Isolamento de Células Epiteliais Pigmentares da Retina de Olhos de Cobaia

Resumo

Descrevemos um método simples e eficiente para isolar células do epitélio pigmentado da retina (EPR) de olhos de cobaias pigmentadas jovens. Este procedimento permite o acompanhamento de estudos de biologia molecular do EPR isolado, incluindo análises de expressão gênica.

Resumo

Este protocolo descreve o isolamento de células do epitélio pigmentado da retina (EPR) dos olhos de cobaias pigmentadas jovens para potencial aplicação em estudos de biologia molecular, incluindo análises de expressão gênica. No contexto da regulação do crescimento ocular e miopia, o EPR provavelmente desempenha um papel como um relé celular para sinais modulatórios de crescimento, uma vez que está localizado entre a retina e as duas paredes do olho, como a coroide e a esclera. Embora protocolos para isolar o PSE tenham sido desenvolvidos tanto para pintos quanto para camundongos, esses protocolos provaram não ser diretamente traduzíveis para a cobaia, que se tornou um modelo importante e amplamente utilizado de miopia em mamíferos. Neste estudo, ferramentas de biologia molecular foram usadas para examinar a expressão de genes específicos para confirmar que as amostras estavam livres de contaminação dos tecidos adjacentes. O valor desse protocolo já foi demonstrado em um estudo de RNA-Seq de PSE de cobaias pigmentadas jovens expostas ao desfoco óptico indutor de miopia. Além da regulação do crescimento ocular, esse protocolo tem outras aplicações potenciais em estudos de doenças retinianas, incluindo maculopatia míope, uma das principais causas de cegueira em miopes, na qual o EPR tem sido implicado. A principal vantagem desta técnica é que é relativamente simples e, uma vez aperfeiçoada, produz amostras de EPR de alta qualidade adequadas para estudos de biologia molecular, incluindo análise de RNA.

Introdução

O EPR compreende uma única monocamada de células pigmentadas localizada entre a retina neural e a coroide vascular, e o EPR tem papéis bem reconhecidos no desenvolvimento e manutenção da função normal da retina, incluindo a fototransdução ^1,2. Mais recentemente, foi atribuído à PSE um papel fundamental adicional na regulação do crescimento ocular³ e, portanto, no desenvolvimento da miopia⁴. Essa atribuição baseia-se na localização crítica da PSE, interposta entre a retina e a coroide, e na aceitação agora ampla de que o crescimento ocular e, portanto, os erros refrativos são regulados^localmente5. Acredita-se que a PSE desempenhe um papel fundamental como relé de sinal, ligando a retina, fonte presumida de sinais modulatórios de crescimento, à coroide e esclera, os dois alvos dos sinais retransmitidos ^6,7,8.

O aumento do comprimento axial que caracteriza a maioria das miopias não pode ser considerado benigno, com alterações fisiopatológicas envolvendo retina, coroide e/ou esclera representando consequências inevitáveis e agora bem reconhecidas do^{alongamento ocular excessivo7,9}. Nesse contexto, o EPR talvez seja o mais vulnerável, pois, sendo um tecido não mitótico, só é capaz de acomodar a câmara vítrea em expansão pelo estiramento e afinamento de células individuais. Embora seu papel em patologias relacionadas à miopia, como a degeneração macular míope, ainda não seja totalmente compreendido, o EPR tem sido implicado na patogênese de uma série de outras doenças retinianas, incluindo a atrofia geográfica, uma das principais causas de cegueira, que está associada a anormalidades documentadas na retina, PSE e coroide10,11^{, 12º}.

O isolamento bem-sucedido de células de EPR, livres de contaminação de tecidos oculares adjacentes, potencialmente abre muitas oportunidades de pesquisa para obter novos insights sobre os mecanismos subjacentes a uma variedade de doenças oculares/retinianas. Entretanto, o isolamento da PSE tem se mostrado desafiador, com muitos estudos publicados fazendo uso da combinação retina/PSE ou PSE/coroide por esse motivo13,14,15. Estudos envolvendo o sucesso do isolamento do EPR de qualidade adequada para estudos de biologia molecular têm sido limitados a olhos de pintinhos e camundongos^16,17. Por exemplo, o método simultâneo de isolamento de PSE e estabilização de RNA (SRIRS) descrito por Wang et ^al.18. Isolar células RPE em camundongos não parece funcionar bem em olhos de cobaias. O protocolo aqui descrito representa um refinamento de uma abordagem que foi inicialmente prototipada com olhos de musaranho por um dos autores (M.F.) e provou produzir amostras de EPR de alta qualidade, apropriadas para análises de RNA e outras análises de biologia molecular, a partir de olhos de cobaias pigmentadas^jovens19.

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Protocolo

Todos os cuidados e tratamentos com animais utilizados neste estudo estão em conformidade com a Declaração ARVO para o Uso de Animais em Pesquisa Oftalmológica e da Visão. Os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Califórnia, Berkeley.

1. Enucleação do olho da cobaia

1. Eutanásia de uma cobaia com uma injeção intracardíaca de pentobarbital sódico administrada sob anestesia (isoflurano a 5% em oxigênio).
2. Enuclear os olhos com o auxílio de pinça e tesoura e transferi-los imediatamente para uma placa de Petri de 10 cm com solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) para lavagem. Transfira os olhos para uma solução de PBS fresca.
   NOTA: Recomenda-se uma placa de 6 poços contendo 4 mL de solução por poço.

2. Isolamento da taça ocular posterior e do complexo PSE/coroide/esclera

1. Com o auxílio de um microscópio dissecante, utilizar uma agulha 18G para fazer uma pequena incisão inicial na esclera, aproximadamente 1,0 mm atrás do limite limbal (isto é, entre a córnea e a esclera) (Figura 1A); Em seguida, use tesoura para remover o segmento anterior, incluindo córnea, íris, corpo ciliar e cristalino.
2. Em seguida, trabalhando com a taça do segmento ocular posterior restante, desprenda a retina do complexo PSE/coroide/esclera; usar pinça para primeiro agarrar e, em seguida, puxar suavemente a zônula de Zinn e, em seguida, descascar progressivamente a retina sem fragmentação (Figura 1B).
   NOTA: A retina não deve ser captada diretamente para evitar fragmentação retiniana e isolamento incompleto do tecido retiniano. O uso de um microscópio é essencial para esta etapa de dissecção.

3. Isolamento da PSE da coroide

1. Após a remoção completa da retina, mergulhe o copo ocular posterior restante, que inclui o EPR, a coroide e a esclera, no reagente de armazenamento de tecido por 5 min (consulte a Tabela de Materiais).
   OBS: Utilizar uma placa de 12 poços com poços identificados, cada um preenchido com 2 mL do reagente de armazenamento de tecido.
2. Transfira o copo para outro poço preenchido com 4 mL de PBS por 10 s antes de movê-lo para um terceiro poço preenchido com 2 mL de PBS.
3. Anexe uma agulha de 30 G a uma seringa de 1 mL preenchida com PBS para a etapa final de isolamento do EPR. Empurre suavemente a seringa para criar uma corrente de jato de PBS; primeiro, direcione essa corrente para o EPR para fazer um pequeno rasgo ou furo nele e, em seguida, direcione o fluxo de PBS para a abertura criada para separar o EPR como uma folha da coroide (Figura 1C).
   Observação : O descolamento do RPE como uma folha produz a maior amostra de RPE. Novamente, o uso de um microscópio é essencial para essa etapa.
4. Após o descolamento do EPR da coroide (Figura 1D), colete o tecido do EPR em uma seringa de 1 mL sem agulha e, em seguida, transfira a amostra coletada para um tubo de 1,5 mL.
5. Centrifugar o tubo de 1,5 mL com o EPR coletado a 8.000 × g por 1 min para obter um pellet de EPR (Figura 2A).
6. Eliminar a solução PBS e substituí-la por 350 ml de tampão de lise, conforme incluído nos kits de isolamento de ARN (ver Tabela de Materiais); pipeta 20x para misturar e, assim, preservar a qualidade da amostra. Para armazenamento e conservação a longo prazo, transfira as amostras para um congelador de -80 °C.
   NOTA: O tampão de lise é um componente proprietário do kit de isolamento de RNA para lise de células e tecidos antes do isolamento de RNA e isolamento simultâneo de RNA/DNA/proteína. Para inativar as RNAses no lisado, certifique-se de adicionar β-mercaptoetanol ao tampão de lise (10 μL de β-mercaptoetanol por 1 mL de tampão de lise).

4. Extração de RPE-RNA

1. Use um kit de isolamento de RNA (consulte a Tabela de Materiais) para isolar e coletar o RNA das amostras de EPR seguindo as instruções fornecidas pelo fabricante. Avaliar a qualidade da amostra por eletroforese.
   NOTA: O protocolo descrito produziu um produto de boa qualidade (ou seja, número de integridade de RNA [RIN] acima de 8,0).

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Resultados

A análise das amostras de EPR coletadas pelo protocolo acima mostrou RNA bem preservado (RIN >8,0, Figura 2B), com 240,2 ng ± 35,1 ng por olho (n = 8, NanoDrop, Figura 2B). Para avaliar melhor a qualidade das amostras isoladas de EPR, particularmente a ausência de contaminantes coroidais e esclerais, examinamos a expressão de genes representativos para cada um destes últimos tecidos nas amostras de^EPR19. As amostras de EPR demonstra...

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Discussão

Neste artigo, descrevemos um método de isolamento do EPR, apropriado para análises da expressão do gene do EPR, dos olhos de cobaias jovens e pigmentadas. O mérito deste protocolo é que ele produz amostras de EPR de alta qualidade que são relativamente livres de contaminação, com RNA adequadamente preservado para análises específicas de RNA e, ainda assim, é relativamente simples e eficiente. Enquanto no exemplo fornecido aqui, as amostras de EPR foram coletadas dos olhos de uma cobaia jovem (2 semanas de idad...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Syringe with Slip Tip	Bd Vacutainer Labware Medical	22-253-260
2-Mercaptoethanol	Invitrogen	21985-023
6 Well Tissue Culture Plate with Lid, Flat Bottom, Sterile	pectrum Chemical Mfg. Corp	970-95008
12 Well Tissue Culture Plate with Lid, Individual, Sterile	Thomas Scientific LLC	1198D72
Agilent 2100 Bioanalyzer			automated electrophoresis to check RNA quality
Balanced Salt Solutions	Gibco	10010031
Bonn Micro Forceps, Straight Smooth, 0.3 mm Tip, 7 cm	Fine Science Tools, Inc.	11083-07
Dumont forceps no. 5	ROBOZ	RS-5045
Hypodermic disposable needles	Exelint International, Co.	26419
Hypodermic disposable needles	Exelint International, Co.	26437
MiniSpin Microcentrifuges	Eppendorf	540108	Max. Speed: 8,000 g
RNAlater Stabilization Solution	Invitrogen	AM7020	tissue storage reagent
RNeasy Mini kits	Qiagen	74104	RNA isolation kit
Student Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools, Inc.	91500-09