Imagem Subcelular da Manipulação Neuronal de Cálcio In Vivo

Resumo

Os métodos atuais descrevem uma abordagem não-ratiométrica para imagens subcompartimentais de cálcio de alta resolução in vivo em Caenorhabditis elegans usando indicadores de cálcio codificados geneticamente prontamente disponíveis.

Resumo

A imagem com cálcio (Ca 2+) tem sido amplamente utilizada para examinar a atividade neuronal, mas está ficando cada vez mais claro que a manipulação subcelular de Ca²⁺ é um componente crucial da sinalização intracelular. A visualização da dinâmica subcelular de Ca²⁺ in vivo, onde os neurônios podem ser estudados em seus circuitos nativos e intactos, tem se mostrado tecnicamente desafiadora em sistemas nervosos complexos. A transparência e o sistema nervoso relativamente simples do nematoide Caenorhabditis elegans permitem a expressão célula-específica e a visualização in vivo de marcadores e marcadores fluorescentes. Entre eles estão indicadores fluorescentes que foram modificados para uso no citoplasma, bem como em vários compartimentos subcelulares, como as mitocôndrias. Este protocolo permite a obtenção de imagens não ratiométricas de Ca 2+ in vivo com uma resolução subcelular que permite a análise da dinâmica de Ca²⁺ até o nível de espinhas dendríticas individuais e mitocôndrias. Aqui, dois indicadores geneticamente codificados disponíveis com diferentes afinidades de Ca 2+ são usados para demonstrar o uso deste protocolo para medir os níveis relativos de Ca²⁺ dentro do citoplasma ou matriz mitocondrial em um único par de interneurônios excitatórios (AVA). Juntamente com as manipulações genéticas e observações longitudinais possíveis em C. elegans, este protocolo de imagem pode ser útil para responder a perguntas sobre como o manuseio de Ca²⁺ regula a função neuronal e a plasticidade.

Introdução

Os íons cálcio (Ca²⁺) são carreadores de informação altamente versáteis em muitos tipos celulares. Nos neurônios, o Ca²⁺ é responsável pela liberação de neurotransmissores atividade-dependente, pela regulação da motilidade citoesquelética, pelo ajuste fino dos processos metabólicos, bem como por muitos outros mecanismos necessários para a adequada manutenção e função neuronal ^1,2. Para garantir uma sinalização intracelular eficaz, os neurônios devem manter baixos níveis basais de Ca²⁺ em seu citoplasma³. Isso é realizado por mecanismos cooperativos de manipulação de Ca 2+, incluindo a captação de Ca²⁺ em organelas como o retículo endoplasmático (RE) e mitocôndrias. Esses processos, além do arranjo de canais iônicos permeáveis ao Ca 2+ na membrana plasmática, resultam em níveis heterogêneos de Ca²⁺ citoplasmático em todo o neurônio.

A heterogeneidade do Ca 2+ durante o repouso e a ativação neuronal permitem a regulação diversa e local-específica dos mecanismos dependentes do Ca ²⁺ 1. Um exemplo dos efeitos concentração-específicos do Ca 2+ é a liberação de Ca ²⁺ do RE através dos receptores inositol 1,4,5-trisfosfato (InsP 3). Baixos níveis de Ca²⁺ em combinação com InsP₃ são necessários para a abertura do poro permeável ao cálcio do receptor. Alternativamente, altos níveis de Ca²⁺ inibem direta e indiretamente o receptor⁴. A importância da homeostase do Ca 2+ para a função neuronal adequada é apoiada por evidências que sugerem que a interrupção da manipulação e sinalização intracelular do Ca²⁺ é um passo precoce na patogênese de doenças neurodegenerativas e envelhecimento natural ^5,6. Especificamente, a captação e liberação anormais de Ca²⁺ pelo PS e mitocôndrias estão ligadas ao aparecimento de disfunção neuronal na doença de Alzheimer, doença de Parkinson e doença de Huntington ^6,7.

O estudo da dishomeostase de Ca 2+ durante o envelhecimento natural ou neurodegeneração requer a observação longitudinal dos níveis de Ca²⁺ com resolução subcelular em um organismo vivo e intacto, no qual a arquitetura celular nativa (isto é, o arranjo de sinapses e distribuição de canais iônicos) é mantida. Para este fim, este protocolo fornece orientação sobre o uso de dois sensores Ca²+ codificados geneticamente prontamente disponíveis para registro da dinâmica de Ca²⁺ in vivo com alta resolução espacial e temporal. Os resultados representativos obtidos usando o método descrito em C. elegans demonstram como a expressão de indicadores de Ca 2+ no citoplasma ou na matriz mitocondrial de neurônios individuais pode permitir a aquisição rápida de imagens fluorescentes (até 50 Hz) que ilustram a dinâmica do Ca 2+ com a capacidade adicional de discernir os níveis de Ca ²⁺ dentro de estruturas semelhantes à coluna vertebral e mitocôndrias individuais.

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Protocolo

1. Criação de cepas transgênicas

1. Usando um método de clonagem de escolha^8,9, clone vetores de expressão para conter o promotor Pflp-18 ou Prig-3 (para sinal AVA-específico no cordão nervoso ventral), seguido pelo indicador de escolha Ca²⁺ e, em seguida^, um UTR 3' (veja a discussão para obter mais informações)¹⁰. Uma lista de plasmídeos e suas fontes pode ser encontrada na Tabela Suplementar 1.
2. Seguir o protocolo estabelecido para a criação de cepas transgênicas através da microinjeção de uma mistura de DNA (<100 ng/μL; ver Tabela Suplementar 1 para as concentrações de cada plasmídeo) contendo o transgene indicador Ca²+ (~20 ng/μL) e o DNA de resgate lin-15⁺ (marcador de seleção) na gônada de um adulto de 1 dia de idade C. elegans¹⁰ (genótipo: LIN-15 (N765TS); fenótipo: multivulva)^10,11.
   NOTA. Manter os pais lin-15(n765ts) a 15 °C para suprimir a mutação sensível à temperatura.
3. Manter os pais injetados a 20 °C até que a progênie F1 atinja a idade adulta para permitir a seleção transgênica usando a ausência do fenótipo multivulva.
4. Clonalmente passam¹³ progênies F1 adultas que não possuem o fenótipo multivulva, pois indica a expressão do arranjo extracromossômico contendo o indicador Ca^{2+ 11}.
5. Avaliar a expressão do indicador Ca²⁺ na progênie F2 ou F3 que não têm o fenótipo multivulva montando e imageando adultos com 1 dia de idade, conforme descrito posteriormente na seção 3.
   NOTA. Uma expressão relativamente alta do indicador é necessária para a rápida aquisição de imagens, como descrito aqui (veja a discussão para mais detalhes).
6. Realizar experimentos em gerações subsequentes das cepas transgênicas com uma expressão ótima do indicador Ca 2+ (ver a discussão para mais detalhes), mantendo as cepas em condições padrão (²⁰ °C em placas NGM)¹².

2. Configuração óptica

1. Use um microscópio capaz de imagens de lapso de tempo de longo prazo.
   NOTA. Os dados representativos foram adquiridos utilizando-se microscópio confocal de disco giratório invertido equipado com lasers de excitação de 488 nm e 561 nm.
2. Use uma objetiva de baixa ampliação (ou seja, 10x/0,40) para a localização bruta do worm.
3. Para alcançar a resolução subcelular, alterne e localize os neurônios usando uma objetiva de alta magnificação.
   NOTA. Uma objetiva de óleo de 100x/1,40 NA foi utilizada para obter os dados representativos neste estudo.
4. Adquira as imagens usando uma câmera ultrassensível capaz de aquisição rápida de imagens (>50 fps).
5. Use um filtro de emissão padrão para o indicador Ca²⁺ de escolha (ou seja, um filtro de emissão de 525 nm ± 50 nm para GCaMP6f e mitoGCaMP).
6. Adicione um corretor Z-drift (ZDC) para a aquisição de fluxos de imagem com mais de 10 s, pois a dessecação da almofada de ágar durante a sessão de imagem faz com que o neurito saia do foco em alguns segundos.
   NOTA. Se uma configuração de microscopia não permitir ZDC, ou se longos períodos de imagem (>20 min) forem desejados, aplique uma borda de graxa de silício ou vaselina derretida ao redor da almofada de ágar para retardar a dessecação.

3. Preparação de vermes para aquisição de imagens

1. Preparação das almofadas de ágar
   1. Completar 3 ml de ágar a 10% dissolvendo ágar de grau molecular em M9¹² num tubo de cultura de vidro de 13 mm x 100 mm e micro-ondas durante vários segundos (ver Tabela de Materiais).
      NOTA. O ágar fundido pode ser mantido em um bloco de calor por até 1 h ou pode ser feito fresco cada vez que as almofadas de ágar são necessárias.
   2. Coloque uma lâmina de microscópio entre duas lâminas adicionais, cada uma com duas camadas de fita adesiva de laboratório (ver Figura 1A-i).
   3. Corte a ponta de uma ponta de pipeta de 1.000 μL (sem filtro) e use-a para pipetar uma pequena gota de ágar na tampa central (Figura 1A-i).
   4. Achate o ágar pressionando outra lâmina para baixo em cima do ágar (Figura 1A-ii).
   5. Após o resfriamento, corte o ágar em um pequeno disco usando a abertura de um tubo de cultura de vidro de 13 mm x 100 mm (Figura 1A-iii) e, em seguida, remova o ágar circundante.
2. Preparando a solução de laminação de worms
   1. Dissolva o pó de muscimol em M9 para criar um estoque de 30 mM. Separar em alíquotas de 50 μL e conservar a 4 °C.
   2. Descongele uma nova alíquota de 30 mM de muscimol a cada 3-5 dias (e armazene a 20 °C enquanto estiver em uso).
   3. Diluir um estoque de muscimol de 30 mM na proporção de 1:1 com esferas de poliestireno para fazer a solução de laminação.
3. Posicionando um worm para geração de imagens
   1. Colocar 1,6 μL da solução de laminação no centro da almofada de ágar.
      NOTA: A quantidade de líquido deve ser ajustada para imagens de animais mais jovens (menos) ou mais velhos (mais).
   2. Usando o worm pick preferido (isto é, um coletor de fio de vidro ou platina)¹³, transfira um verme da idade desejada sem o fenótipo^{multivulva 11} para a solução de rolamento na almofada de ágar (Figura 1A-iv).
      NOTA. Os dados representativos são de hermafroditas com 1 dia de idade (cepa GCaMP6f = FJH185; cepa mitoGCaMP; FJH597; ver Tabela Suplementar 1), que pode ser identificada pela presença de apenas uma fileira de ovos. Veja a discussão para obter mais detalhes sobre como trabalhar com vermes de diferentes idades.
   3. Aguarde ~5 min para que o muscimol reduza o movimento do verme e, em seguida, solte uma lamínula de 22 mm x 22 mm em cima da almofada de ágar, restringindo fisicamente o movimento do verme.
   4. Para obter imagens de neuritos no cordão nervoso ventral, enrole o verme na orientação mostrada na Figura 1B,C deslizando levemente a lamínula.
      NOTA. Para visualizar o cordão nervoso ventral, posicione o verme com a cabeça para cima e role o verme até que o intestino fique do lado direito da porção proximal e o esquerdo para a porção distal do verme (da perspectiva do observador). Inverter essa orientação (Figura 1C) para obtenção de imagens de neuritos no cordão nervoso dorsal.
4. Montagem do verme em um microscópio
   1. Coloque uma gota de óleo de imersão na tampa antes de montá-la no palco do microscópio.
   2. Encontre o worm usando uma objetiva de baixa ampliação (10x) no campo brilhante.
   3. Mude para a objetiva de 100x e ajuste o foco.
   4. Localize o neurito AVA usando a iluminação do GCaMP ou mitoGCaMP com o laser de imagem de 488 nm.
      NOTA: Use pequenos ajustes para evitar esmagar o verme ou puxar a tampa.

4. Aquisição de fluxos de imagens de alta resolução

1. In vivo Imagem do GCaMP
   1. Defina o tempo de exposição para 20 ms.
   2. Ajuste as configurações de aquisição e laser de imagem até que a fluorescência basal do GCaMP esteja na faixa intermediária da faixa dinâmica da câmera¹⁴. Consulte a discussão para obter sugestões sobre como otimizar os parâmetros de imagem usando outras configurações de microscopia.
      NOTA. Para o arranjo óptico utilizado neste estudo, ajuste o laser de imagem de 488 nm para as seguintes configurações de saída: potência do laser = 50% e atenuação = 1. Modifique as configurações de aquisição adicionais da seguinte forma: ganho de EM = 200 e ganho pré-amplificador = 1.
   3. Depois que o neurito AVA for localizado usando a fluorescência GCaMP em aumento de 100x, ajuste o ZDC (consulte Tabela de Materiais) para uma faixa de ±30 μm e inicie o foco automático contínuo. Corrija manualmente o plano focal conforme necessário antes da geração de imagens.
   4. Adquira um fluxo de imagens com ampliação de 100x. Durações de até 10 min podem ser alcançadas com o setup utilizado neste estudo.
2. Imagem in vivo do mitoGCaMP
   1. Siga as etapas 4.1.1-4.1.2 conforme necessário para adquirir a fluorescência mitoGCaMP basal na faixa intermediária para a faixa dinâmica da câmera¹⁴.
      NOTA. Para o set-up óptico utilizado neste estudo, ajuste o laser de imagem de 488 nm para as seguintes configurações de saída: potência do laser = 20% e atenuação = 10. Modifique as configurações de aquisição para o seguinte: ganho de EM = 100 e ganho pré-amplificador = 2.
   2. Depois que as mitocôndrias no neurito AVA forem localizadas usando a fluorescência mitoGCaMP, defina o ZDC como descrito acima na etapa 3.3.
   3. Adquira um fluxo de imagens com ampliação de 100x.

5. Análise do fluxo de imagens

1. Abra o fluxo de imagens em um software de imagem apropriado para analisar os valores de pixel em uma série de imagens (consulte Tabela de materiais).
2. Usando a ferramenta Polygon Selection , defina a região subcelular de interesse (ROI) contendo GCaMP ou mitoGCaMP.
3. Clique em Analisar > Ferramentas > ROI Manager. No Gerenciador de ROI, clique em Adicionar e, em seguida, em Mais > Multimedida. Na janela Multimedida, clique em OK para coletar automaticamente as intensidades média, mínima e máxima de pixels do ROI definido acima para cada quadro do fluxo de imagem para análise adicional.
   NOTA. Recomenda-se que a intensidade média dos pixels (F méd) seja normalizada para a intensidade mínima (F min) para cada ROI usando a razão F_méd/F_min para explicar as diferenças de fluorescência devido ao posicionamento no plano z. Descarte os fluxos de imagem com movimento de verme durante a imagem, pois isso também afetaria as medições de fluorescência.

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Resultados

Estes dois protocolos permitem a rápida aquisição de níveis diferenciais de Ca²⁺ dentro das regiões subcelulares e organelas de neuritos individuais in vivo com alta resolução espacial. O primeiro protocolo permite a dosagem citoplasmática de Ca²⁺ com alta resolução temporal e espacial. Isso é demonstrado aqui usando a expressão célula-específica de GCaMP6f nos interneurônios de comando glutamatérgico AVA¹⁵, cujos neuritos percorrem toda a extensão d...

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Discussão

A primeira consideração ao implementar o método descrito envolve a seleção de um indicador Ca²⁺ com características ideais para a pergunta de pesquisa dada. Os indicadores citoplasmáticos de Ca 2+ tipicamente têm alta afinidade por Ca 2+, e a sensibilidade desses indicadores ao Ca²⁺ está inversamente relacionada à cinética (taxa liga/desliga)^16,17. Isso significa que a sensibilidade ou a cinética do Ca^2...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x/1.40 Oil objective	Olympus		UPlanSApo
10x/0.40 Objective	Olympus		UPlanSApo
22 mm x 22 mm Cover glass	VWR	48366-227
Agarose SFR	VWR	J234-100G
Beam homogenizer	Andor Technologies		Borealis upgrade to CSU-X1
CleanBench laboratory table	TMC		With vibration control
Disposable culture tubes	VWR	47729-572	13 mm x 100 mm
Environmental chamber	Thermo Scientific	3940	Set to 20 °C
Filter wheel or slider	ASI		For 25 mm diameter filters
FJH 185	Caenorhabditis Genetics Center	FJH 185	Worm strain
FJH 597	Caenorhabditis Genetics Center	FJH 597	Worm strain
GFP bandpass emission filter	Chroma		525 ± 50 nm (25 mm diameter)
ILE laser combiner	Andor Technologies		4 laser lines
ILE solid state 488 nm laser	Andor Technologies		50 mW
ImageJ	National Institutes of Health		Version 1.52a
IX83 Spinning disk confocal microscope	Olympus		With Yokogawa CSU-X1 spinning disc
iXon Ultra EMCCD camera	Andor Technologies
Low auto-fluorescence immersion oil	Olympus	Z-81226
MetaMorph	Molecular Devices		Version 7.10.1
Microscope control box	Olympus		IX3-CBH
Muscimol	MP Biomedical / Sigma	02195336-CF
pAS1	AddGene	194970	Plasmid
pBSKS	Stratagene
pCT61			Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request
pJM23			Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request
pKK1	AddGene	194969	Plasmid
Polybead microspheres	Polysciences Inc.	00876-15	0.094 µm
Stability chamber	Norlake Scientific	NSRI241WSW/8H	Set to 15 °C
Stage controller	ASI		With filter wheel control
Standard microscope slide	Premiere	9108W-E	75 mm x 25 mm x 1 mm
Touch panel controller	Olympus		I3-TPC
Z-drift corrector	Olympus		IX3-ZDC2