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Resumo

Este estudo desenvolveu um método não invasivo e em tempo real para avaliar a distribuição do ligante morte programada 1 em todo o corpo, baseado em imagens tomográficas por emissão de pósitrons do antagonista D-dodecapeptídeo [68Ga]. Essa técnica apresenta vantagens sobre a imunohistoquímica convencional e melhora a eficiência na identificação de pacientes apropriados que se beneficiarão da terapia de bloqueio do ponto de verificação imune.

Resumo

O desenvolvimento da terapia de bloqueio de checkpoint imune baseada na proteína de morte celular programada 1 (PD-1)/ligante de morte programada 1 (PD-L1) revolucionou as terapias contra o câncer nos últimos anos. Entretanto, apenas uma fração dos pacientes responde aos inibidores de PD-1/PD-L1, devido à expressão heterogênea de PD-L1 em células tumorais. Essa heterogeneidade representa um desafio na detecção precisa de células tumorais pela abordagem imunoistoquímica (IHQ) comumente utilizada. Essa situação exige melhores métodos para estratificar os pacientes que se beneficiarão da terapia de bloqueio de checkpoint imunológico, para melhorar a eficácia do tratamento. A tomografia por emissão de pósitrons (PET) permite a visualização em tempo real da expressão de PD-L1 de corpo inteiro de forma não invasiva. Portanto, há necessidade do desenvolvimento de traçadores radiomarcados para detectar a distribuição de PD-L1 em tumores através da imagem por PET.

Em comparação com seus homólogos L, os peptídeos (D) dextrógiros têm propriedades como resistência proteolítica e meias-vidas metabólicas notavelmente prolongadas. Este estudo projetou um novo método para detectar a expressão de PD-L1 baseado na imagem PET de 68peptídeo D marcado com Ga-L1-alvo, um antagonista D-dodecapeptídeo (DPA), em camundongos portadores de tumor. Os resultados mostraram que o DPA de [68Ga] pode se ligar especificamente a tumores que superexpressam PD-L1 in vivo, e mostrou estabilidade favorável, bem como excelente capacidade de imagem, sugerindo que o [68Ga]DPA-PET é uma abordagem promissora para a avaliação do status de PD-L1 em tumores.

Introdução

A descoberta de proteínas de checkpoint imune foi um avanço na terapia tumoral e levou a grandes avanços no desenvolvimento da terapia de bloqueio de checkpoint imune1. A proteína de morte celular programada 1 (PD-1) e o ligante de morte programada 1 (PD-L1) são alvos potenciais de drogas com vários anticorpos aprovados pelo Food and Drug Administration (FDA). A PD-1 é expressa por células imunes infiltrantes no tumor, como células T CD4+, CD8+ e células T reguladoras. PD-L1 é um dos ligantes PD-1, que é superexpresso em uma variedade de célulastumorais2,3. A interação entre PD-1 e PD-L1 inativa a PD-1, suprimindo a resposta imune antitumoral4. Esses achados sugerem que a inibição da PD-L1 pode melhorar o efeito de morte das células imunes e eliminar as célulastumorais5. Atualmente, a imuno-histoquímica cromogênica (IHQ) é a abordagem mais comumente utilizada para identificar pacientes com maior probabilidade de responder à terapia com checkpoint imune 6,7. No entanto, devido à expressão heterogênea de PD-L1 em células tumorais, os resultados de IHQ de biópsias não podem fornecer informações precisas sobre a expressão de PD-L1 em pacientes8. Estudos prévios relataram que apenas 20%-40% dos pacientes obtêm benefícios a longo prazo com a terapia de bloqueio de checkpoint imune 1,9,10. Há, portanto, uma necessidade urgente de desenvolver um novo método para contornar os resultados falso-negativos causados pela expressão heterogênea dessas proteínas do checkpoint imune.

A tecnologia de imagem molecular, como a tomografia por emissão de pósitrons (PET), permite a visualização em tempo real de todo o corpo de forma não invasiva e, portanto, pode superar o método convencional de IHQ 11,12,13. Anticorpos radiomarcados, peptídeos e pequenas moléculas são traçadores promissores para monitorar a expressão de PD-L1 em pacientes com câncer 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 . O FDA aprovou três anticorpos monoclonais terapêuticos para PD-L1: avelumab, atezolizumabe e durvalumabe26. Imunotraçadores de PET baseados nesses anticorpos têm sido bem documentados 27,28,29,30,31,32. Ensaios clínicos em fase inicial têm revelado valor limitado para aplicação clínica, devido à farmacocinética desfavorável30. Comparados com os anticorpos, os peptídeos exibem depuração mais rápida de sangue e órgãos de órgãos saudáveis e podem ser facilmente modificados quimicamente33. Múltiplos peptídeos com alta afinidade por PD-1/PD-L1 têm sido relatados2; WL12 é um peptídeo relatado que mostra ligação específica a PD-L134. Há relatos de que os traçadores radiomarcados, [64]WL12, [68Ga]WL12 e [18F]FPyWL12, apresentam alta capacidade de segmentação tumoral específica in vivo, o que permite a obtenção de imagens de alta qualidade da expressão de PD-L1 em tumores26,35,36,37. Além disso, a primeira avaliação em humanos de WL12 radiomarcados demonstrou que [68Ga]WL12 (quelatado por NOTA) tem um potencial seguro e eficiente para imagem clínicatumoral38. Devido à sua alta hidrofobicidade e alta captação no fígado saudável, o WL12 tem uso clínico limitado. Outros peptídeos de radiomarcação, como TPP1 e SETSKSF, que se ligam especificamente à PD-L1, também mostraram potencial estabilidade e especificidade para visualizar a expressão de PD-L1 de corpo inteiro 39,40. No entanto, peptídeos não modificados são facilmente degradados por proteases e são rapidamente metabolizados pelo rim. Os peptídeos dextrógiros(D) têm sido amplamente utilizados como mediadores efetivos, devido à baixa estabilidade dos peptídeos (L)-canhotos 41,42,43. Os peptídeos D são hiper-resistentes à degradação proteolítica e têm meias-vidas metabólicas notavelmente prolongadas. Comparados com seus homólogos L, os peptídeos-D mostram, em sua maioria, habilidades específicas de ligação 44,45,46.

Este estudo desenhou um novo método para detectar a expressão de PD-L1, baseado na imagem PET de um 68peptídeo D marcado com Ga, antagonista D-dodecapeptídeo (DPA), em um modelo de camundongo portador de tumor47. A estabilidade do [68Ga]DPA foi primeiramente estudada em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e soro de camundongo, após o que a afinidade de ligação do [68Ga]DPA em tumores com superexpressão de PD-L1 foi testada. Posteriormente, imagens de PET foram realizadas em modelos de xenoenxerto de glioblastoma para confirmar se [68Ga]DPA era um traçador PET ideal para monitorar a expressão de PD-L1 em tumores. A combinação de imagens PET e DPA não apenas fornece uma nova abordagem para superar os desafios associados à expressão heterogênea de PD-L1, mas também estabelece as bases para o desenvolvimento de radiotraçadores baseados em peptídeos D.

Protocolo

Os procedimentos experimentais em animais foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Universidade Médica de Nanjing ou pelos Institutos Nacionais de Ciência e Tecnologia Quântica. Os experimentos com camundongos foram rigorosamente realizados de acordo com as diretrizes institucionais do Committee for the Care and Use of Laboratory Animals.

1. Síntese de peptídeos

  1. Inchar 100 mg de resina 4-metilbenzidrilamina (MBHA) (capacidade de carga de 0,37 mmol/g) em 1 mL de N-metil-2-pirrolidona (NMP) por 30 min sob borbulhamento leve de N2.
  2. Preparar um tampão de reserva fresco constituído por aminoácidos protegidos contra Fmoc (5,0 equiv), HCTU (4,9 equiv) e DIPEA (10,0 equiv) em 1 ml de NMP e adicionar à resina (100 mg). Permitir que a reação de acoplamento prossiga por 1,5-2 h.
  3. Preparar tampão de desproteção consistindo de 50% (vol/vol) de morfolina em NMP. Lavar a resina (100 mg) 2 x 30 min com 1 mL do tampão de desproteção em cada lavagem para remover o grupo Fmoc no grupo amina. Lavar a resina com diclorometano (CMD; 1 mL) por 1 min, retirar a CMD e lavar novamente a resina com NMP (1 mL) por mais 1 min. Em seguida, retire o NMP e lave novamente a resina com DCM por 1 min.
    NOTA: Todos os procedimentos de lavagem são realizados sob borbulhamento suave de N2 . Os procedimentos acima são repetidos até o último aminoácido.
  4. Para adicionar o ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetracético (DOTA) ao peptídeo, pré-ative o DOTA com cloridrato de N-(3-dimetilaminopropil)-N-etilcarbodiimida (EDC· HCl) e N-hidroxisuccinimida (NHS). Incubar o buffer de estoque de DOTA/EDC· HCl/NHS a uma razão molar de 1:1:1 em dimetilsulfóxido (DMSO) por 3 h, com uma concentração final de DOTA de 1 M. Em seguida, adicione o tampão de estoque (1 mL) à resina (100 mg) e deixe a reação prosseguir por 2 h com borbulhamento suave de N2.
    NOTA: O ácido 1,4,7-triazaciclononano-1,4,7-triacético (NOTA) também pode ser utilizado como quelante para a complexação com 68Ga. Os mesmos procedimentos podem ser utilizados para acoplamento NOTA.
  5. Enxágue bem a resina do topo usando DCM e aplique um vácuo para remover a solução de reação residual simultaneamente. Enxaguar a resina 3x usando DCM (1,5 mL) e, em seguida, enxaguar com MeOH (1,5 mL) para encolher a resina. Coloque a resina sob nitrogênio durante a noite, ou sob alto vácuo por pelo menos 4 h, até que a resina fique seca.
  6. Coloque a resina seca contendo peptídeo DPA em um recipiente de polipropileno de 2 mL com tampa de rosca. Adicione o cocktail de clivagem apropriado (95/2,5/2,5 TFA/TIS/H2O em volume; 1 mL/100 mg de resina) e sele bem o recipiente com uma tampa de rosca. Agitar suavemente a reacção num agitador orbital num exaustor a 20-25 °C durante 2 h.
    CUIDADO: Prepare o ácido trifluoroacético (TFA) em uma capela usando roupas de proteção, devido à sua natureza altamente corrosiva.
  7. Remova a maior parte do TFA por evaporação sob nitrogênio no exaustor. Precipitar os peptídeos adicionando éter dietílico (~1,5 mL/100 mg de resina).
  8. Vórtice a mistura para triturar os peptídeos e centrifugar à temperatura ambiente (10.000 × g, 5 min). Despeje cuidadosamente o solvente para fora do recipiente. Repita as etapas 1.7-1.8.
  9. Seque o resíduo ao ar no recipiente aberto por 10 min. Adicionar 50% (vol/vol) de acetonitrila aquosa e vórtice por 1-2 s para dissolver os produtos (1 mL/100 mg de resina).
  10. Retire a resina filtrando a mistura e, em seguida, lave a resina 2x usando 0,2 mL de acetonitrila aquosa a 50% (vol/vol). Misturar os filtrados para purificação por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Use as seguintes condições de HPLC. Coluna: YMC-Triat-C18 (4,6 mm de diâmetro interno [i.d.], 150 mm, 5 mm); gradiente de solvente: água desionizada com solvente A; solvente B-acetonitrila (TFA 0,1%); tempo de fluxo: 20 min, com acetonitrila de 10% a 90%; vazão: 1 mL/min.
  11. Congelar os eluentes de HPLC coletados durante a noite a -80 °C e liofilizar (-50 °C e <1 pa). Para a marcação radioativa, dissolver o peptídeo sólido em tampão acetato de sódio (100 mM, pH 5,0) em uma concentração final de 1 mg/mL como tampão de estoque.

2. Radiomarcação de 68Ga

NOTA 68Ga foi gerado internamente no Nanjing First Hospital (Nanjing, China) usando um gerador de 68Ge/68Ga.

  1. Pipetar 5 μL de tampão de estoque para um recipiente de polipropileno de 1,5 mL com tampa de rosca. Adicionar 200 MBq [68Ga]GaCl3 (400 μL) ao recipiente.
  2. Vórtice a mistura por 5 s. Meça o pH usando tiras de teste de pH. Ajustar o pH para 4-4,5 com NaOH (0,1 M).
    NOTA: Um pH adequado é crítico para a complexação entre 68Ga e DOTA.
  3. Incubar a solução à temperatura ambiente durante 5-10 min. Submeter a mistura de reacção a radio-HPLC para análise do rendimento de radiomarcação nas seguintes condições: coluna: YMC-Triat-C18 (4,6 mm d.i., 150 mm, 5 mm); gradiente de solvente: água desionizada com solvente A; solvente B-acetonitrila (TFA 0,1%); tempo de fluxo: 20 min, com acetonitrila de 10% a 90%; vazão: 1 mL/min.
    NOTA: A cromatografia em camada fina (TLC) de rádio pode ser usada como uma abordagem alternativa para examinar o rendimento da marcação radioativa. O tampão de eluição TLC sugerido é 0,1 M Na3C6H5O7, pH 4.

3. Ensaio de estabilidade do traçador

  1. Teste de estabilidade do traçador em PBS
    1. Adicionar [68Ga]DPA (10 μL, 3,7 MBq, em NaOAc) ao PBS (990 μL). Incubar a 37 °C durante 1, 2 e 4 h com ligeira agitação.
    2. Recolher 200 μL da solução em cada ponto de tempo. Injete-o no rádio-HPLC para análise.
  2. Estabilidade do traçador em soro de camundongo
    1. Adicionar [68Ga]DPA (10 μL, ~3,7 MBq, em NaOAc) ao soro do rato (90 μL, preparado na hora). Incubar a 37 °C durante 1, 2 e 4 h com ligeira agitação.
    2. Recolher 20 μL da solução em cada ponto de tempo. Adicionar MeCN e água (100 μL, 1:1, v/v).
    3. Centrifugar a mistura durante 10 min (5.000 × g, 25 °C). Analise o sobrenadante usando rádio-HPLC.

4. Análise da expressão de PD-L1 por citometria de fluxo

  1. Preparar o meio de cultura suplementando o meio RPMI-1640 com 10% (vol/vol) de soro fetal bovino e 1% de penicilina-estreptomicina (vol/vol). Ressuspender as células U87MG em meio de cultura e semear em placas de 12 poços a uma densidade de 10a 5 células/poço. Colocar as células em estufa (5% CO2, 37 °C) e cultivar durante pelo menos 24 h sem perturbar.
  2. Lavar as células com 0,5 mL de PBS e adicionar 250 μL de tripsina-EDTA (0,25%). Colocar as células de volta na incubadora (5% CO2, 37 °C) durante 2 minutos.
  3. Adicionar 1 mL de meio de cultura para interromper a dissociação celular. Adicione meio às células para desprendê-las das louças, pipetando para cima e para baixo e colete-as em tubos de 1,5 mL. Centrifugar as células durante 5 min (100 × g).
  4. Remover o sobrenadante e ressuspender as células em 1 mL de PBS. Centrifugar as células por 5 min (100 × g). Repita esta etapa mais uma vez.
  5. Diluir o anticorpo PD-L1 conjugado com isotiocianato de fluoresceína (FITC) com albumina de soro bovino (BSA) a 3% a 20 nmol/L. Adicionar às células e incubar a 4 °C durante 1 h.
  6. Centrifugar as células por 5 min (100 × g), seguido de lavagem com PBS frio duas vezes. Analise as células PD-L1-positivas usando citômetro de fluxo e software de análise.

5. Imunocitoquímica

  1. Seme as células U87MG em placas de cultura de células com fundo de vidro (35 mm) a uma densidade de 2,5 × 10a 5 células por poço. Quando atingir 60% de confluência, aspirar o meio de cultura e adicionar 1 mL de PBS. Agite suavemente várias vezes e aspirar. Execute a etapa de lavagem 3x.
  2. Adicione 500 μL de paraformaldeído a 4% aos pratos. Coloque as células à temperatura ambiente e fixe por 30 min.
  3. Lave as células 3x com PBS. Adicionar 1 mL de BSA a 3% (m/vol, em PBS) e bloquear as células fixas por 2 h à temperatura ambiente.
  4. Remover a BSA a 3% e incubar diretamente as células com anticorpo primário anti-PD-L1 (mAb,1:100, diluído em BSA a 3%) durante a noite a 4 °C.
    NOTA: Depois de bloquear as células com BSA, não lave com PBS.
  5. Lave as células 3x com tampão BSA 3%. Incubar as células com o anticorpo secundário IgG Fc humano conjugado com FITC (1:500, diluído em PBS) por 1 h.
  6. Lave as células 3x com PBS. Adicionar 0,5 mL de DAPI (1 μg/mL) às células e incubar à temperatura ambiente por 1 h. Lavar as células coradas 3x com PBS e observar usando microscópio confocal de fluorescência.

6. Experimento de captação e inibição celular

  1. Experimento de captação celular
    1. Cultivar as células U87MG em placas de 12 poços até atingir 80% de confluência. Retire o meio e lave as células com 0,5 mL de PBS.
    2. Diluir o [68Ga]DPA em meio fresco até uma concentração de 74 KBq/ml. Adicionar 0,5 ml do tampão [68Ga]DPA diluído a cada poço.
    3. Incubar as células com [68Ga]DPA a 37 °C por diferentes durações (10, 30, 40 e 120 min). Aspirar o meio usando uma pipeta. Lavar as células com PBS (0,5 mL) três vezes.
    4. Adicionar solução de NaOH (0,5 M, 300 μL por poço) para lisar as células. Após 30 s, coletar os lisados de células viscosas em tubos de 1,5 mL.
    5. Lave a placa com 0,4 mL de PBS duas vezes. Recolher a solução de lavagem no tubo de 1,5 ml acima.
    6. Ligue o computador embutido do contador gama automático; Coloque os tubos na prateleira embutida. Depois de carregar todas as amostras no transportador, pressione o botão START. Os resultados são calculados no software interno. A leitura registra as contagens por minuto (CPM) correlacionadas ao decaimento de cada tubo.
  2. Ensaio de vinculação competitiva
    1. Cultivar as células U87MG em placas de 12 poços até atingir 80% de confluência. Retire o meio e lave as células com 0,5 mL de PBS.
    2. Diluir [68Ga]DPA em meio fresco até uma concentração de 74 KBq/mL. Dissolver uma quantidade adequada de compostos BMS202 em DMSO a 10% para produzir uma concentração de 10 mM (400 μL).
    3. Diluir 4 μL de 10 mM BMS202 em 396 μL de PBS para obter uma concentração de 100 μM. Repita esta etapa para obter várias concentrações de BMS202 (1 μM, 10 nM, 100 pM e 1 pM).
    4. Adicionar 0,5 mL do tampão [68Ga]DPA diluído a cada poço (0,37 MBq por poço). Adicionar 5 μL das soluções BMS202 a cada poço (três poços para cada concentração). Incubar as células numa incubadora a 37 °C durante 120 minutos.
    5. Aspirar o meio usando uma pipeta. Lave as células com 3 x 0,5 mL de PBS.
    6. Adicionar a solução de NaOH (0,5 M, 300 μL por poço) para lisar as células. Após 30 s, coletar os lisados de células viscosas em tubos de 1,5 mL. Lave a placa com 2 x 0,4 mL de PBS.
    7. Recolher a solução de lavagem no tubo de 1,5 ml acima. Coloque os tubos na prateleira embutida do contador gama automático.
    8. Siga os mesmos procedimentos da etapa 6.1.6.

7. Imagem por PET

OBS: Realizar imagens PET de pequenos animais, utilizando um micro scanner PET que fornece 159 cortes axiais transversais espaçados de 0,796 mm (centro a centro), com campo de visão horizontal de 10 cm e campo de visão axial de 12,7 cm. Todos os dados coletados no modo lista são organizados em sinogramas tridimensionais. O Fourier é então remontado em sinogramas bidimensionais (quadro × min: 4 × 1, 8 × 2, 8 × 5).

  1. Use camundongos machos BALB/C nus de 5-8 semanas de idade neste estudo. Recolher as células U87MG seguindo os passos 4.1-4.4 e aspirar as células para uma seringa de 0,5 ml. Injetar as células por via subcutânea nos camundongos (1 × 106 células por tumor, dois tumores por camundongo). Monitorar o crescimento tumoral após injeção até que o volume tumoral seja de 100-300 mm3.
  2. Anestesiar os camundongos com isoflurano a 1%-2% (v/v) (1 mL/min). Ligue o dispositivo de aquecimento e mantenha a cama do animal de PET a 37 °C.
  3. Coloque os ratos anestesiados na posição correta no leito animal da máquina PET. Aplique pomada oftálmica em ambos os olhos para evitar o ressecamento.
    CUIDADO: Mantenha os ratos na posição prona para evitar a morte durante o exame. Durante todo o processo de aquisição de imagens, administrar fluxo de isoflurano (1,0 mL/min) pelo nariz usando um tubo pré-instalado.
  4. Ajuste a posição da cama do animal através do painel de controle. Injetar os traçadores (10-17 MBq/100-200 μL) por via intravenosa através de um cateter venoso caudal pré-instalado.
  5. Criar um fluxo de trabalho de digitalização em um computador host usando o software referenciado (consulte Tabela de Materiais) Crie uma pasta de estudo e defina o protocolo de aquisição de acordo com o protocolo do fabricante. Execute varreduras dinâmicas (60 min para cada mouse) em todos os mouses no modo de lista 3D.
  6. Definir um protocolo de histograma e um protocolo de reconstrução seguindo o protocolo do fabricante. Use o filtro de Hanning com um corte de Nyquist de 0,5 ciclo/pixel para reconstruir imagens dinâmicas PET (25-30 min e 55-60 min) através de retroprojeção filtrada. Gere imagens de projeção de intensidade máxima (MIP) para todos os mouses.
  7. Combine os protocolos em um fluxo de trabalho e execute o fluxo de trabalho. Analise as imagens tridimensionais resultantes utilizando o software, seguindo o protocolo do fabricante.
    NOTA: Use o software de simulação para selecionar os volumes de interesse. A radioatividade é corrigida para o tempo de injeção e apresentada como a porcentagem da dose total de injeção/por grama de tecido (% ID/g).

8. Biodistribuição ex vivo

  1. Administrar [68Ga]DPA (1,85 MBq/100 μL) aos camundongos BALB/C nude portadores de U87MG através de injeção na veia caudal. Anestesiar os camundongos usando isoflurano a 1%-2% (v/v) (1 mL/min) e, em seguida, sacrificar três camundongos via deslocamento cervical após a injeção por 5, 30, 60 e 120 min.
    OBS: Os indivíduos que demonstram este procedimento devem ser treinados nas habilidades técnicas de luxação cervical para garantir que a perda de consciência seja rapidamente induzida. Isso garantirá que os procedimentos de eutanásia neste experimento sejam todos realizados humanamente.
  2. Após a confirmação da morte, abra a parede torácica dos camundongos. Em seguida, abra o coração. Use uma seringa de 1 mL para extrair sangue; Esprema o sangue da seringa para um tubo de radioimunoensaio (RIE) (13 mm de diâmetro) para o contador gama.
  3. Excisar os principais órgãos e tumores e colocá-los em tubos de RIA (13 mm de diâmetro) para o contador gama. Os principais órgãos incluem o sangue total, coração, timo, fígado, baço, osso, estômago, rins, músculo, linfonodo intestinal, intestino delgado, pâncreas, testículo, cérebro e pulmões. Pese todos os órgãos.
  4. Meça a radioatividade dentro dos órgãos coletados usando um contador autogama e corrija os valores. Calcular a percentagem de dose injectada por grama de tecido húmido (% ID/g).

9. Imuno-histoquímica

  1. Colete os tecidos de glioma e lave-os 3x com PBS. Colocar os tecidos frescos em paraformaldeído a 4% e fixar durante a noite a 4 °C.
  2. Embutir os tecidos fixados em parafina e seccioná-los até uma espessura de 10 μm. Colocar as secções numa incubadora (60 °C) e incubar durante 2 h. Desencenar e hidratar as seções incubando por 10 min cada uma: xileno (duas vezes), álcool absoluto, álcool 95%, álcool 90%, álcool 80%, álcool 75%.
  3. Colocar as secções em citrato de sódio 0,01 M e aquecê-las a 92-95 °C. Manter a temperatura por 40 min para obter a recuperação do antígeno.
  4. Adicionar 200 μL de solução de H2O2 (3%) aos cortes e inativar as endoperoxidases por 10 min à temperatura ambiente. Bloquear os locais inespecíficos por tratamento com BSA 3% por 2 h à temperatura ambiente.
  5. Incubar as secções em anticorpo primário anti-PD-L1 (mAb, 1:100, diluído em BSA a 3%) durante a noite a 4 °C.
    NOTA: Após o bloqueio com BSA, não lave com PBS.
  6. Lave as seções 3x com PBS. Incubar as secções com o anticorpo secundário de cabra anticoelho marcado com HRP (1:500, diluído em PBS) à temperatura ambiente durante 1 h.
  7. Lave as células 3x com PBS. Adicionar 200 μL de solução de trabalho de 3,3-diaminobenzidina (DAB) (solução A: solução B: solução C = 1:1:18) às secções e incubar durante 5 minutos no escuro.
  8. Lave as seções 3x com PBS. Adicionar 500 μL de solução de hematoxilina (100%) e incubar por 5 min à temperatura ambiente. Lave as seções com água por 30 s. Colocar as secções em solução de diferenciação (álcool a 75%:HCL = 99:1) durante 30 s. Lave as seções com água por 1 min.
  9. Desidratar as amostras incubando sequencialmente com álcool 75%, álcool 80%, álcool 90%, álcool 95%, álcool absoluto e xileno (duas vezes) (10 min cada). Monte todas as seções usando resina neutra e observe-as sob um microscópio óptico.

Resultados

[68Ga]DPA radiomarcação e estabilidade
O peptídeo modelo, DPA, é um antagonista efetivo da PD-L1. O DOTA-DPA foi obtido com pureza de >95% e rendimento de 68%. A massa de DOTA-DPA é observada experimentalmente em 1.073,3 ([M+2H]2+). 68ºO gálio é considerado um radionuclídeo adequado para marcar peptídeos para imagens de PET e, portanto, foi escolhido para este estudo. Para marcação radioativa de DPA com 68Ga (mei...

Discussão

As etapas críticas descritas neste método incluem a marcação eficiente de 68Ga para DPA e a escolha de uma janela de tempo adequada para a imagem por PET, que deve corresponder perfeitamente ao padrão farmacodinâmico de DPA no tumor.

Em contraste com a IHQ, a imagem por PET permite a detecção em tempo real da expressão de PD-L1 de corpo inteiro de forma não invasiva, permitindo a visualização de cada área positiva em um tumor heterogêneo6,7.

Divulgações

Não são declarados interesses concorrentes.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado pelo Fundo do Instituto Central de Pesquisa sem fins lucrativos da Academia Chinesa de Ciências Médicas (nº 2022-RC350-04) e pelo Fundo de Inovação CAMS para Ciências Médicas (nº 2021-I2M-1-026, 2022-I2M-1-026-1, 02120101, 02130101 e 2022-I2M-2-002).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (DOTA)Merck60239-18-168Ga  chelation
3,3-diaminobenzidine (DAB) KitSigma-AldrichD7304-1SETImmunohistochemistry
anti-PD-L1 monoclonal antibodyWuhan Proteintech17952-1-apImmunohistochemistry: primary antibody
BMS202Selleck1675203-84-5Competitive binding assay: inhibitor
BSAMerckV900933Immunofluorescent : blocking 
DAPIMerckD9542Immunofluorescent: staining of nucleus
Dichloromethane (DCM)Merck34856Solvent
DIPEAMerck3439Peptide coupling
EDC·HClMerckE6383Activation of DOTA
FBSGibco10099Cell culture: supplement
FITC-conjugated anti-human IgG Fc AntibodyBiolegend409310Immunofluorescent: secondary antibody
FITC-conjugated anti PD-L1 antibodyBiolegend393606Flow cytometry: direct antibody
HCTUEnergy ChemicalE070004-25gPeptide coupling
HRP labeled goat anti-rabbit antibodyServicebioGB23303Immunohistochemistry: secondary antibody
Hydroxysuccinimide (NHS)Merck130672Activation of DOTA
MeCNMerckPHR1551Solvent
MorpholineMerck8.06127Fmoc- deprotection
NMPMerck8.06072Solevent
ParaformaldehydeMerck30525-89-4Fixation of tissues
PBSGibco10010023Cell culture: buffer
Penicillin-streptomycin Gibco10378016Cell culture: supplement
RIA tubePolyLabP10301AAs tissue sample container
RPMI-1640 mediumGibco11875093Cell culture: basic medium
Sodium acetateMerck1.06264Salt for buffer
Trypsin-EDTAGibco25200056Cell culture: dissociation agent
U87MG cell lineProcell Life Science & Technology CoCL-0238Cell model
Equipment
68Ge/68Ga generatorIsotope Technologies Munich, ITMNot applicableGeneration of [68Ga]
Autogamma counterPerkin Elmer Wizard2Detection of radioactivity
Confocal fluorescent microscopyKeyenceObservation of immunofluorescent results
Flow cytometerBecton Dickinson, BDLSRIIMonitoring the PD-L1 positive cells
High-performance liquid chromatography (HPLC)SHIMAZULC-20AT Purification of DPA peptide
PET scannerSiemens Medical SolutionsInveon MultiModality SystemPET imaging
Optical microscopyNikon Eclipse E100Observation of immunohistochemistry results
Solid phase peptide synthesizerPromega Vac-Man Laboratory Vacuum ManifoldLOT#11101Synthesis of DPA-DOTA peptide
Software
ASIProSiemens Medical SolutionsNot applicableAnalysis of PET-CT results
FlowJoBecton Dickinson, BDFlowJo 7.6.1Analysis of the flow cytometer results
Inveon Acquisition Workplace (IAW)Siemens Medical SolutionsNot applicableManagement of PET mechine
PrismGraphpadPrism 8.0Analysis of the data 

Referências

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