Geração e Cultivo de Organoides Derivados de Pacientes com Câncer de Ovário Seroso de Alto Grau

Resumo

Os organoides derivados do paciente (DOP) são uma cultura tridimensional (3D) que pode imitar o ambiente tumoral in vitro. No câncer de ovário seroso de alto grau, as DOPs representam um modelo para estudar novos biomarcadores e terapias.

Resumo

Os organoides são modelos de tumores dinâmicos 3D que podem ser cultivados com sucesso a partir de tecido tumoral de ovário derivado do paciente, ascite ou líquido pleural e ajudam na descoberta de novas terapêuticas e biomarcadores preditivos para o câncer de ovário. Esses modelos recapitulam a heterogeneidade clonal, o microambiente tumoral e as interações célula-célula e célula-matriz. Além disso, eles demonstraram corresponder ao tumor primário morfologicamente, citologicamente, imuno-histoquimicamente e geneticamente. Assim, os organoides facilitam a pesquisa sobre as células tumorais e o microambiente tumoral e são superiores às linhagens celulares. O presente protocolo descreve métodos distintos para gerar organoides de câncer de ovário derivados de pacientes a partir de tumores, ascite e amostras de líquido pleural com uma taxa de sucesso superior a 97%. As amostras do paciente são separadas em suspensões celulares por digestão mecânica e enzimática. As células são então banhadas utilizando um extrato de membrana basal (BME) e são suportadas com meios de crescimento otimizados contendo suplementos específicos para a cultura de câncer de ovário seroso de alto grau (HGSOC). Depois de formar organoides iniciais, as DOP podem sustentar a cultura a longo prazo, incluindo a passagem para expansão para experimentos subsequentes.

Introdução

Em 2021, aproximadamente 21.410 mulheres nos Estados Unidos foram recém-diagnosticadas com câncer de ovário epitelial, e 12.940 mulheres morreram dessa doença¹. Embora avanços suficientes tenham sido feitos na cirurgia e na quimioterapia, mais de 70% dos pacientes com doença avançada desenvolvem resistência quimioterápica e morrem dentro de 5 anos após o diagnóstico ^2,3. Assim, novas estratégias para tratar esta doença mortal e modelos representativos e confiáveis para a pesquisa pré-clínica são urgentemente necessários.

Linhagens celulares de câncer e xenoenxertos derivados de pacientes (PDX) criados a partir de tumores primários de ovário são os principais instrumentos utilizados na pesquisa do câncer de ovário. Uma grande vantagem das linhagens celulares de câncer é a sua rápida expansão. No entanto, sua cultura contínua resulta em alterações fenotípicas e genotípicas que fazem com que as linhagens celulares cancerígenas se desviem da amostra original de tumor primário de câncer. Devido às diferenças existentes entre a linhagem celular cancerígena e o tumor primário, os ensaios de drogas que têm efeitos positivos em linhagens celulares não conseguem ter esses mesmos efeitos em ensaios clínicos². Para superar essas limitações, os modelos PDX são usados. Esses modelos são criados pela implantação de tecido fresco de câncer de ovário em camundongos imunodeficientes. Como são modelos in vivo , eles se assemelham com mais precisão às características biológicas humanas e, por sua vez, são mais preditivos dos resultados das drogas. No entanto, esses modelos também apresentam limitações significativas, incluindo o custo, o tempo e os recursos necessários para gerá-los⁴.

As DOP oferecem um modelo alternativo para pesquisa pré-clínica que supera as limitações de ambas as linhagens celulares de câncer e modelos PDX. As DOP recapitulam o tumor e o microambiente tumoral de um paciente e, assim, fornecem um modelo tratável in vitro ideal para a pesquisa pré-clínica ^2,3,5. Esses modelos 3D têm capacidades de auto-organização que modelam o tumor primário, que é uma característica que suas contrapartes de linhagem celular bidimensional (2D) não possuem. Além disso, esses modelos demonstraram representar geneticamente e funcionalmente seus tumores pais e, portanto, são modelos confiáveis para o estudo de novas terapêuticas e processos biológicos. Em suma, oferecem capacidades de expansão e armazenamento a longo prazo semelhantes às linhagens celulares, mas também abrangem o microambiente e as interações célula-célula inerentes aos modelos de camundongos ^4,6.

O presente protocolo descreve a criação de DOP a partir de tumores derivados de pacientes, ascite e amostras de líquido pleural com uma taxa de sucesso superior a 97%. As culturas de DOP podem então ser expandidas por várias gerações e usadas para testar a sensibilidade à terapia medicamentosa e biomarcadores preditivos. Este método representa uma técnica que poderia ser utilizada para personalizar tratamentos com base nas respostas terapêuticas das DOP.

Protocolo

Todos os espécimes de tecido humano coletados para pesquisa foram obtidos de acordo com o protocolo aprovado pelo Institutional Review Board (IRB). Os protocolos descritos abaixo foram realizados em um ambiente estéril de cultura de tecidos humanos. O termo de consentimento livre e esclarecido foi obtido de seres humanos. As pacientes elegíveis tinham que ter um diagnóstico ou diagnóstico presumido de câncer de ovário, estar dispostas e capazes de assinar o consentimento informado e ter pelo menos 18 anos de idade. Tecido tumoral (tumor primário maligno ou sítios metastáticos), ascite e líquido pleural foram obtidos de pacientes consensuais no momento do procedimento. Esses espécimes foram imediatamente transportados para o laboratório e processados para geração de organoides usando os métodos descritos abaixo.

1. Preparação para a mídia

1. Preparação completa do meio organoide
   1. Preparar o meio condicionado R-spondin 1/Noggin seguindo um relatório publicado anteriormente⁷.
      NOTA: O meio condicionado R-spondin-1/Noggin é uma alternativa mais acessível às proteínas recombinantes comercialmente disponíveis. As células HEK293T secretando de forma estável R-spondin-1 e Noggin via transdução mediada por lentivírus foram um presente generoso de Ron Bose, da Escola de Medicina da Universidade de Washington, em St. Louis, e de Anil Rustgi, do Centro Médico Irving da Universidade Presbiteriana de Nova York/Columbia ^8,9,10. O meio condicionado comercial pode ser usado como substituto (ver Tabela de Materiais).
2. Para fazer o meio organoide completo, combine 10% de R-espondina 1/Noggin em meio condicionado, 50 ng/mL de EGF, 10 ng/mL de FGF-10, 10 ng/mL de FGF2, 1x B27, 10 mmol/L de nicotinamida, 1,25 mmol/L de N-acetilcisteína, 1 μmol/L de prostaglandina E2, 10 μmol/L SB202190, 500 nmol/L A83-01 e inibidor de ROCK de 10 μM (ver Tabela de Materiais).
   NOTA: O meio pode ser conservado a 4 °C durante um período máximo de 3 meses. Esse meio foi adaptado de Hill et ^al.11. As concentrações e ingredientes do meio são os mesmos, com a adição de um inibidor de ROCK.
3. Prepare o meio de base organoide combinando 500 mL de uma formulação avançada de DMEM/F12 com 1% de penicilina-estreptomicina, 1x dipeptídeo, L-alanil-L-glutamina e 1x HEPES (10 mM) (ver Tabela de Materiais).

2. Colheita de organoides da ascite e do líquido pleural

NOTA: A ascite e o líquido pleural devem ser processados o mais rapidamente possível para obter o melhor rendimento dos organoides. Descongele previamente o tampão de reação BME, DNase I e DNase I (ver Tabela de Materiais) colocando-o no gelo até que o conteúdo seja liquefeito.

1. Obter ascite e líquido pleural de pacientes consensuais no momento de cirurgias ou procedimentos de cuidados padrão e transportá-los à temperatura ambiente em um recipiente de viagem para o laboratório.
   NOTA: Toda ascite ou processamento de líquido pleural deve ser realizado em um ambiente estéril.
2. Transfira 50 mL de ascite ou líquido pleural para 50 mL de tubos cônicos (o número de tubos depende do volume de ascite obtido). Centrífuga a 1,650 x g durante 5 min a 4 °C. Após a centrifugação, use uma pipeta Pasteur de vidro para aspirar cuidadosamente o sobrenadante.
3. Continue adicionando 50 mL de ascite ou líquido pleural ao pellet previamente centrifugado e centrifugar novamente a 1.650 x g por 5 min a 4 °C. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante usando uma pipeta Pasteur de vidro. Repita esta etapa até que toda a ascite ou líquido pleural tenha sido processada.
4. Preparar uma solução de DNase I de 100 μg/ml combinando 1.000 μL de água isenta de nuclease, 100 μL de tampão de reação DNase I e 10 μL de DNase I.
   NOTA: O tratamento com DNase I aplicado é suficiente para fazer uma suspensão unicelular, independentemente da presença de agregados celulares em algumas amostras de pacientes¹².
5. Ressuspender cada pellet celular em 1 mL de 100 μg/mL de solução de DNase I. Adicione suavemente a solução de DNase I gota a gota e deixe o tubo incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente.
   NOTA: Adicionar um mínimo de 1 ml de solução de DNase I. Se 1 mL não for suficiente para perturbar o pellet, adicione mais 1 mL.
6. Após a incubação, adicionar 25 mL de meio de base organoide (etapa 1.3) às células e inverter suavemente para misturar. Em seguida, centrifugar a 1.650 x g durante 5 min a 4 °C. Após a centrifugação, aspirar cuidadosamente o sobrenadante utilizando uma pipeta Pasteur de vidro.
7. Ressuspeite os pellets de células recém-formados em 5 mL pré-aquecidos de 1x tampão de lise de glóbulos vermelhos (RBC) (consulte Tabela de Materiais). Ajuste o vórtice para 458 x g e vortex as soluções em cada tubo cônico. Uma vez que as soluções sejam homogêneas, use uma pipeta sorológica para combinar o conteúdo de todos os tubos cônicos em um único tubo cônico de 50 mL.
8. Incubar o tubo cónico que contém a solução vórtice à temperatura ambiente durante 5 min. Uma vez concluída a incubação, centrifugar a 1.650 x g durante 5 min a 4 °C.
   NOTA: Examine o pellet. Um pellet rosa/vermelho indica a presença de hemácias, o que exigiria que a etapa do tampão de lise dos eritrócitos fosse repetida até que a pelota não estivesse mais vermelha.
9. Após a centrifugação, aspirar cuidadosamente o sobrenadante utilizando uma pipeta Pasteur de vidro. Em seguida, lavar o pellet com 10 mL de PBS, vórtice da solução a 458 x g e centrifugar a 1.650 x g por 5 min a 4 °C.
10. Se um pellet de células grandes for formado, aspirar o PBS usando uma pipeta Pasteur de vidro e adicionar 1 mL de meio de base organoide (passo 1.3) em cima do pellet. Vórtice da solução a 458 x g e transfira 300-400 μL para um tubo de microcentrífuga. Centrifugar o tubo de microcentrífuga a 1,650 x g durante 5 min a 4 °C.
    NOTA: A porção do pellet celular não colocada no tubo de microcentrífuga pode ser congelada para uso futuro (500 μL de células a 1 mL de 10% de DMSO na FBS). O pellet de células congeladas pode ser armazenado por semanas a -80 °C e por anos se colocado em nitrogênio líquido¹³.
11. Aspirar cuidadosamente o meio de base organoide (passo 1.3) utilizando uma pipeta Pasteur de vidro e ressuspender em BME (ver Tabela de Materiais) utilizando pontas frias.
    NOTA: A quantidade de BME é baseada no tamanho do pellet. Recomenda-se o uso de meio de base organoide a 25% (etapa 1.3) com células ressuspensas a 75% de EMB.
12. Alíquotas de 40 μL da solução de células ressuspensas sobre uma placa de 6 poços. Placa até cinco alíquotas por poço (Figura 1).
13. Colocar imediatamente a placa numa incubadora de 37 °C durante 20 minutos para permitir que a BME se solidifique. Após a incubação, adicione suavemente 2 mL de meio organoide completo (etapa 1.2) em cada poço.

Figura 1: Revestimento de organoides de câncer de ovário derivados de pacientes. Imagem representativa do revestimento organoide. As alíquotas da mistura organoide são cuidadosamente chapeadas, garantindo que nenhuma bolha seja formada. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Colheita de organoides do tecido

NOTA: O tecido deve ser processado o mais rapidamente possível para obter o melhor rendimento de organoides.

1. Coletar e transportar o tumor no gelo em um recipiente de viagem contendo PBS.
2. Colocar a amostra em um prato de cultura de tecidos de 10 cm (Figura 2). Usando um bisturi descartável, pice o tecido. Em seguida, usando a extremidade opaca de uma seringa descartável, esmague o tecido até que uma mistura homogênea tenha sido criada.
3. Usando fórceps, coloque a mistura de tecido homogênea em um tubo de dissociação. Para cada 1-2 ml de tecido homogeneizado, adicionar 7-8 ml de solução de colagenase tipo II de 1 mg/ml (ver Tabela de Materiais) em meio de base organoide (passo 1.3) e 1 ml de solução de DNase I. Vórtice a solução a 458 x g.
   NOTA: A quantidade de tecido determinará a quantidade de solução de colagenase e o número de tubos necessários.
4. Use a máquina de dissociação (ver Tabela de Materiais) para liquefazer o tecido enquanto ele estiver na solução de colagenase. Execute o programa 37C_h_TDK3 (1 h) até que seja uma suspensão de célula única.
   NOTA: O programa precisará ser executado novamente se a mistura resultante não for homogênea (ou seja, se os pedaços de tecido ainda estiverem presentes na mistura). Se o tecido for digerido mas a solução for viscosa, diluir utilizando um meio de base organoide (passo 1.3).
5. Transfira a mistura homogeneizada para um novo tubo cônico de 50 mL e adicione 20-40 mL de meio de base organoide (etapa 1.3). Em seguida, filtre a solução através de um filtro de células de 100 μm em um tubo cônico de 50 mL recém-marcado.
6. Centrifugar a mistura filtrada a 1,650 x g durante 5 min a 4 °C. Em seguida, aspirar cuidadosamente o sobrenadante usando uma pipeta Pasteur de vidro.
7. Preparar uma solução de DNase I de 100 μg/ml combinando 1.000 μL de água isenta de nuclease, 100 μL de tampão de reação DNase I e 10 μL de DNase I.
   NOTA: O tratamento com DNase I aplicado é suficiente para fazer uma suspensão unicelular, independentemente da presença de agregados celulares em algumas amostras de pacientes¹².
8. Ressuspender as células em 1 ml de 100 ug/ml de solução de DNase I. Adicione suavemente a solução de DNase I gota a gota e deixe o tubo incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente.
9. Após a incubação, adicionar 25 mL de meio de base organoide (etapa 1.3) às células e inverter suavemente para misturar. Em seguida, centrifugar a 1.650 x g durante 5 min a 4 °C. Após a centrifugação, aspirar cuidadosamente o sobrenadante utilizando uma pipeta Pasteur de vidro.
10. Ressuspeite o pellet celular recém-formado em 5 mL de tampão de lise pré-aquecido 1x hemácias. Vórtice as soluções em cada tubo cônico a 458 x g.
11. Incubar o tubo cônico contendo o pellet celular ressuspenso no tampão de lise RBC por 5 min. Uma vez concluída a incubação, centrifugar a 1.650 x g durante 5 min a 4 °C.
    NOTA: Examine o pellet. Um pellet rosa/vermelho indica a presença de hemácias, o que exigiria que a etapa do tampão de lise dos eritrócitos fosse repetida até que a pelota parecesse branca.
12. Após a centrifugação, aspirar cuidadosamente o sobrenadante utilizando uma pipeta Pasteur de vidro. Em seguida, lavar o pellet com 10 mL de PBS, vórtice da solução a 458 x g e centrifugar a 1.650 x g por 5 min a 4 °C.
13. Se um pellet de células grandes for formado, aspirar o PBS usando uma pipeta Pasteur de vidro e adicionar 1 mL de meio de base organoide (passo 1.3) em cima do pellet. Vórtice da solução a 458 x g e transfira 300-400 μL para um tubo de microcentrífuga. Centrífuga a 1,650 x g durante 5 min a 4 °C.
    NOTA: A porção do pellet celular não colocada no tubo de microcentrífuga pode ser congelada para uso futuro (500 μL de células a 1 mL de 10% de DMSO na FBS) (etapa 5.1). O pellet de células congeladas pode ser armazenado por semanas a -80 °C e por anos se colocado em nitrogênio líquido¹³.
14. Aspirar cuidadosamente o meio de base organoide utilizando uma pipeta Pasteur de vidro e ressuspender em BME utilizando pontas frias.
    NOTA: A quantidade de BME é baseada no tamanho do pellet. Recomenda-se a adição de 25% de meio de base organoide (passo 1.3) com células ressuspensas a 75% de EMB.
15. Colocar a solução de células ressuspensas numa placa de 6 poços em alíquotas de 40 μL. Placa até cinco alíquotas por poço.
16. Coloque imediatamente a placa do poço na incubadora por 20 min. Após a incubação, adicione suavemente 2 mL de meio organoide completo (etapa 1.2) em cada poço.

Figura 2: Tecido tumoral antes da dissecção. Imagem representativa do tecido tumoral obtida para geração de organoides. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Passaging de organoides

NOTA: Se a amostra for confluente, cada poço organoide pode ser passado semanalmente para dois novos poços.

1. Utilizando uma pipeta de 1 mL, adicione 1 mL de meio de base organoide (etapa 1.3) a cada poço e pipete o meio para cima e para baixo diretamente nas abas organoides para dissociá-lo. Recolher todo o meio que contém os pellets ressuspensos num tubo cónico de 15 ml.
2. Centrifugar o tubo cónico de 15 ml contendo a mistura a 1.650 x g durante 5 min a 4 °C. Em seguida, aspirar cuidadosamente o sobrenadante usando uma pipeta Pasteur de vidro.
3. Adicionar 1 ml de enzima recombinante isenta de origem animal (ver Tabela de Materiais) ao pellet celular, vortex da solução a 458 x g e transferir para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Deixar o tubo incubar durante 15 minutos num banho de água a 37 °C.
4. Após incubação, centrifugar a 1,650 x g durante 5 min a 4 °C. Em seguida, aspirar cuidadosamente o sobrenadante usando uma pipeta Pasteur de vidro.
5. Ressuscite o pellet no BME.
   NOTA: A quantidade de BME é baseada no tamanho do pellet. Recomenda-se a adição de 25% de meios de base organoides (etapa 1.3) com células ressuspensas a 75% de EMB.
6. Chapear a solução de células ressuspensas numa placa de 6 poços em alíquotas de 40 μL. Placa até cinco alíquotas por poço. Uma vez que todas as alíquotas tenham sido chapeadas, coloque imediatamente a placa do poço na incubadora por 20 min. Após a incubação, adicione suavemente 2 mL de meio organoide completo (etapa 1.2) em cada poço.

5. Congelamento e descongelamento de organoides

1. Congelamento de organoides
   1. Comece com as etapas 4.1-4.4.
   2. Ressuspeite o pellet celular em 0,5-1 mL de meio de congelamento de cultura celular de recuperação (ver Tabela de Materiais) e transfira 1 mL para cada criovial.
   3. Em seguida, coloque os crioviais em um recipiente cheio de isopropanol a -80 °C por até 2 semanas antes de transferi-los para um tanque de nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo¹³.
2. Descongelamento de organoides
   1. Retirar as amostras do reservatório de azoto líquido e descongelar a 37 °C em banho-maria.
   2. Uma vez descongelado, transferir para um tubo cônico de 15 mL e centrifugar a 1.650 x g por 5 min a 4 °C. Após a centrifugação, aspirar cuidadosamente o sobrenadante utilizando uma pipeta Pasteur de vidro.
   3. Ressuscite o pellet no BME.
      NOTA: A quantidade de BME é baseada no tamanho do pellet. Recomenda-se a adição de 25% de meios de base organoides (etapa 1.3) com células ressuspensas a 75% de EMB.
   4. Colocar a solução de células ressuspensas numa placa de 6 poços em alíquotas de 40 μL. Coloque até cinco alíquotas por poço.
   5. Coloque imediatamente a placa na incubadora por 20 min. Após a incubação, adicionar suavemente 2 mL de meio organoide completo (etapa 1.2) aos poços.

6. Incorporação e geração de lâminas embutidas em parafina fixada em formalina (FFPE) para avaliar a composição organoide

1. Após a cultura de organoides por pelo menos 10 dias para garantir o tamanho adequado, remova o meio organoide completo dos poços e adicione 1 mL de fixador de paraformaldeído a 2% (PFA). Incubar à temperatura ambiente por 5-10 min.
2. Após a incubação, lavar as alíquotas organoides cultivadas 3x por 5 min de cada vez com 1 mL de PBS.
3. Retire o PBS de cada poço e adicione 1 mL de ágar quente a 2% em H₂O deionizado a cada poço. Ao adicionar o ágar, levante as alíquotas organoides cultivadas da placa usando uma espátula.
   NOTA: É importante não deixar o ágar endurecer antes de levantar as alíquotas organoides cultivadas.
   1. Deixe o ágar solidificar no poço à temperatura ambiente.
4. Usando uma espátula pequena, liberte o ágar solidificado do poço e armazene-o em por até 48 h (ver Tabela de Materiais) a 4 °C em etanol a 70% até o processamento¹⁴.
5. Incorpore as amostras em parafina 15, corte as lâminas até uma espessura de 5 μm e core as lâminas com coloração de hematoxilina e eosina (H & E, ver Tabela de Materiais) usando um protocolo padrão¹⁵.

Resultados

Para gerar DOPs, as amostras foram digeridas mecanicamente e enzimaticamente em suspensões unicelulares. As células foram então ressuspensas em BME e suplementadas com meios especificamente modificados (Figura 3). Os organoides são tipicamente estabelecidos ao longo de um período de tempo de 10 dias, após o qual demonstram organoides discretos em cultura (Figura 4).

Discussão

O câncer de ovário é extremamente mortal devido ao seu estágio avançado no diagnóstico, bem como ao desenvolvimento comum de resistência à quimioterapia. Muitos avanços na pesquisa do câncer de ovário foram feitos utilizando linhas celulares de câncer e modelos PDX; no entanto, há uma necessidade evidente de um modelo in vitro mais representativo e acessível. As DOP têm demonstrado representar com precisão a heterogeneidade tumoral, o microambiente tumoral e as características genômicas e trans...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% HEPES	Life Technologies	15630080
1% Penicillin-Streptomycin	Fisher Scientific	30002CI
1.5 mL Eppendorf Tubes	Genesee Scientific	14125
10 cm Tissue Culture Dish	TPP	93100
10 mL Serological Pipet
100 µm Cell Filter	MidSci	100ICS
15 mL centrifuge tubes	Corning	430052
2 mL Cryovial	Simport Scientific	T301-2
2% Paraformaldehyde Fixative	Sigma-Aldrich
37 °C water bath	NEST	602052
3dGRO R-Spondin-1 Conditioned Media Supplement	Millipore Sigma	SCM104
6 well plates	TPP	92006
70% Ethanol	Sigma-Aldrich	R31541GA
A83-01	Sigma-Aldrich	SML0788
Advanced DMEM/F12	ThermoFisher	12634028
Agar	Lamda Biotech	C121
B-27	Life Technologies	17504044
Centrifuge
Cultrex Type 2	R&D Systems	3533-010-02	basement membrane extract
DNase I	New England Bio Labs	M0303S
DNase I Reaction Buffer	New England Bio Labs	M0303S
EGF	PeproTech	AF-100-15
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
FGF-10	PeproTech	100-26
FGF2	PeproTech	100-18B
gentleMACS C Tubes	Miltenyi BioTech	130-096-334
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters	Miltenyi BioTech	130-096-427	We use the manufacturers protocol.
GlutaMAX	Life Technologies	35050061	dipeptide, L-alanyl-L-glutamine
Hematoxylin and Eosin Staining Kit	Fisher Scientific	NC1470670
Histoplast Paraffin Wax	Fisher Scientific	22900700
Microcentrifuge
Mr. Frosty Freezing Container	Fisher Scientific	07202363S
N-acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636
p1000 Pipette with Tips
p200 Pipette with Tips
Pasteur Pipettes 9"	Fisher Scientific	1367820D
PBS	Fisher Scientific	MT21031CM
Pipet Controller
Prostaglandin E2	R&D Systems	2296
Puromycin	ThermoFisher	A1113802
Recombinant Murine Noggin	PeproTech	250-38
Recovery Cell Culture Freezing Medium	Invitrogen	12648010
Red Blood Cell Lysis Buffer	BioLegend	420301
ROCK Inhibitor (Y-27632)	R&D Systems	1254/1
SB202190	Sigma-Aldrich	S7076
T75 Flask	MidSci	TP90076
Tissue Culture Hood
Tissue Embedding Cassette
TrypLE Express	Invitrogen	12604013	animal origin-free, recombinant enzyme
Type II Collagenase	Life Technologies	17101015
Vortex