Coleta de dados comportamentais de ratos autoiniciados para caracterizar déficits pós-AVC

Resumo

Um sistema para adquirir dados de sessões de comportamento individual autoiniciadas dentro de um ambiente de gaiola de colônia social é apresentado. A eficácia deste sistema é demonstrada por meio de uma avaliação automatizada de alcance qualificado, permitindo a caracterização de deficiências motoras pós-AVC, possíveis alterações comportamentais relacionadas à motivação, variações circadianas e outras variáveis dependentes inovadoras.

Resumo

O teste comportamental em modelos de ratos é frequentemente utilizado para diversos fins, incluindo pesquisa psicológica, biomédica e comportamental. Muitas abordagens tradicionais envolvem sessões de teste individuais e individuais entre um único pesquisador e cada animal em um experimento. Essa configuração pode ser muito demorada para o pesquisador e sua presença pode afetar os dados comportamentais de maneiras indesejadas. Além disso, o enjaulamento tradicional para pesquisa com ratos impõe uma falta de enriquecimento, exercício e socialização que normalmente seriam típicos da espécie, e esse contexto também pode distorcer os resultados dos dados comportamentais. Superar essas limitações pode valer a pena para várias aplicações de pesquisa, incluindo o estudo de lesões cerebrais adquiridas. Aqui, um método de exemplo é apresentado para treinar e testar automaticamente o comportamento individual de ratos em uma gaiola de colônia sem a presença de humanos. A identificação por radiofrequência pode ser utilizada para adaptar as sessões ao rato individual. A validação desse sistema ocorreu no contexto de exemplo de medição do desempenho motor do membro anterior qualificado antes e depois do AVC. As características tradicionais das deficiências comportamentais pós-AVC e as novas medidas possibilitadas pelo sistema são medidas, incluindo taxa de sucesso, vários aspectos da força de tração, análise de ataque, taxa e padrões de iniciação, duração da sessão e padrões circadianos. Essas variáveis podem ser coletadas automaticamente com poucas limitações; Embora o aparato remova o controle experimental da exposição, tempo e prática, a validação produziu consistência razoável nessas variáveis de animal para animal.

Introdução

O treinamento comportamental e os testes com modelos de ratos são importantes em inúmeras áreas de pesquisa, desde a exploração de processos cognitivos até estados de doença^{e muito mais}. Normalmente, esse treinamento e teste são conduzidos com animais individuais em sessões individuais, com um pesquisador removendo manualmente o animal de sua gaiola doméstica e colocando-o temporariamente em algum tipo de aparelho. Infelizmente, existem várias dificuldades e limitações com essa abordagem. Primeiro, o teste comportamental pode levar muito tempo para os pesquisadores e, quando o treinamento é necessário, esse requisito de tempo se torna ainda maior. Em segundo lugar, essa abordagem afeta automaticamente - ou mesmo potencialmente confunde - os dados adquiridos, como foi estabelecido em outro lugar². Esses fatores de confusão são especialmente salientes quando se consideram variáveis relacionadas ao enriquecimento. Especificamente, os ratos de laboratório são tradicionalmente alojados em pequenas gaiolas que são grandes o suficiente para um ou dois ratos³ e, se não forem fornecidas rodas, eles podem passar a vida inteira sem oportunidades significativas de se exercitar. Além disso, o alojamento isolado pode ser uma grande fonte de estresse em uma espécie social como o rato⁴. Algumas dessas desvantagens relacionadas ao bem-estar provavelmente afetam a fisiologia do rato ^5,6, o que pode antecipar o desenvolvimento da expressão comportamental típica da espécie⁴ e afetar a qualidade dos modelos de roedores aplicados a contextos humanos.

Os pesquisadores têm buscado vários tipos de soluções para esses problemas nos últimos anos. O tipo mais simples de solução tem sido automatizar testes comportamentais e treinamento 7,8,9,10, eliminando assim a necessidade de um único pesquisador atender a um único animal. Uma solução adicional foi automatizar a transferência de animais para câmaras experimentais ^11,12, eliminando ainda mais a necessidade de envolvimento humano. Por último, várias configurações foram exploradas que permitem que os animais sejam alojados em gaiolas de colônia com outros animais e com mais espaço para exploração e enriquecimento¹³. Apesar dessas vantagens, essas configurações de colônias podem limitar ou complicar os esforços para coletar dados comportamentais diferenciados individualmente (embora veja os esforços para usar a visão computacional) ^{14 , 15} . Se forem necessários dados comportamentais individuais, pode ser mais difícil ou complexo identificar e recuperar animais do enjaulamento de colônias também para sessões comportamentais. Atualmente, existem poucos sistemas para coletar dados comportamentais individuais de colônias (enriquecidas) 16,17,18.

Essas desvantagens podem afetar especificamente a pesquisa sobre os efeitos comportamentais da lesão cerebral adquirida. Em primeiro lugar, fica claro que a presença e/ou sexo de humanos, bem como as práticas de manuseio, afetam o comportamento dos roedores ^2,19, e essas variáveis podem impactar diferencialmente o comportamento dos ratos antes vs. após o acidente vascular cerebral. Em segundo lugar, os resultados comportamentais humanos após o AVC podem ser agravados pela diminuição voluntária do envolvimento com a dosagem recomendada de exercícios de reabilitação²⁰. Atualmente, os experimentos com roedores tendem a não modelar esse tipo de contexto, porque os ratos não são livres para escolher se envolver ou se abster de sessões comportamentais.

Este artigo apresenta um protocolo projetado para facilitar o teste comportamental individual dentro da estrutura do enjaulamento de colônias enriquecido. Esta abordagem não só aborda os condicionalismos das práticas actuais, como também abre caminhos para a exploração de medidas inovadoras. Um torniquete de um rato (ORT) foi desenvolvido e pode ser afixado em uma gaiola de colônia, permitindo que os animais entrem nas câmaras comportamentais de forma independente e iniciem suas próprias sessões de treinamento e teste. O sistema é acessível; cada ORT pode ser montada a baixo custo (com acesso a uma impressora 3D). No passado, a validação desse sistema foi realizada usando uma câmara operante básica, mostrando que os animais poderiam ser consistentemente treinados para realizar uma simples pressão de alavanca operante sem a presença de um experimentador¹⁶. No entanto, a questão de saber se essa configuração é aplicável a outros cenários permanece sem solução. O objetivo é validar a eficácia da configuração de gaiola de colônia ORT, que foi previamente estabelecida, para treinar e quantificar o comportamento de alcance qualificado relevante para o comprometimento motor após um acidente vascular cerebral. A configuração foi utilizada para gerar novas variáveis que normalmente não são exploradas na pesquisa de AVC. Essas variáveis incluem métricas de desempenho para a tarefa de alcance qualificado e medidas de autoiniciação, que podem ser pertinentes à motivação e à tomada de decisões. Além disso, mudanças induzidas por AVC nos padrões circadianos de autoiniciação diária durante todo o período de 24 horas foram efetivamente detectadas.

Protocolo

Todos os procedimentos e cuidados com os animais foram aprovados pelo comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade do Norte do Texas (IACUC) e aderiram ao guia do National Institutes of Health para o cuidado e uso de animais de laboratório. Ratos Long-Evans machos e fêmeas adultos (400-800 g, 1,5 anos de idade), utilizados no presente estudo, foram alojados em gaiolas de colônias.

1. Preparação do equipamento

1. Obtenha ou monte a catraca de um rato (ORT) de acordo com o projeto files e instruções para construção (ver Arquivo Suplementar 1 e Arquivo de Codificação Suplementar 1). Consulte Butcher et ^al.16 para obter mais detalhes.
   NOTA: Os ORTs são específicos para o tamanho do rato, portanto, uma gaiola de colônia deve incluir animais que tenham aproximadamente o mesmo tamanho. Se alguém não deseja automontar ORTs, eles podem ser adquiridos pré-montados (consulte a Tabela de Materiais).
2. Obtenha e anexe um leitor de identificação por radiofrequência (RFID, consulte a Tabela de Materiais) e obtenha e injete etiquetas RFID em animais.
   NOTA: Ao injetar etiquetas RFID full duplex (FDX), a orientação deve ser perpendicular à antena RFID enquanto o rato caminha pela ORT. Nessa validação, os tags foram implantados por via subcutânea entre a omoplata em um plano paralelo à coluna.
3. Fixe a antena RFID no tubo da ORT.
4. Construa e/ou obtenha o(s) aparelho(s) comportamental(is) e o enjaulamento de colônias apropriados para a questão experimental. Neste exemplo, o enjaulamento de colônias ^21,22 construído sob medida foi usado em conjunto com câmaras operantes disponíveis comercialmente (ver Tabela de Materiais), embora qualquer equipamento pudesse teoricamente ser usado.
   NOTA: A competição de animais alojados em colônias pelo acesso ao(s) aparelho(s) comportamental(is) por meio do ORT deve ser considerada. Antecipe a necessidade de um ORT + aparelho comportamental para cada 4 a 6 animais.
5. Conecte a(s) ORT(s) entre o aparato comportamental e o enjaulamento da colônia.
6. Corte um orifício no aparato comportamental e no enjaulamento da colônia usando uma ferramenta rotativa Dremel (consulte a Tabela de Materiais) ou instrumento semelhante. O diâmetro interno deve ser igual ao diâmetro externo do túnel ORT construído.
   NOTA: O ORT deve ser elevado alguns centímetros para operar, portanto, uma pequena plataforma ou suporte será necessário para alinhar as alturas do enjaulamento da colônia e do aparelho.
7. Instale o sistema RFID para ler os animais à medida que passam pela ORT e, se desejar, integre-o ao aparato comportamental.

2. Treinamento comportamental pré-cirúrgico

1. Obtenha uma coorte de ratos do mesmo tamanho e introduza-os no enjaulamento da colônia.
   NOTA: Animais que foram criados ou alojados extensivamente em isolamento ou com poucos coespecíficos podem ter mais problemas para explorar a câmara, especialmente quando envolve atravessar áreas sociais do enjaulamento da colônia. Os animais devem ser expostos ao enjaulamento em grupo no início da vida para evitar essa armadilha.
2. Remova o acesso a qualquer manipulanda dentro do aparato comportamental e configure a câmara para entregar recompensas automaticamente a cada 60 s, em média, quando ocupada.
   NOTA: Este estudo usou água de sacarose (30% a 40%) como recompensa, mas o leite condensado adoçado também é eficaz.
3. Treine todos os ratos para entrar regularmente no(s) aparelho(s) comportamental(is) através da ORT.
4. Pelo menos uma vez por dia, verifique os dados para garantir que todos os animais estejam entrando no ORT. Se os animais não estiverem entrando, insira um objeto do tamanho de um curral no mecanismo de travamento para evitar que ele trave temporariamente, permitindo que os animais explorem mais livremente. Se os animais ainda não estiverem entrando, remova a catraca e coloque uma parede lateral temporária para permitir o acesso livre do túnel à câmara.
5. Assim que todos os animais entrarem regularmente na câmara, devolva a fechadura (e a catraca) e reavalie.
   NOTA: Os animais também podem ocupar a ORT e a câmara como um alívio temporário de outros ratos. Uma maneira de evitar esse tipo de monopolização da câmara é anexar uma ORT adicional que se conecta a uma câmara de isolamento simples.
6. Introduza o manipulando - a alça de puxar, neste caso de exemplo - e defina a sensibilidade mais alta. Insira a alça dentro da caixa (até 2 cm) ou fora da caixa.
   NOTA: A fita adesiva pode evocar tentativas de alcance se afixada na parte de trás do cabo, fora de alcance.
7. Reduza a frequência com que a recompensa (ou seja, 30% de água de sacarose) é entregue automaticamente (por exemplo, a cada 90-120 s). Lembre-se de que qualquer recompensa pode ser utilizada para atender às necessidades do experimentador e às preferências dos animais.
8. Verifique os dados diariamente para garantir que todos os animais aprenderam a ativar a alavanca. Isque a alavanca e/ou altere o nível de inserção até que todos os animais estejam puxando.
9. Descontinue a entrega automática de recompensas para que elas fiquem disponíveis apenas por meio da ativação do puxador.
10. Se inserida anteriormente, retraia a alavanca todos os dias (desde que todos os ratos continuem a puxar nesse nível de retração) em 0,25 mm a 0,5 mm até que a alavanca esteja em sua posição final, 1 cm a 1,25 cm fora da câmara.
    NOTA: A posição exata da alavanca depende do tamanho dos ratos. Certifique-se de escolher uma posição que resulte na topografia de alcance desejada.
11. Inicie um percentil ou outro programa de treinamento para aumentar progressivamente as forças de tração necessárias para ativar a alça.
    NOTA: Este estudo usou um cronograma de percentil que define o critério de reforço no quartil superior das 15 respostas anteriores. Alternativamente, aumentos graduais do critério de tração podem ser usados⁷.
12. Quando os animais atingirem de forma confiável a faixa de critério final de 120 g de tração, remova o programa de treinamento de percentil e fixe o critério de ativação da alça em uma constante de 120 g.
13. Colete dados de linha de base nesse requisito de força até que as taxas de sucesso tenham permanecido estáveis (sem tendência) por cerca de uma semana.

3. Induzindo o curso

1. Induzir cirurgicamente o AVC em todos os animais enjaulados em colônias ao mesmo tempo.
   NOTA: Para induzir o AVC, foi utilizado um modelo endoteliano-1 de AVC, que foi descrito em outro artigo²³.
2. Permitir que os animais se recuperem em gaiolas tradicionais, isolados individualmente, por 3-7 dias.

4. Teste comportamental pós-cirúrgico

1. Após a recuperação, devolva os animais ao enjaulamento da colônia com o aparelho de alcance qualificado conectado à ORT.
2. Realize o teste comportamental, mantendo os requisitos de tração no final de 120 g (siga o passo 2) até que sejam coletados dados suficientes para avaliar os déficits pós-AVC (de um a vários dias).
3. Implemente quaisquer variáveis independentes relacionadas ao pós-AVC ou à recuperação durante os dias subsequentes, enquanto os animais estão acessando a câmara.

Resultados

Os animais foram treinados e testados com quatro ratos fêmeas em uma gaiola de colônia e quatro ratos machos em uma gaiola de colônia separada. Todos os ratos aprenderam a passar pelas ORTs em quatro dias ou menos. As quatro ratas atingiram >85% de sucesso no requisito de força de 120 g em aproximadamente 6 semanas de treinamento e os ratos machos atingiram o mesmo critério em 10 semanas (em comparação com cerca de 3 semanas com treinamento padrão com ratos privados) ⁷. A duração desse t...

Discussão

Este protocolo tem múltiplos usos. Primeiro, e mais amplamente, o ORT foi desenvolvido com o objetivo de permitir o treinamento comportamental automatizado de um único sujeito e a coleta de dados no contexto de habitação social enriquecida. Embora este estudo tenha testado a ideia de coletar medidas comportamentais típicas e elaborá-las no contexto do AVC, o mesmo pode ser feito para outras aplicações e tarefas comportamentais. Mesmo as medidas coletadas nesta validação também podem ser ajustadas conforme nece...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D printer			Consult with local makerspace
bolt	Boltdepot	1346	6-32 or 8-32 by  0.5"
bolt	Boltdepot	1348	6-32 or 8-32 by  0.75"
door hinge	XJS (Amazon)	43398-16234	1" cabinet stainless steel door hinge set; Optional (if "perfect hinge" is not printed)
drill			Any electric drill works
extension spring	Nieko (Amazon)	50456A	Choose and adjust spring based on ORT sized and desired tension
granulated sugar
lock nuts	Boltdepot	2551	6-32 or 8-32
measuring tape
microcontroller	Arduino	A000066	Arduino Uno
microswitch	Sparkfun	KW4-Z5F	mini microswitch (SPDT-roller lever)
One Rat Turnstile (ORT)	Vulintus		Contact company to request quote if not self-assembling
Operant Chambers as desired for behavioral assessment: For this experiment we used automated isometric pull chambers from Vulintus	Vulintus	No cat #: contact Vulintus	Contact Vulintus for quote
PLA filament	OVERTURE (Amazon)	UK-MATTEPLA17511
plexiglass	Lesnlok (Amazon)	B09P74K7BR	clear, 1/8" thickness, Cut to size
plexiglass cutter
python program	Python Software Foundation		software available on request
RFID reader	Priority 1 Design	RFIDRW-E-USB	With antenna
RFID tag	Unified Information Devices	UC-1485-10
rod	Boltdepot	23632	cut to > 3.5"
Rotary tool			Used to bore hole in apparatus and colony caging for ORT; any hardware usable
sand paper	HSYMQ (Amazon)	TOMPOL-1118-1915-11
socket wrench set			Any socket wrench set works
soldering iron
super glue		234790
wire	Plusivo (Amazon)	EAN0721248989789