Otimizando o processo de preparação de amostras para microscopia eletrônica de transmissão de junções neuromusculares em larvas de Drosophila

Resumo

Este relatório fornece um novo procedimento de preparação de amostras para visualizar junções neuromusculares em larvas de Drosophila . Este método é mais eficaz na prevenção do enrolamento das amostras em comparação com o método tradicional e é particularmente útil para a análise ultraestrutural da junção neuromuscular de Drosophila .

Resumo

A junção neuromuscular de Drosophila (NMJ) emergiu como um sistema modelo valioso no campo da neurociência. A aplicação da microscopia confocal no Drosophila NMJ permite que os pesquisadores adquiram informações sinápticas, abrangendo dados quantitativos sobre a abundância de sinapses e insights detalhados sobre sua morfologia. No entanto, a distribuição difusa e o alcance visual limitado do MET apresentam desafios para a análise ultraestrutural. Este estudo apresenta um método inovador e eficiente de preparação de amostras que supera a abordagem convencional. O procedimento começa com a colocação de uma malha de metal na base de uma garrafa de fundo plano ou tubo de ensaio, seguido pelo posicionamento de amostras de larvas fixas na malha. Uma malha adicional é colocada sobre as amostras, garantindo que elas sejam posicionadas entre as duas malhas. As amostras fixas são completamente desidratadas e infiltradas antes de prosseguir com o procedimento de incorporação. Em seguida, a inclusão das amostras em resina epóxi é realizada de forma plana, o que permite a preparação dos músculos para posicionamento e secção. Beneficiando-se dessas etapas, todos os músculos das larvas de Drosophila podem ser visualizados sob microscopia de luz, facilitando o posicionamento e seccionamento subsequentes. O excesso de resina é removido após a localização dos^6º e^7º músculos dos segmentos corporais A₂ e A₃. É realizada seccionamento ultrafino em série do^6º ou^7º músculo.

Introdução

A microscopia eletrônica é um dos métodos mais ideais para estudar a ultraestrutura de materiais biológicos que podem demonstrar visualmente e com precisão a estrutura interna das células no nível¹ em nanoescala. No entanto, devido à complexidade do processo de preparação da amostra e ao alto custo, a microscopia eletrônica não é tão popular quanto a microscopia de luz. Avanços recentes nas técnicas de microscopia eletrônica levaram a melhorias significativas na qualidade da imagem, coincidindo com uma redução notável na carga de trabalho associada. Consequentemente, a microscopia eletrônica tem assumido um papel importante no avanço do conhecimento científico em diversos campos².

Drosophila é um excelente modelo animal para realizar manipulações genéticas para controlar com precisão a expressão espacial e temporal de genes-alvo³. Além disso, a Drosophila tem as vantagens de um curto período de crescimento e fácil criação em comparação com os modelos de mamíferos; portanto, Drosophila é amplamente utilizada em pesquisas morfológicas ^4,5.

Nas larvas de Drosophila, os botões da junção neuromuscular (NMJ) são amplamente distribuídos nos músculos ^6,7, e a imunomarcação da NMJ pode facilmente fornecer informações sobre a quantidade e morfologia das sinapses ^8,9. Os botões NMJ localizados nos músculos^6º/7º dos segmentos A₂ e A₃ são adequados para pesquisas quantitativas e morfológicas usando microscopia de luz. Isso se deve ao seu tamanho e abundância^10,11. Portanto, as larvas de Drosophila NMJs são consideradas um modelo útil para pesquisas em neurociência¹².

No entanto, é desafiador observar a ultraestrutura do botão da JNM pelo MET. Como a janela de varredura da microscopia eletrônica de transmissão é estreita, é difícil posicionar os botões NMJ amplamente distribuídos¹³. A outra razão é que a parede corporal da Drosophila é suscetível à ondulação durante a etapa de desidratação alcoólica do protocolo de preparação da amostra⁷.

Estudos tradicionais geralmente escolhem botões entre os músculos 6^e 7 dos segmentos A₂ e A₃ como materiais de amostra devido à sua abundância e tamanho ^14,15. Os^6º e^7º músculos dos segmentos A₂ e A₃ são maiores que os outros músculos e contêm mais boutons. No entanto, quando as amostras foram preparadas para microscopia eletrônica, as amostras fixas tenderam a se tornar finas e propensas a ondulação, levando ao posicionamento inadequado dos^6º e^7º músculos dos segmentos A₂ e A₃.

Relatamos um novo procedimento de processamento que é mais eficaz na prevenção do enrolamento das amostras em comparação com o método tradicional de preparo de amostras ^7,16, permitindo que as amostras permaneçam planas durante a desidratação subsequente, facilitando assim um melhor posicionamento das junções neuromusculares larvais de Drosophila.

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Protocolo

NOTA: O método de preparação de amostras de microscopia eletrônica de transmissão usado neste artigo foi relatado anteriormente¹⁶. É importante notar que a seleção de reagentes e o ajuste da dosagem são necessários dependendo da amostra. Existem muitos reagentes químicos tóxicos usados no processo de preparação da amostra, portanto, o operador precisa tomar certas medidas de proteção, como usar roupas e luvas de proteção e operar em uma capela de exaustão.

1. Procedimento de dissecação, fixação e colocação

1. Dissecção
   1. Disseque as larvas errantes do final do 3º instar em solução de Jan e obtenha toda a parede do corpo com base nos procedimentos padrão¹⁷. Prepare a solução de Jan da seguinte forma: 128 mM NaCl, 2 mM KCl, 4 mM MgCl₂, 35mM sacarose, 5mM HEPES, pH 7,4
      NOTA: A parede corporal das larvas de Drosophila refere-se à cobertura externa ou tegumento do estágio larval da mosca da fruta Drosophila. Isso inclui a cutícula, as células epidérmicas e os tecidos subjacentes que formam o exoesqueleto larval. A parede do corpo fornece suporte e proteção estrutural e serve como uma barreira entre o corpo larval e o ambiente externo¹⁷.
2. Fixação
   1. Fixar a parede do corpo larval na câmara de dissecação a 4 °C durante a noite com o fixador. Para preparar o fixador, misture glutaraldeído a 2% e formaldeído a 2% em tampão cacodilato de sódio 0,1 M (pH 7,4)
   2. Enxágue as amostras várias vezes com tampão de cacodilato de sódio.
   3. Prepare 1% de OsO₄ em tampão de cacodilato. Fixar as amostras em OsO₄ a 1% durante 2 h, seguido de vários enxaguamentos em água destilada.
      NOTA: A fixação dupla com aldeídos e OsO₄ proporciona melhor proteção da ultraestrutura celular. Além disso, a OsO₄ pode corar o tecido da amostra, permitindo que o contraste entre a luz e a amostra seja mais aparente¹⁸.
   4. Manchar as amostras da junção neuromuscular de Drosophila com acetato de uranila saturado a 2% por 2 h, seguido de vários enxágues com água deionizada (Figura 1A).
3. Colocação de amostras
   1. Corte dois pedaços redondos de malha de metal de tamanho semelhante (tamanho do poro 270 μm) com uma tesoura.
   2. Coloque uma malha de metal (270 μm) na base de uma garrafa de fundo plano com antecedência.
   3. Coloque as amostras de larvas fixas na malha e, em seguida, coloque outra malha sobre elas para que as amostras sejam colocadas entre as duas malhas.

2. Desidratação

NOTA Neste trabalho, foi utilizado o método de desidratação por gradiente de etanol.

1. Desidratar as amostras num gradiente de concentração crescente de etanol sequencialmente (50%, 70%, 85%, 95% uma vez cada, 100% duas vezes), cada uma durante 20 min a 4 °C.
2. Enxágue as amostras duas vezes com óxido de propileno em temperatura ambiente por 5 min de cada vez (Figura 1C).

3. Infiltração

NOTA: A infiltração é uma das etapas necessárias para a preparação da amostra TEM. A infiltração permite a substituição gradual do meio desidratante pelo meio de inclusão na amostra para permitir o preenchimento do interstício celular com o meio de incorporação¹⁹.

1. Colocar as amostras na solução mista de óxido de propileno e resina epóxi na proporção de 1:1 e 1:2 por 1 h cada, seguida de resina epóxi pura por 2 h à temperatura ambiente.

4. Incorporação

1. Prepare um filme de polietileno e corte-o em um quadrado grande (aproximadamente 5 × 5 cm) e um pequeno suporte retangular oco (aproximadamente 2 × 2 cm). Cole o quadrado pequeno com o quadrado grande.
2. Pré-posicione resina epóxi suficiente no centro do grande quadrado.
3. Coloque as amostras na resina epóxi pré-posicionada com o lado muscular voltado para cima. Use um estereoscópio.
4. Adicione várias gotas de resina às amostras e cubra-as com filme de PE (um pouco maior que o espaçador) (Figura 1D-E).
5. Polimerizar as amostras a 37 °C, 42 °C e 60 °C durante 24 h, respectivamente (figura 1F).

5. Procedimento de seccionamento

1. Remova as partes em excesso da parede do corpo larval com uma lâmina afiada e retenha um trapézio, incluindo o segmento A₂ / A₃ .
   NOTA: A linha superior deve estar próxima ao^13º músculo e a linha de base deve estar longe da amostra para a resina epóxi. A altura entre a linha superior e a linha de base é de aproximadamente 5-8 mm.
2. Remova o trapézio do restante da amostra e cole-o à cápsula cheia de resina com a cola A/B.
3. Confirme a posição dos^6º e^7º músculos dos segmentos A₂ e A₃ sob a microscopia óptica (Figura 1G) e mantenha o plano tangente paralelo ao^6º músculo.
4. Corte um quinto da amostra ao longo dos dois lados do segmento A₃ .
   NOTA: Remova a maior parte do^6º músculo e retenha 1/3 da largura do^7º músculo.
5. Usando um micrótomo ultrafino, prepare uma seção ultrafina da amostra começando com o^6º músculo.
   NOTA: Cada fatia tem aproximadamente 90 nm de espessura.
6. Anexe o maior número possível de fatias a cada malha de cobre.
7. Realize a microscopia eletrônica de transmissão conforme descrito anteriormente¹⁶.

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Resultados

A parede corporal da larva de Drosophila é composta por 30 fibras musculares identificáveis dispostas em um padrão regular e se parece com uma fatia fina após a dissecção e fixação²¹ (Figura 1A). A amostra permanece plana durante o processo de desidratação devido à presença das malhas metálicas (Figura 1B, C). O músculo do corpo larval é enterrado em uma placa fina feita de resina epóxi (

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Discussão

As amostras de larvas de Drosophila tendem a se enrolar durante a desidratação, pois as amostras são finas, dificultando a localização precisa da junção neuromuscular, aumentando assim a dificuldade e a carga de trabalho para a preparação da amostra. A melhoria tradicional é encurtar a amostra⁷, mas as amostras ainda estavam enroladas em diferentes graus.

Em nosso método, existem duas etapas críticas: primeiro, as amostras permanecem planas durante ...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-Epoxypropane	SHANGHAI LING FENG CHEMICAL REAGENT CO., LTD	JYJ 037-2015	Penetrating Agent
Drosophila Stocks	Bloomington	none	The wild-type control Drosophila strains used in this research were all W1118, and were reared according to standard culture methods
Flat-bottomed glass test tubes	Haimen Chenxing Experimental equipment Company	none	Flat-bottomed glass test tubes(bottle)with sponge plug(or bottle stopper)
K4M cross-linker	Agar Scientific	Cat# 1924B	The embedding resins are based on a highly cross-linked acrylate and methacrylate formula
K4M resin (monomer B)	Agar Scientific	Lot# 631557	Resin Monomer
Polyvinyl film	Haimen Chenxing Experimental equipment Company	none	Transparent polyethylene film is the best , thickness of about 0.2mm
SPI Chem DDSA	SPI	SpI#02827-AF	Dodecenyl Succinic Anhydride
SPI-Chem DMP-30 Epoxy	SPI	02823-DA	Accelerator
SPI-Chem NMA	SPI	SpI#02828-AF	Hardner for Epoxy
SPI-PON 812 Epoxy	SPI	SPI#0259-AB	Resin Monomer
Steel mesh	Yuhuiyuan Gardening Store(online)	none	Copper or stainless steel net
Transmission electron microscopy	Hitachi H-7650	11416692	All grids (on which samples were gathered) were stained with lead citrate and observed under a transmission electron microscopy.
Ultrathin microtome	Leica UC7 ultrathin microtome	595915	All sectioning operations are carried out on a Leica UC7 ultrathin microtome using a diamond knife