Dissecção de camundongos do sistema nervoso central e periférico inteiro

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para completar a dissecção dos sistemas nervoso central e periférico de camundongos. Os tecidos dissecados são analisados posteriormente em aplicações a jusante, como tirar fotos macroscópicas ou histologia.

Resumo

Os modelos animais representam o carro-chefe do campo da neurociência. Apesar disso, hoje, ainda não existe um protocolo passo a passo para dissecar um sistema nervoso completo de roedores, nem existe um esquema completo que o represente e que esteja disponível gratuitamente. Apenas métodos para colher o cérebro, a medula espinhal, um gânglio específico da raiz dorsal e o nervo ciático (separadamente) estão disponíveis. Aqui, fornecemos imagens detalhadas e um esquema do sistema nervoso murino central e periférico. Mais importante, delineamos um procedimento robusto para realizar sua dissecção. A etapa de pré-dissecção de 30 minutos permite isolar o sistema nervoso intacto dentro da vértebra com músculos livres de vísceras e pele. Uma dissecção de 2-4 h segue-o sob um microscópio de microdissecção para expor a medula espinhal e os nervos torácicos e, finalmente, retirar todo o sistema nervoso central e periférico da carcaça. Este protocolo representa um passo significativo no estudo da anatomia e fisiopatologia do sistema nervoso em todo o mundo. Por exemplo, os gânglios da raiz dorsal dissecados de um modelo de camundongos tipo I de neurofibromatose podem ser processados posteriormente para histologia para desvendar mudanças na progressão do tumor.

Introdução

O objetivo geral deste método é isolar o sistema nervoso central e periférico de um camundongo inteiro. Atualmente, não existe um protocolo para dissecar todo o sistema nervoso de um roedor para estudá-lo em nível global. Os neurocientistas normalmente usam o nervo ciático como substituto de qualquer nervo periférico¹ e os gânglios L3 a L5² como substitutos de qualquer gânglio. Usando esses métodos, é impossível concluir se os resultados são específicos para o nervo/gânglio específico. Como se sabe que pelo menos algumas patologias nervosas não afetam todos os nervos e gânglios igualmente ^3,4,5, deve-se desenvolver uma técnica que permita o isolamento do sistema nervoso completo de roedores para estudá-lo globalmente.

Ao longo dos anos, desenvolvemos e refinamos um método para dissecar o sistema nervoso central e periférico completo de camundongos. O primeiro passo é essencialmente uma dissecção grosseira dos camundongos em preparação para as etapas de microdissecação sob o microscópio de dissecação. Nas etapas 2 a 4, a medula espinhal e os nervos torácicos são expostos, o cérebro é dissecado e toda a medula espinhal e os nervos periféricos são retirados da carcaça.

Este método é poderoso quando acoplado a imagens ou histologia para documentar qualquer alteração macroscópica ou microscópica 6,7,8,9. Os neurocientistas interessados em pesquisar as mudanças globais ou conduzir experimentos não baseados em hipóteses devem usar esse método para pesquisar o sistema nervoso global.

Protocolo

Os protocolos utilizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê Institutionnel des Animaux de l'Université de Sherbrooke, uma instituição certificada pelo Conselho Canadense de cuidados com animais.

1. Preparação para microdissecção (pré-dissecção)

1. Realizar anestesia com isoflurano a 5%, seguida de eutanásia com isoflurano a 2% e 10 psi de CO₂ até que não haja sinais vitais.
   NOTA: Não realize luxação cervical, pois isso danifica a medula espinhal e os gânglios cervicais.
2. Coloque o camundongo eutanasiado voltado para cima (vista anterior) em uma almofada de dissecação e borrife o pelo com etanol a 70%.
3. Em seguida, prenda os membros superiores e inferiores, usando quatro pinos de pequeno diâmetro para manter o mouse na posição durante a dissecção.
4. Usando uma tesoura cirúrgica, corte a pele da parte inferior do abdômen até a garganta.
5. Retire a pele para expor os órgãos internos e use pinos adicionais para manter a pele de cada lado enquanto expõe a cavidade abdominal.
6. Abra a caixa torácica para expor o coração e os pulmões.
7. Usando um par de pinças anatômicas padrão, segure o esôfago e a traqueia e corte logo acima da pinça.
8. Em seguida, comece a descascar todos os órgãos internos em uma abordagem cranial a caudal. Para fazer isso, corte o diafragma ao longo da coluna vertebral para remover todos os órgãos internos inteiros.
9. Solte o mouse e enxágue o sangue extra do rato da cavidade abdominal em uma pia.
10. Coloque o mouse voltado para baixo (vista posterior). Prenda os membros superiores e inferiores, usando quatro pinos para manter o mouse na posição durante a dissecção.
11. Usando uma tesoura cirúrgica, retire a pele da cabeça aos membros posteriores.
12. Exponha o nervo ciático esquerdo (membro inferior).
    1. Corte os músculos abertos na parte inferior do membro inferior esquerdo.
    2. Localize e exponha o nervo ciático removendo o músculo ao seu redor.
    3. Corte cuidadosamente o nervo ciático na ramificação dos nervos sural, tibial e fibular e poupe os vasos sanguíneos.
    4. Continue a isolar o nervo ciático usando pinças anatômicas padrão e tesouras de Bonn extra finas, até que fique paralelo à coluna vertebral, deixando um nervo livre de cerca de 2 cm.
    5. Insira a tesoura cirúrgica paralela à medula espinhal e corte o quadril.
    6. Deslocar o quadril separando o sacro e o fêmur usando os dedos.
       NOTA: Durante este processo, é necessário parar com frequência para puxar suavemente o nervo ciático usando uma pinça para evitar a interrupção.
    7. No final, arranque delicadamente o membro posterior da carcaça do camundongo, deixando um nervo ciático de cerca de 4 cm de comprimento.
       NOTA: Durante este processo, localize o nervo L2 e retire-o do membro posterior para evitar danos ao L2. Repita a etapa 1.12 para o lado direito.
13. Exponha os nervos braquiais (membros superiores).
    1. Manipule a carcaça do rato com as mãos, em vez de em uma superfície plana (almofada de dissecação).
    2. Localize o plexo braquial esquerdo separando a gordura e os músculos da axila esquerda.
    3. Uma vez localizadas, cortar as principais ramificações do plexo braquial (radialmente, axilar, supraescapular) e suas sub-ramificações ao redor da ulna com uma tesoura de Bonn extra fina, deixando os nervos livres de cerca de 1,5 cm. Retire suavemente o plexo do membro superior esquerdo.
    4. Deslocar o membro superior esquerdo; Certifique-se de que está livre de nervos. Repita a etapa 1.13 para o lado direito.
14. Exponha o cérebro.
    1. Agora, coloque o mouse virado para cima (vista anterior)
    2. Insira uma lâmina da tesoura Bonn extra fina na boca e corte a mandíbula pela garganta.
    3. Remova a mandíbula cortando ainda mais das bochechas até a garganta.
    4. Em seguida, corte o osso do crânio passando de uma orelha para a outra.
       NOTA: Tenha cuidado para evitar ir muito fundo e danificar o cérebro.
    5. Corte e remova o palato e os ossos nasais para abrir o crânio.
    6. Corte a vértebra C1 na base do crânio, liberando o cerebelo e o início da medula espinhal.
    7. Finalmente, corte o crânio transversalmente até o olho e remova os pedaços do crânio para expor o cérebro.
       NOTA: Mantenha o cérebro em sua cavidade até que os nervos sejam removidos.
15. Remova qualquer gordura ou músculos extras da carcaça. Coloque a carcaça em formol a 10% por 15 min em temperatura ambiente (RT), seguida de breves lavagens com solução salina tamponada com fosfato (PBS) até que não haja mais odor fixador e prossiga para a próxima etapa.
    NOTA: Se o sistema nervoso for dissecado nas próximas 2 semanas, armazene-o a 4 ° C em PBS. Caso contrário, armazene-o em formalina a 10% indefinidamente. Sempre use uma capa química ao manipular a formalina.

2. Exposição da medula espinhal

1. Para expor a medula espinhal, use uma abordagem crânio-caudal. Para remover cada vértebra e sua camada muscular acima, corte nas posições de dez horas e duas horas no lado ventral, usando uma tesoura de mola Vannas. Desbaste a vértebra usando uma minipinça Dumont. Continue este processo através das vértebras cervicais e torácicas.
2. Para a seção lombar, corte o processo transverso em cada lado da vértebra. Em seguida, corte nas posições de duas e dez horas, inserindo a lâmina de uma tesoura de mola Vannas no canal vertebral. Remova os tecidos, prestando atenção aos nervos que às vezes estão presos aos ossos.
3. Proceda da mesma forma para a parte caudal.

3. Exposição do nervo torácico

1. Coloque a carcaça sob o microscópio de dissecção para visualizar o lado anterior.
2. Usando uma tesoura de mola Vannas, corte ao longo de cada costela (do esterno às extremidades inferiores) para expor os nervos periféricos.
3. Em seguida, corte a vértebra em ambos os lados (lateralmente) do gânglio para expor o gânglio.

4. Remoção do nervo periférico

1. Para descascar a medula espinhal e desalojar ainda mais os nervos periféricos, use a minipinça Dumont para rolar suavemente a medula espinhal e puxar os nervos um por um, começando com a parte caudal da medula espinhal.
   NOTA: Antes de descascar, uma fixação adicional pode ser realizada em formalina a 10% por 15 min em RT, seguida de breves lavagens de 1x PBS até que não haja mais odor de fixador, conforme realizado na etapa 1.15.
2. Para a parte torácica, puxe o nervo em um ângulo de 90° (perpendicular à medula espinhal).
3. Para o plexo braquial, corte a vértebra ao lado do nervo, para abrir espaço para o nervo.
   NOTA: O plexo braquial não pode ser passado sob a vértebra, como na região torácica.
4. Remova o excesso de músculos para limpar os nervos.
5. Conservar em PBS a 4 °C até um total de 2 semanas, ou indefinidamente em formalina a 10% em RT.

Resultados

Os roedores têm sido fundamentais para nossa compreensão da biologia e fisiopatologia do sistema nervoso¹⁰. Curiosamente, nenhum método apresenta a dissecção completa do sistema nervoso central e periférico de um roedor para avaliar a anatomia e a variação patológica em um modelo em tempo real ^1,2,11. A Figura 1 apresenta uma visão ...

Discussão

Para evitar que os músculos e nervos sequem, a carcaça deve ser embebida em PBS a cada 10 minutos. Ao deslocar os membros inferiores (passo 1.12.6), é importante ter sempre o plexo do nervo ciático e a L2 à vista para evitar danificá-lo/rasgá-lo. Ao dissecar o cérebro (etapa 1.14.4), é fundamental evitar ir muito fundo para não danificar o cérebro. Ao dissecar os gânglios da raiz dorsal e os nervos periféricos em geral, é fundamental usar minifórceps Dumont de alta qualida...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dumont mini-forceps	Fine Science Tools	#11200-10
Extra Bonn scissors	Fine Science Tools	#14084-08
Formalin 10%	Fischer Scientific	#22-046-361
PBS 1x	BioShopCanada	#PBS404.500
Standard anatomical forceps	Fine Science Tools	#91100-12
Surgical scissors	Fine Science Tools	#140001-12
Vannas spring scissors	Kent Scientific	#INS600124