrifugar a 400 x g por 10 min; descartar o sedimento e coletar a solução sobrenadante (solução DC-ECM).
14. Decantar 1 mL de solução de DC-ECM por poço em placas de 6 poços. Coloque as placas de 6 poços em um liofilizador. Congele a solução DC-ECM. Quando a temperatura no liofilizador cair para -40 °C, ligue a bomba de vácuo e mantenha o grau de vácuo em 10 Pa por 22 horas.
15. Retire a solução liofilizada DC-ECM, coloque-a em tubos de centrífuga e armazene a -20 °C. O período mínimo de armazenamento da solução DC-ECM liofilizada excede meio ano.
16. Adicionar 1 ml de água destilada estéril para dissolver 20 mg de solução liofilizada de DC-ECM no tubo de centrifugação. Agitar por 1 min usando um misturador de vórtices a uma velocidade de 1.000 rpm em TR. Adicionar 1 mg de vitamina B2 (0,1% p/v) à solução DC-ECM, incubar a 37 °C por 60 min e irradiar com luz UV (370 nm, 3,5 mW/cm²) por 3 min para formar um hidrogel (hidrogel DC-ECM).

2. Detecção de cartilagem decelularizada

1. Detecção do conteúdo de DNA da cartilagem decelularizada
   NOTA: Extraia o DNA usando o DNEasy Blood & Tissue Kit.
   1. Primeiro, tome 20 mg de cartilagem DC-ECM em um tubo de centrífuga. Adicionar 180 μL de Buffer GTL e 20 μL de Proteinase K por oscilação de vórtice e incubar a cartilagem a 56 °C durante 4 h até à sua completa dissolução.
   2. Agite o tubo da centrífuga por 15 s usando um misturador de vórtice a uma velocidade de 1.000 rpm no RT. Em seguida, adicione 200 μL de Buffer GL e etanol anidro e misture completamente por vibração de vórtice. Centrifugar as amostras durante 1 min a uma velocidade de 6.000 x g a 4 °C.
   3. Adicionar 500 μL de tampão GW1 à coluna de adsorção e centrifugar as amostras durante 1 min a uma velocidade de 12 000 x g a 4 °C. Adicionar 500 μL de tampão GW2 à coluna de adsorção e centrifugar a 20.000 x g a 4 °C durante 1 min. Finalmente, adicionar 50 μL de água esterilizada à coluna de adsorção e centrifugar por 1 min a uma velocidade de 6.000 x g a 4 °C para coletar a solução de DNA. Determinar o conteúdo de DNA usando um espectrofotômetro.
2. Detecção do conteúdo de colágeno na cartilagem decelularizada
   1. Para detectar o conteúdo de colágeno na cartilagem decelularizada, use hidroxiprolina como marcador de aminoácidos colágeno. Acidificar 5 mg de cartilagem decelularizada com 5 mL de ácido clorídrico 6 M a 100 °C por 20 min e, em seguida, neutralizá-la com 5 mL de uma solução de hidróxido de sódio 6 M.
   2. Calcular o teor de hidroxiprolina medindo a absorbância da amostra a 570 nm com um espectrofotómetro. Obter uma regressão linear concentração-absorção usando a amostra padrão de hidroxiprolina.
3. Detecção de conteúdo de GAG na cartilagem decelularizada
   NOTA: O conteúdo de GAG na cartilagem DC-ECM foi detectado usando um kit de detecção quantitativa colorimétrica de GAG tecidual. Todos os reagentes abaixo estão disponíveis no kit.
   1. Tome 200 mg de pó de cartilagem DC-ECM e adicione 500 μL de Reagente A por oscilação de vórtice. Incubar a amostra a 4 °C durante 16 h e, em seguida, centrifugar a 14.000 x g durante 10 minutos.
   2. Tomar 50 ml de solução de amostra e adicionar 50 μL de solução rica em sal (Reagente B) e 50 μL de solução ácida (Reagente C) por oscilação de vórtices. Incubar a amostra por 10 min.
   3. Adicionar 750 μL de solução corante (Reagente D) por oscilação de vórtice e incubar a amostra por 30 min no escuro. Centrifugar a amostra a 14.000 x g por 10 min e, em seguida, descartar o sobrenadante.
   4. Adicione 1 μL de solução de limpeza (Reagente E) e misture bem. Centrifugar a amostra a 14.000 x g por 10 min e descartar o sobrenadante.
   5. Adicionar 1 μL de solução de dissociação (Reagente F) à amostra e misturar bem. Incubar a amostra durante 30 min em condições de escuridão. Finalmente, determinar o teor de GAG usando um espectrofotômetro a 600 nm.
4. Análise em microscopia eletrônica de varredura (MEV) e microscopia eletrônica de transmissão (MET) da cartilagem decelularizada
   1. Comparar a cartilagem decelularizada e o tecido cartilaginoso normal. Colocar a amostra numa solução de glutaraldeído a 2,5%, incubar a 4 °C durante a noite e, em seguida, lavar com PBS três vezes.
   2. Fixar a amostra em OsO4 a 1% por 1 h e, em seguida, lavar três vezes com PBS.
   3. Desidratar a amostra por imersão sequencial em etanol 50%, 70%, 90% e 100%, bem como acetona 100% por 15 min cada. Colocar a amostra numa solução mista de hexametildisilazano e etanol (1:1) durante 15 minutos, seguida de imersão em hexametildisilazano puro durante 15 minutos.
   4. Coloque a amostra em um secador HCP-2 e, em seguida, seque usando nitrogênio líquido. Em seguida, revestir o espécime totalmente seco com uma fina camada de ouro-paládio usando revestimento de pulverização e imagem usando MEV. O revestimento foi realizado a uma potência de 120 W por 5 min. O experimento foi conduzido nas seguintes condições: tensão de trabalho de 15 kV e grau de vácuo inferior a 5 x 10⁻⁵ Pa.
   5. Para a análise de MET, colocar a amostra em uma mistura de acetona anidra e resina (1:1) por 1 h, seguida de uma mistura de acetona anidra e resina (1:3) por 3 h. Em seguida, coloque a amostra em resina durante a noite.
      1. Colocar a amostra em cápsulas de embutir cheias médias e aquecer a 70 °C durante 9 horas.
      2. Após a incorporação, corte o espécime em fatias finas de 70 nm usando um micrótomo ultrafino e coloque em uma malha de cobre.
      3. Pipetar 20 μL de solução corante de acetato de uranila sobre a malha de cobre e manchar por 15 min na RT. Retire a solução corante lavando suavemente a malha duas vezes com água destilada.
      4. Em seguida, pipetar 20 μL de solução corante de citrato de chumbo sobre a tela de cobre e corar por 15 min em RT. Lave a malha três vezes com água destilada.
      5. Coloque a malha de cobre em uma placa de Petri limpa forrada com papel de filtro. Após a secagem ao ar, fotografar os cortes com MET. A sonda foi aplicada com força descendente de 500 nN, escaneada a uma taxa de 1 Hz, e tinha uma constante elástica (k-valor) de 40 ^Nm-1. O raio da ponta da sonda foi medido em 8 nm.

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Resultados

Para preparar um melhor hidrogel de cartilagem DC-ECM, estudamos e revisamos a literatura anterior e comparamos os vários protocolos de decelularização em termos de razão de decelularização, imunogenicidade e funcionalidade mecânica⁹.

Com base nisso, preparamos o hidrogel de cartilagem DC-ECM e exploramos o efeito de uma matriz extrativa radialmente orientada/biotinta de exossomo de células-tronco mesenquimais no tratamento de defeitos osteocondrais. Os resultad...

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Discussão

Este protocolo fornece uma abordagem sistemática para a preparação de hidrogéis de matriz extracelular de cartilagem decelularizada que mimetizam intimamente a MEC nativa do tecido cartilaginoso. O protocolo envolve uma combinação de ruptura física, química e enzimática para remover material celular, preservando a estrutura e a composição da MEC. As etapas críticas do protocolo incluem ajustar o tempo e os métodos de decelularização e garantir a descelularização completa.

Comp...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M Tris-HCl, pH7.6	Beyotime	ST776-100 mL
1 M Tris-HCl, pH8.0	Beyotime	ST780-500 mL
-80 °C Freezer	Eppendorf	F440340034
Deoxyribonuclease	Aladdin	D128600-80KU
DNEasy Blood &Tissue Kit	Qiagen	No. 69506
GAG colorimetric quantitative detection kit	Shanghai Haling	HL19236.2
HCP-2 dryer	Hitachi	N/A
Nanodrop8000	Thermo Fisher	N/A	Spectrophotometer
PBS (10x)	Gibco	70011044
Ribonuclease	Aladdin	R341325-100 mg
Sigma500	ZIESS	N/A	Scanning electron microscope
Spectra S	Thermo Fisher	N/A	Transmission electron microscope
Stainless steel sieve	SHXB-Z-1	Shanghai Xinbu
Triton X-100	Beyotime	P0096-500 mL
Trypsin	Gibco	15050065
Ultraviolet lamp	Omnicure 2000	N/A
Vitamin B2	Gibco	R4500-5G
Vortex mixer	Shanghai Qiasen	78HW-1