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Neste Artigo

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Resumo

Este protocolo investiga os efeitos protetores da platicodina-D na doença hepática gordurosa não alcoólica em modelo in vitro induzido por ácido palmítico.

Resumo

A ocorrência da doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) vem aumentando de forma alarmante em todo o mundo. Platycodon grandiflorum é amplamente utilizado como uma etnomedicina tradicional para o tratamento de várias doenças e é um alimento funcional típico que pode ser incorporado na dieta diária. Estudos têm sugerido que a platicodina D (PD), um dos principais ingredientes ativos do Platycodon grandiflorum, tem alta biodisponibilidade e atenua significativamente o progresso da DHGNA, mas o mecanismo subjacente a isso ainda não está claro. Este estudo tem como objetivo investigar in vitro o efeito terapêutico da DP contra a DHGNA. Células AML-12 foram pré-tratadas com ácido palmítico (PA) 300 μM por 24 h para modelo de DHGNA in vitro. Em seguida, as células foram tratadas com DP ou não receberam tratamento de DP por 24 horas. Os níveis de espécies reativas de oxigênio (EROs) foram analisados usando a coloração de 2′,7′-dicloro-diidrofluoresceína diacetato (DCFH-DA), e o potencial de membrana mitocondrial foi determinado pelo método de coloração JC-1. Além disso, os níveis de expressão proteica de LC3-II/LC3-I e p62/SQSTM1 nos lisados celulares foram analisados por western blotting. Descobriu-se que a DP diminuiu significativamente os níveis de ROS e potencial de membrana mitocondrial no grupo tratado com AP em comparação com o grupo controle. Enquanto isso, a DP aumentou os níveis de LC3-II/LC3-I e diminuiu os níveis de p62/SQSTM1 no grupo tratado com AP em comparação com o grupo controle. Os resultados indicaram que a DP melhorou a DHGNA in vitro , reduzindo o estresse oxidativo e estimulando a autofagia. Este modelo in vitro é uma ferramenta útil para estudar o papel da DP na DHGNA.

Introdução

Platycodon grandiflorus (PG), que é a raiz seca de Platycodon grandiflorus (Jacq.) A.DC., é usado na medicina tradicional chinesa (MTC). É produzido principalmente nas regiões nordeste, norte, leste, central e sudoeste da China1. Os componentes do PG incluem saponinas triterpenóides, polissacarídeos, flavonoides, polifenóis, polietilenoglicóis, óleos voláteis e minerais2. PG tem uma longa história de ser usado como um alimento e um fitoterápico na Ásia. Tradicionalmente, esta erva foi usada para fazer medicina contra doenças pulmonares. A farmacologia moderna também fornece evidências da eficácia do PG para o tratamento de outras doenças. Estudos têm demonstrado que o PG tem um efeito terapêutico em uma variedade de modelos de lesão hepática induzida por drogas. A suplementação dietética de extratos de PG ou platicodina pode amenizar a obesidade induzida por dieta hiperlipídica e suas doenças metabólicas relacionadas 3,4,5. Polissacarídeos de PG podem ser utilizados no tratamento da lesão hepática aguda causada por LPS/D-GalN em camundongos6. Além disso, as saponinas das raízes do PG melhoram a esteatohepatite não alcoólica induzida por dieta hiperlipética (EHNA)7. Além disso, a platicodina D (PD), um dos mais importantes componentes terapêuticos do PG, pode aumentar a expressão do receptor de lipoproteína de baixa densidade e a captação de lipoproteína de baixa densidade em células de carcinoma hepatocelular humano (HepG2)8. Além disso, a DP também pode induzir apoptose e inibir a adesão, migração e invasãoem células HepG29,10. Assim, neste estudo, células AML-12 de hepatoma de camundongo são utilizadas para a construção de modelos in vitro e para aprofundar o estudo dos efeitos farmacológicos e mecanismos subjacentes da DP nesse modelo.

O termo doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) refere-se a um grupo de doenças hepáticas que inclui esteatose simples, EHNA, cirrose e carcinomahepatocelular11. Embora a patogênese da DHGNA seja incompletamente compreendida, desde a teoria clássica dos "dois acertos" até a atual teoria dos "múltiplos acertos", a resistência à insulina é considerada central na patogênese da DHGNA12,13,14. Estudos têm demonstrado que a resistência à insulina nos hepatócitos poderia levar ao aumento dos ácidos graxos livres, que formam triglicerídeos que se depositam no fígado e causam gordurinhas no fígado15,16. O acúmulo de gordura pode levar à lipotoxicidade, disfunção mitocondrial induzida por estresse oxidativo, estresse do retículo endoplasmático e liberação de citocinas inflamatórias, resultando na patogênese e progressão da DHGNA17,18. Além disso, a autofagia também desempenha um papel na patogênese da DHGNA, pois está envolvida na regulação da sensibilidade celular à insulina, do metabolismo lipídico celular, da lesão dos hepatócitos e da imunidade inata 19,20,21.

Uma variedade de modelos animais e modelos celulares tem sido estabelecida para fornecer uma base para explorar a patogênese e potenciais alvos terapêuticos da DHGNA22,23. No entanto, modelos animais isolados não conseguem mimetizar completamente todos os processos patológicos da DHGNA24. Diferenças individuais entre os animais levam a diferentes características patológicas. O uso de linhagens celulares hepáticas ou hepatócitos primários em estudos in vitro de DHGNA garante a máxima consistência nas condições experimentais. A desregulação do metabolismo lipídico hepático pode levar a níveis mais elevados de acúmulo de gotículas lipídicas de hepatócitos na DHGNA25. Ácidos graxos livres, como ácido oleico e óleo de palma, têm sido utilizados no modelo in vitro para mimetizar a DHGNA causada por uma dieta hiperlipídica26,27. A linhagem celular HepG2 do hepatoblastoma humano é frequentemente utilizada na construção de modelos de DHGNA in vitro, mas, como linhagem celular tumoral, o metabolismo das células HepG2 é significativamente diferente daquele das células hepáticas em condições fisiológicasnormais28. Portanto, o uso de hepatócitos primários ou hepatócitos primários de camundongos para construir o modelo de DHGNA in vitro para triagem de drogas é mais vantajoso do que o uso de linhagens de células tumorais. Comparando o exame sinérgico dos efeitos de drogas e alvos terapêuticos em modelos animais e modelos de hepatócitos in vitro, parece que o uso de hepatócitos de camundongo para construir o modelo in vitro de DHGNA tem melhor potencial de aplicação.

Os ácidos graxos livres que entram no fígado são oxidados para produzir energia ou armazenados como triglicerídeos. Significativamente, os ácidos graxos livres apresentam certa lipotoxicidade e podem induzir disfunção celular e apoptose12. O ácido palmítico (AP) é o ácido graxo saturado mais abundante no plasma humano29. Quando as células do tecido não adiposo são expostas a altas concentrações de AF por longo tempo, isso estimula a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) e causa estresse oxidativo, acúmulo de lipídios e até apoptose30. Portanto, muitos pesquisadores utilizam a AP como indutor para estimular as células hepáticas a produzirem ERO e, assim, construir o modelo de doença hepática gordurosa in vitro e avaliar os efeitos protetores de determinadas substâncias ativas sobre as células31,32,33,34. Este estudo apresenta um protocolo para investigar os efeitos protetores da DP em um modelo celular de DHGNA induzida por AF.

Protocolo

As células AML-12 (uma linhagem normal de hepatócitos de camundongos) são usadas para os estudos baseados em células. As células são obtidas de uma fonte comercial (ver Tabela de Materiais).

1. Pré-tratamento das células AML-12 para modelagem da DHGNA in vitro

  1. Manter as células em meios de cultura celular normais (DMEM mais F12 de Ham's [1:1] contendo 0,005 mg/mL de insulina, 5 ng/mL de selênio, 0,005 mg/mL de transferrina, 40 ng/mL de dexametasona e 10% de soro fetal bovino [FBS], ver Tabela de Materiais) a 37 °C em atmosfera umidificada com 5% de CO2.
  2. Semeando as células em placas de 12 poços (1 mL/poço) com densidade de 2,8 x 105 células/poço.
    OBS: Todas as operações de digestão e troca do meio celular são realizadas em um gabinete de biossegurança para evitar a contaminação das células.
  3. Remover o meio de cultura das células após a incubação noturna (~10 h) e, em seguida, lavar as células duas vezes com 1 mL de meio livre de soro (por poço).
  4. Divida a placa celular de 12 poços em quatro grupos de tratamento diferentes da esquerda para a direita, incluindo (1) o grupo controle, (2) o grupo tratado com DP, (3) o grupo tratado com AP e (4) o grupo tratado com AP + DP.
    NOTA: Três réplicas de cada grupo de tratamento experimental são dispostas de cima para baixo na mesma placa celular de 12 poços.
  5. Adicionar o meio de cultura celular normal (1 mL/poço) ao grupo controle e ao grupo tratado com DP, e adicionar o meio de cultura celular normal (1 mL/poço) suplementado com 300 μM de PA ao grupo tratado com PA e PA + tratado com DP.
  6. Remover o meio de cultura das células após 24 h de incubação e, em seguida, lavar as células com 1 mL de meio livre de soro (por poço) duas vezes.
  7. Adicionar meios de cultura celular normais (1 mL/poço) suplementado com um veículo (dimetil sulfóxido, DMSO, 0,1% v/v) ao grupo controle; adicionar meios de cultura celular normais (1 mL/poço) suplementado com 1 μM PD ao grupo tratado com DP; adicionar meios de cultura de células normais (1 mL/poço) suplementado com 300 μM de PA ao grupo tratado com PA; adicionar meios de cultura celular normais (1 mL/poço) suplementado com 300 μM PA e 1 μM PD ao grupo tratado com PA + PD.
  8. Após a incubação por mais 24 h, investigar os efeitos protetores da DP nas células usando a coloração 2′,7′-dicloro-diidrofluoresceína diacetato (DCFH-DA) (etapa 2), coloração JC-1 (etapa 3) e western blotting (etapa 4).
    NOTA: Todas as operações de incubação são feitas a 37 °C em atmosfera umidificada com 5% de CO2.

2. Medição da variação da produção de ROS

NOTA: Os níveis de ROS intracelular nas células são avaliados com base no ensaio de coloração DCFH-DA.

  1. No final do período de tratamento (passo 1.8), lavar as células com 1 ml de solução salina tamponada com fosfato por poço (1x PBS, pH 7,4) três vezes e, em seguida, corar as células com 100 μL de 10 μM DCFH-DA por poço (ver Tabela de Materiais). Incubar as células no escuro por 30 min.
    NOTA: Se nenhuma fluorescência verde óbvia for observada após 30 min de incubação, o tempo de incubação da sonda e das células pode ser adequadamente aumentado (30-60 min). Se a superexposição do valor de fluorescência verde for observada após 30 min de incubação, o tempo de incubação da sonda e das células pode ser adequadamente reduzido (15-30 min).
  2. Lavar as células com 1x PBS (1 mL/poço) três vezes. Adicione 1 mL de 1x PBS a cada poço.
  3. Coloque a placa de 12 poços no estágio do microscópio (ver Tabela de Materiais) e, em seguida, use uma objetiva de 20x para observar a morfologia das células (aumento: 200x).
  4. Capturar três imagens representativas de fluorescência (aumento: 200x) para cada poço no microscópio de fluorescência usando o canal fluorescente verde com um comprimento de onda de excitação de 480 nm e um comprimento de onda de emissão de 530 nm.
    NOTA: O canal fluorescente verde com um comprimento de onda de excitação de 480 nm e um comprimento de onda de emissão de 530 nm é recomendado para detectar o DCFH-DA. Além disso, a DCFH-DA pode ser detectada com os parâmetros de GFP e FITC no microscópio de fluorescência35,36.
  5. Finalmente, processe as imagens com um software de aquisição de imagens (ver Tabela de Materiais) e, em seguida, use o software ImageJ para calcular a intensidade média de fluorescência de cada grupo ou as razões dos diferentes grupos.
    OBS: Os detalhes técnicos do microscópio de fluorescência e do software Image J utilizados para o trabalho de imagem foram descritos anteriormente37,38.

3. Medição da alteração do potencial de membrana mitocondrial

NOTA: As alterações no potencial de membrana mitocondrial são monitoradas pelo ensaio de coloração JC-1.

  1. No final do período de tratamento (passo 1.8), lavar as células com 1 ml de 1x PBS por poço três vezes e, em seguida, corar as células com 100 μL de 5 μg/ml de solução de trabalho JC-1 (ver Tabela de Materiais) durante 30 minutos a 37 °C no escuro.
    NOTA: Se nenhuma fluorescência verde óbvia for observada após 30 min de incubação, o tempo de incubação da sonda e das células pode ser adequadamente aumentado (30-60 min). Se a superexposição do valor de fluorescência verde for observada após 30 min de incubação, o tempo de incubação da sonda e das células pode ser adequadamente reduzido (15-30 min).
  2. Lavar as células com 1x PBS (1 mL/poço) três vezes. Adicione 1 mL de 1x PBS a cada poço.
  3. Coloque a placa de 12 poços no palco do microscópio e, em seguida, use uma objetiva de 20x para observar a morfologia das células (aumento: 200x).
  4. Capturar três imagens representativas de fluorescência (aumento: 200x) para cada poço no microscópio de fluorescência usando o canal fluorescente verde com comprimentos de onda de excitação e emissão de 485 nm e 535 nm, respectivamente, e o canal fluorescente vermelho com comprimentos de onda de excitação e emissão de 550 nm e 600 nm, respectivamente.
    NOTA: O canal fluorescente verde com um comprimento de onda de excitação de 485 nm e um comprimento de onda de emissão de 535 nm é usado para detectar o monômero JC-1, que é tratado como mitocôndrias despolarizadas 39,40,41, e o canal fluorescente vermelho com um comprimento de onda de excitação de 550 nm e um comprimento de onda de emissão de 600 nm é usado para detectar o dímero JC-1, que é tratada como mitocôndrias polarizadas 39,40,41.
  5. Finalmente, processe as imagens com um software de aquisição de imagens e, em seguida, use o software Image J para calcular a intensidade média de fluorescência de cada grupo ou as razões dos diferentes grupos.
    OBS: Os detalhes técnicos do microscópio de fluorescência e do software Image J utilizados para o trabalho de imagem foram descritos anteriormente37,38.

4. Mensuração dos níveis de expressão proteica de LC3-II/LC3-I e p62/SQSTM1

  1. Após o tratamento (passo 1.8), lavar as células três vezes com 1x PBS (1 mL/poço) pré-resfriado a 4 °C.
  2. Adicionar o tampão de lise RIPA (100 μL/poço) suplementado com protease e um cocktail inibidor de fosfatase (1x) (ver Tabela de Materiais) à placa de 12 poços e lisar no gelo durante 5 minutos.
  3. Recolher o lisado celular em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml e centrifugar a 12.000 x g durante 20 minutos a 4 °C. Determinar a concentração proteica dos sobrenadantes pelo método BCA seguindo os procedimentos padrão42.
  4. Adicione o buffer de carregamento de amostra SDS-PAGE (5x, consulte Tabela de Materiais) aos sobrenadantes do lisado celular (razão de volume = 1:4).
  5. Misture por vórtice (em alta velocidade por ~15 s) e aqueça as amostras misturadas a 100 °C por 5 min para desnaturar a proteína.
  6. Coloque o gel SDS-PAGE de 12% bem preparado no tanque de eletroforese e, em seguida, adicione o tampão de amostra ascendente SDS (1x) diluído com água ultrapura à posição limite de altura.
    NOTA: O gel SDS-PAGE é preparado utilizando um kit comercial (ver Tabela de Materiais) de acordo com as instruções do fabricante.
  7. Adicionar o marcador proteico (5 μL/poço) e as amostras (20 μg/poço) em diferentes poços do gel SDS-PAGE.
  8. Ajuste o modo de tensão estável em 100 V e execute a eletroforese por 80 min.
  9. Após a eletroforese em SDS-PAGE, realizar a eletrotransferência das proteínas para uma membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) (0,45 μM, ver Tabela de Materiais), seguindo relatos publicados anteriormente43,44.
  10. Após a eletrotransferência das proteínas, lavar a membrana de PVDF com 10 mL de TBST (1x TBS, 0,1% Tween 20) duas vezes (5 min/tempo) em um agitador à temperatura ambiente.
  11. Bloquear a membrana de PVDF com 5 mL de albumina de soro bovino (BSA, 5%) em um agitador à temperatura ambiente por 1 h.
  12. Lavar a membrana de PVDF com 10 mL de TBST três vezes (10 min/tempo). Em seguida, incubar a membrana de PVDF em 5 mL dos anticorpos primários específicos diluídos em tampão de bloqueio para LC3 (mAb de camundongo, 1:2.000), p62/SQSTM1 (doravante referido como p62, mAb de camundongo, 1:2.000) e β-actina (mAb de camundongo, 1:2.000) (ver Tabela de Materiais) durante a noite a 4 °C.
  13. Lavar a membrana de PVDF com 10 mL de TBST três vezes (10 min/tempo) à temperatura ambiente. Em seguida, incubar a membrana de PVDF com o anticorpo secundário IgG (HRP) anti-camundongo de coelho diluído em tampão de bloqueio (1:10.000) (ver Tabela de Materiais) à temperatura ambiente e protegido da luz por 2 h.
  14. Lavar a membrana de PVDF com 10 mL de TBST três vezes (10 min/tempo) à temperatura ambiente. Em seguida, coloque a membrana de PVDF sobre o filme plástico, adicione uma quantidade apropriada de solução de trabalho ECL (200 μL/membrana) (ver Tabela de Materiais) e incube por 2 min.
  15. Após a incubação, remova a solução de trabalho ECL e exponha a membrana de PVDF no sistema de imagem para o desenvolvimento da imagem. Finalmente, use o software Image J para analisar os valores de cinza de cada banda.
    NOTA: Os detalhes técnicos dos softwares western blotting e Image J utilizados para o trabalho de imagem foram descritos anteriormente45,46.

5. Análise estatística

  1. Apresentar os dados dos experimentos como média ± desvio padrão (DP).
  2. Realizar a análise de significância com a ferramenta estatística descrita anteriormente47.
  3. Calcular as diferenças estatísticas entre os dois grupos usando um teste t. Um valor de P menor que 0,05 é considerado estatisticamente significativo: *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,005.

Resultados

ERO intracelular nas células
Células AML-12 foram induzidas com 300 μM de PA por 24 h, e um modelo de célula NAFLD foi estabelecido. Posteriormente, as células foram tratadas com DP por 24 horas. As células foram marcadas com uma sonda fluorescente DCFH-DA, e a produção de ROS foi observada em microscópio de fluorescência. Os resultados da coloração DCFH-DA das ERO intracelulares nas células são mostrados na Figura 1. Os resultados mostraram que a DP pode re...

Discussão

Estudos têm destacado o fato de que a DHGNA é uma síndrome clinicopatológica, que varia de esteatose hepática a EHNA, que pode evoluir para cirrose e câncer hepático51. Uma dieta rica em gordura e um estilo de vida inativo são fatores de risco típicos para DHGNA. Tanto terapias não medicamentosas quanto terapias medicamentosas para o tratamento da DHGNA têm sido pesquisadas51,52,53. Entretanto,...

Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

Este trabalho é apoiado por subsídios da Comissão de Ciência e Tecnologia de Chongqing (cstc2020jxjl-jbky10002, jbky20200026, cstc2021jscx-dxwtBX0013 e jbky20210029) e da China Postdoctoral Science Foundation (No. 2021MD703919).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
5% BSA Blocking BufferSolarbio, Beijing, ChinaSW3015
AML12 (alpha mouse liver 12) cell lineProcell Life Science&Technology Co., Ltd, ChinaAML12
Beyo ECL PlusBeyotime, Shanghai, ChinaP0018S
Bio-safety cabinetEsco Micro Pte Ltd, SingaporeAC2-5S1 A2 
cellSensOlympus, Tokyo, Japan1.8
Culture CO2 IncubatorEsco Micro Pte Ltd, SingaporeCCL-170B-8
DexamethasoneBeyotime, Shanghai, ChinaST125
Dimethyl sulfoxideSolarbio, Beijing, ChinaD8371
DMEM/F12Hyclone, Logan, UT, USASH30023.01
Foetal Bovine SerumHyclone, Tauranga, New ZealandSH30406.05
Graphpad softwareGraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA8.0
HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L)ABclonal, Wuhan, ChinaAS003
Hydrophobic PVDF Transfer MembraneMerck, Darmstadt, GermanyIPFL00010
Insulin, Transferrin, Selenium Solution, 100×Beyotime, Shanghai, ChinaC0341
MAP LC3β AntibodySanta Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., LtdSC-376404
Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit with JC-1Solarbio, Beijing, ChinaM8650
Olympus Inverted Microscope IX53Olympus, Tokyo, JapanIX53
Palmitic AcidSigma, GermanyP0500
Penicillin-Streptomycin Solution (100x)Hyclone, Logan, UT, USASV30010
Phenylmethanesulfonyl fluorideBeyotime, Shanghai, ChinaST506
Phosphate Buffered SolutionHyclone, Logan, UT, USABL302A
Platycodin DChengdu Must Bio-Technology Co., Ltd, ChinaCSA: 58479-68-8
Protease inhibitor cocktail for general use, 100xBeyotime, Shanghai, ChinaP1005
Protein MarkerSolarbio, Beijing, ChinaPR1910
Reactive Oxygen Species Assay KitSolarbio, Beijing, ChinaCA1410
RIPA Lysis BufferBeyotime, Shanghai, ChinaP0013E
SDS-PAGE Gel Quick Preparation KitBeyotime, Shanghai, ChinaP0012AC
SDS-PAGE Sample Loading Buffer, 5xBeyotime, Shanghai, ChinaP0015
Sigma CentrifugeSigma, Germany3K15
SQSTM1/p62 AntibodySanta Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., LtdSC-28359
Tecan Infinite 200 PRO  Tecan Austria GmbH, Austria1510002987
WB Transfer Buffer,10xSolarbio, Beijing, ChinaD1060
β-Actin Mouse mAbABclonal, Wuhan, ChinaAC004

Referências

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