Otimização da Tecnologia de Processamento para Tiebangchui com Zanba Baseado no CRITIC Combinado com o Método de Superfície de Resposta Box-Behnken

Resumo

O presente protocolo descreve um método eficiente e padrão de processamento de destoxificação para Tiebangchui frito com Zanba usando CRITIC combinado com o método de superfície de resposta Box-Behnken.

Resumo

A raiz seca de Aconitum pendulum Busch., chamada Tiebangchui (TBC) em chinês, é um dos medicamentos tibetanos mais famosos. É uma erva amplamente utilizada no noroeste da China. No entanto, muitos casos de intoxicação têm ocorrido devido à intensa toxicidade do CBT e porque suas doses terapêuticas e tóxicas são semelhantes. Portanto, encontrar um método seguro e eficaz para reduzir sua toxicidade é uma tarefa urgente. Uma pesquisa através dos clássicos da medicina tibetana mostra que o método de processamento de TBC frito com Zanba foi registrado no "Processing specification of Tibetan medicine of Qinghai Province (2010)". No entanto, os parâmetros específicos de processamento ainda não estão claros. Assim, este trabalho tem como objetivo otimizar e padronizar a tecnologia de processamento do CBT Zanba-refogado.

Primeiramente, foi conduzido um experimento unifatorial com quatro fatores: espessura de corte do CBT, quantidade de Zanba, temperatura e tempo de processamento. Com os teores de alcaloide monoéster e diéster em TBC Zanba-stir-fried como índices, CRITIC combinado com o método de superfície de resposta Box-Behnken foi usado para otimizar a tecnologia de processamento de Zanba-stir-fried TBC. As condições otimizadas de processamento do TBC frito de Zanba foram uma espessura de corte de TBC de 2 cm, três vezes mais Zanba do que TBC, uma temperatura de processamento de 125 °C e 60 min de fritura. Este estudo determinou as condições de processamento otimizadas e padronizadas para o uso do TBC Zanba-stir-fried, fornecendo assim uma base experimental para o uso clínico seguro e produção industrial do Zanba-stir-fried TBC.

Introdução

A raiz seca de Aconitum pendulum Busch e A. flavum Hand.-Mazz., um dos mais famosos medicamentos tibetanos, é chamada de Tiebangchui (TBC) em chinês ^1,2. As raízes secas do TBC são úteis para dissipar o frio e o vento, reduzir a dor e acalmar o choque. Foi registrada no primeiro volume de "Drug Standards (Tibetan Medicine) do Ministério da Saúde da República Popular da China", que afirma que as raízes secas de TBC são comumente usadas para tratar artrite reumatoide, contusões e outras doenças do resfriado³. No entanto, a dose terapêutica clínica do CBT é semelhante à sua dose tóxica, e incidentes de intoxicação ou morte têm sido frequentemente relatados devido ao uso inadequado⁴. Portanto, reduzir a toxicidade e preservar a eficácia do TBC tornou-se um ponto quente de pesquisa ao longo dos anos.

Na medicina tibetana, o processamento é um dos métodos mais eficazes para atenuar a toxicidade do TBC. De acordo com a "Especificação de processamento da medicina tibetana da província de Qinghai (2010)", as ervas originais (TBC) devem ser colocadas em uma panela de ferro e fritas com Zanba até que o Zanba fique amarelo, após o que o Zanba é removido e as ervas são secas ao ar ^5,6. No entanto, nenhum parâmetro de processo específico foi documentado, o que dificulta o controle da tecnologia de processamento e da qualidade do TBC frito com Zanba. O método CRITIC é um método objetivo de ponderação que pode evitar a fuzzificação e a subjetividade, além de aumentar a objetividade da pesagem⁷. O método de superfície de resposta de Box-Behnken pode refletir diretamente a interação entre cada fator através do ajuste polinomial⁸. A combinação da superfície de resposta Box-Behnken e do método CRITIC é comumente utilizada para otimizar a tecnologia de processamento para adquirir^{o protocolo de} processamento otimizado9,10. Neste trabalho, um alcaloide monoéster-diterpenóide (MDA) (benzoilacenitina) e dois alcaloides diéster-diterpenóides (DDAs) (aconitina, 3-desoxiaconitina) foram utilizados como índices de avaliação. O CRITIC combinado com o método de superfície de resposta Box-Behnken foi aplicado para otimizar a tecnologia de processamento de TBC frito de Zanba e estabelecer um método de processamento padrão para uso clínico seguro.

Protocolo

O método de processamento de TBC Zanba-stir-fried foi otimizado e padronizado pelo CRITIC combinado com o método de superfície de resposta Box-Behnken. Benzoylaconitina, aconitina e 3-desoxiaconitina foram utilizadas como índices de avaliação durante esse procedimento.

1. Preparação da solução da amostra

1. Preparar a solução-mãe da substância de referência. Pesar precisamente 9,94 mg de benzoilacenitina, 8,49 mg de aconitina e 6,25 mg de 3-desoxiaconitina (Tabela de Materiais) em uma balança analítica eletrônica e colocá-los em um balão volumétrico de 10 mL. Em seguida, adicione a solução de metanol de ácido clorídrico a 0,05% para dissolver os sólidos e completar o volume para 10 mL. Finalmente, agitar bem a mistura para obter a solução estoque da substância de referência com concentrações em massa de 0,9940 mg/mL de benzoilacenitina, 0,8490 mg/mL de aconitina e 0,6250 mg/mL de 3-desoxiaconitina.
   CUIDADO: O ácido clorídrico é um material altamente corrosivo¹¹. Use proteção adequada, como luvas, jaleco, óculos e capuz.
2. Prepare a solução de amostra de teste.
   1. Pesar 2 g de Zanba-stir-fried TBC pó num balão cónico.
      1. Prepare o TBC frito de Zanba pesando 30 g de TBC (2 cm) e 90 g de Zanba e adicionando-os à máquina de fritar pré-aquecida. Ajuste o tempo e a temperatura da máquina de fritar para 40 min e 140 °C, respectivamente. Configure a máquina para concluir o processamento.
      2. Use uma máquina de esmagamento de alta velocidade para moer o TBC frito de Zaba separadamente em amostras de pó que podem passar por uma peneira de 50 malhas (0,355 mm).
   2. Adicionar 3 mL de solução de amônia e 50 mL de solução mista de álcool isopropílico e acetato de etila (proporção de 1:1 v/v) no balão cônico supracitado, com base em estudos anteriores^12,13.
      NOTA: Para preparar a solução de amoníaco, adicionar 40 ml de solução concentrada de amoníaco num balão volumétrico de 100 ml e encher com água purificada até à linha de medição. Tome medidas de proteção apropriadas ao usar solução de amônia concentrada, pois tem um cheiro forte.
   3. Pesar a amostra acima e o frasco cónico e registar o peso. Ultrasonicate por 30 min (tensão: 220 V, frequência: 40 kHz).
      NOTA: Os alcaloides aconitina são facilmente decompostos pelo calor. Assim, a temperatura de extração ultra-sônica deve ser inferior a 25 °C.
   4. Pesar a amostra e o balão cónico após extracção ultra-sónica.
   5. Compensar o peso perdido adicionando uma mistura de álcool isopropílico e acetato de etila (proporção de 1:1 v/v).
   6. Filtre a solução de amostra. Evaporar 25 ml do filtrado até à secura utilizando um evaporador rotativo a 40 °C.
   7. Dissolver o resíduo adicionando 5 mL de solução de metanol de ácido clorídrico a 0,05%, filtrar a solução através de um filtro de seringa de 0,2 μm e analisá-la por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC).
3. Preparar uma solução de referência mista que contenha 0,1988 mg/ml de benzoilacenitina, 0,0509 mg/ml de aconitina e 0,0938 mg/ml de 3-desoxiaconitina.
   NOTA: Cada padrão (0,9940 mg de benzoilacenitina, 0,2545 mg de aconitina e 0,4690 mg de 3-desoxiaconitina) é dissolvido em um balão volumétrico de 5 mL em metanol de ácido clorídrico a 0,05% como meio de dissolução.
4. Preparar 0,04 M de tampão acetato de amónio dissolvendo 6,16 g de acetato de amónio (Tabela de Materiais) em 2 L de água ultrapura (fase móvel A). Ajustar o pH para 8,50 usando amônia.
   CUIDADO: A amônia é um material perigoso. Use proteção adequada, como luvas, jaleco, óculos e capuz.
5. Filtrar 2 L de acetonitrila ultrapura 100% (fase B móvel) e desgaseificá-la.
   CUIDADO: A acetonitrila é um material perigoso¹³. Use proteção adequada, como luvas, jaleco, óculos e capuz.

2. Condição cromatográfica

1. Injetar 10 μL das soluções de amostra pré-tratadas em um sistema HPLC com bombas binárias. Use um sistema HPLC empregando uma coluna ODS-3 (5 μm x 4,6 mm x 250 mm; trabalhando a 30 °C) com fases móveis A e B para a separação MDA e DDAs. Injetar cada amostra três vezes para replicação técnica.
2. Programe o método conforme mostrado na Tabela 1 para a coluna ODS-3. Defina uma taxa de fluxo de 1,0 mL/min e o comprimento de onda de detecção como 235 nm.
3. Registre as áreas de pico de cada composto alvo.
   NOTA: Detalhes dos instrumentos podem ser encontrados na Tabela de Materiais.

3. Teste de adaptabilidade do sistema

NOTA: Consulte a secção 2 para obter as condições cromatográficas para executar os passos 3.1-3.5.

1. Investigar a relação linear entre a concentração e a área do pico.
   1. Preparar várias concentrações - 19,88, 39,76, 59,64, 159,04, 198,80 e 497,00 μg/mL - de solução de benzoilaconitina.
   2. Preparar várias concentrações - 8,49, 16,98, 25,47, 33,96, 50,94 e 169,80 μg/mL - de solução de aconitina.
   3. Preparar várias concentrações - 1,875, 12,50, 37,50, 62,50, 93,75 e 125,00 μg/mL - de solução de 3-desoxiaconitina.
   4. Injetar as soluções de referência acima de baixa concentração de massa para alta concentração de massa e registrar as áreas de pico.
   5. Obter três equações de regressão linear a partir do gráfico da concentração da solução de referência (μg/L) contra a área do pico.
      NOTA: Certifique-se de que as concentrações de benzoylaconitina, aconitina e 3-desoxiaconitina estão dentro do intervalo linear desta curva padrão.
2. Efectuar ensaios de precisão injectando continuamente seis repetições de 10 μL da solução da amostra no sistema HPLC e executar as amostras nas mesmas condições de HPLC descritas no ponto 2. Registrar as áreas de pico de benzoilacenitina, aconitina e 3-desoxiaconitina.
3. Realizar experimentos de teste de estabilidade injetando 10 μL da solução da amostra preparada e determinar as áreas dos picos após 0 h, 2 h, 4 h, 8 h, 12 h e 24 h.
   NOTA: As áreas de pico são registadas automaticamente pelo sistema HPLC referenciado. Esses momentos foram baseados na literatura pertinente^15,16,17.
4. Efectuar o ensaio de reprodutibilidade tomando o mesmo lote de TBC frito com zanba para preparar seis soluções de amostra de ensaio em paralelo, de acordo com o método da etapa 1.2. Injectar 10 μL de cada amostra no sistema HPLC e executar as amostras conforme descrito no ponto 2.
   OBS: A reprodutibilidade foi avaliada comparando-se as diferenças de concentração entre as seis amostras.
5. Realizar o experimento de recuperação preparando seis porções do mesmo lote de TBC frito com zanba para a solução de teste. Em seguida, adicione ~100% da substância de referência de cada componente do índice em seis porções da solução de teste para calcular a taxa de recuperação. Injectar estas amostras (10 μL) no sistema HPLC nas mesmas condições descritas no ponto 2 e calcular a taxa de recuperação utilizando a equação (1):
   (1º)
   NOTA: Na Eq. (1), A é a quantidade do componente a medir na solução de ensaio, B é a quantidade de substância de referência adicionada e C é o valor medido da solução que contém a substância de referência e a amostra de TBC frita de Zanba.

4. Experimentos unifatoriais

1. Comparação da espessura de corte
   1. Preparar cinco grupos para testes, cada um com 30 g de CBT, onde a espessura da CBT é de 0,5, 1, 2, 3 e 4 cm, respectivamente. Pesar uma quantidade de Zanba que é três vezes maior que a de TBC (90 g).
      NOTA: TBC é tóxico. Use proteção adequada, como luvas, jaleco, óculos e exaustor, e tenha cuidado durante o processo de corte. Através do pré-experimento, verificou-se que foi necessária três vezes a quantidade de Zanba para o contato completo entre CBT e Zanba. Portanto, no delineamento experimental formal, o estudo selecionou três vezes a quantidade de Zanba ao examinar a espessura de corte.
   2. Ajuste a temperatura e o tempo da máquina de fritura automática para 140 °C e 40 min, respectivamente.
   3. Adicione ~30 g de TBC e 90 g de Zanba na máquina depois que a máquina de fritar automática tiver aquecido até a temperatura definida.
   4. Prepare as soluções de amostra seguindo a etapa 1.2. Calcular os teores de MDA e DDAs em diferentes produtos de processamento de acordo com a curva padrão (Tabela 2). Calcule a pontuação abrangente com base nos resultados através do método CRITIC na secção 6.
   5. Desta forma, compare as quantidades de Zanba, bem como as temperaturas e tempos de processamento para otimização das condições.
2. Comparação da quantidade de Zanba
   1. Realizar cinco grupos de testes, cada um com 30 g de CBT (2 cm), onde a quantidade de Zanba é uma, duas, três, quatro e cinco vezes maior que a CBT, respectivamente.
   2. Ligue a máquina de fritar para processamento. Ajuste o tempo e a temperatura da máquina de fritar em 40 min e 140 °C.
   3. Prepare as soluções de amostra seguindo a etapa 1.2. Calcular o teor de MDA e DDAs em diferentes produtos de processamento de acordo com a curva padrão (Tabela 2). Calcule a pontuação abrangente com base nos resultados através do método CRITIC na secção 6.
3. Comparação da temperatura de processamento
   1. Realizar cinco grupos de testes, cada um com 30 g de CBT (2 cm) e 90 g de Zanba.
   2. Ligue a máquina de fritar para processamento. Ajuste a temperatura de processamento para 100 °C, 120 °C, 140 °C, 160 °C e 180 °C. Defina o tempo de processamento como 40 min.
      NOTA: Através de pré-experimentos, verificou-se que a velocidade de amarelecimento do Zanba é muito baixa quando a temperatura de processamento está abaixo de 100 °C, e o Zanba é fácil de queimar e ficar preto se a temperatura for muito alta (acima de 180 °C). Portanto, 100 °C e 180 °C foram definidos como valores mínimo e máximo de temperatura durante o processamento, respectivamente.
   3. Prepare as soluções de amostra seguindo a etapa 1.2. Registre as áreas de pico do MDA e DDAs. Calcular o teor de MDA e DDAs em diferentes produtos de processamento de acordo com a curva padrão (Tabela 2). Calcule a pontuação abrangente com base nos resultados através do método CRITIC na secção 6.
      NOTA: O experimento envolve altas temperaturas de 160 °C e 180 °C. Preste atenção à segurança durante o experimento, de acordo com o código de segurança do laboratório.
4. Comparação do tempo de processamento
   1. Realizar cinco grupos de testes, cada um com 30 g de CBT (2 cm) e 90 g de Zanba.
   2. Ligue a máquina de fritar para processamento. Defina o tempo de processamento para 20, 40, 60, 80 e 100 min. Ajuste a temperatura para 140 °C.
   3. Prepare as soluções de exemplo seguindo a descrição na etapa 1.2. Registre as áreas de pico do MDA e DDAs. Calcular a qualidade do MDA e DDAs em diferentes produtos de processamento de acordo com a curva padrão (Tabela 2). Calcule a pontuação abrangente com base nos resultados através do método CRITIC na secção 6.

5. Otimização da tecnologia de processamento de TBC frito com Zanba usando metodologia de superfície de resposta (RSM)

1. Design de superfície de resposta Box-Behnken
   1. Determinar a faixa de espessura de corte (A, 1-3 cm), a quantidade de Zanba (B, 2-4x), a temperatura de processamento (C, 100-140 °C) e o tempo de processamento (D, 40-80 min) por experimentos preliminares usando testes de fator único (etapa 4.1-4.4).
      NOTA: Os valores codificados de quatro variáveis e seus níveis são mostrados na Tabela 3. Três níveis de cada variável foram codificados como -1, 0 e 1.
2. Utilizar software para gerar a matriz e analisar os modelos de superfície de resposta.
   Observação : as capturas de tela para o uso do software são mostradas no arquivo suplementar 1.
   1. Use um delineamento Box-Behnken de três níveis e quatro fatores, composto por 24 experimentos (como feito neste estudo), e meça cinco réplicas (ordem de execução 1, 9, 14, 16 e 25) para calcular a soma dos quadrados do erro puro (Tabela 4). Defina a pontuação abrangente (Y) como resposta (etapas 1-4, Arquivo Suplementar 1).
      1. Na página inicial, clique em Novo Design (etapa 1, Arquivo Suplementar 1) e, no painel esquerdo da página Design , clique em Superfície de Resposta | Box-Behnken e definir os parâmetros dos quatro fatores na tabela (passo 2, Arquivo Suplementar 1).
      2. Clique em Avançar (etapa 2, Arquivo Suplementar 1), defina os nomes das respostas e clique em Concluir (etapa 3, Arquivo Suplementar 1).
      3. Gere o design da superfície de resposta através da operação acima (etapa 4, Arquivo Suplementar 1).
3. Complete o experimento com base nos 29 cenários projetados para a superfície de resposta.
4. Prepare as soluções de amostra seguindo a etapa 1.2.
5. Registre as áreas de pico do MDA e DDAs.
   NOTA: As áreas de pico são registadas automaticamente pelo sistema HPLC referenciado.
6. Calcular a qualidade do MDA e DDAs nos diferentes produtos de processamento.
7. Calcule a pontuação abrangente com base nos resultados através do método CRITIC na etapa 6.
   Observação : O método específico é ilustrado na etapa 6.
8. Insira a pontuação abrangente obtida de 29 tentativas no computador e analise-a usando o software referenciado (passo 5, Arquivo Suplementar 1).
9. Realizar a validação estatística das equações polinomiais e análises de superfície de resposta plotadas em gráficos de modelo 3D através do software (passos 6-8, Arquivo Suplementar 1).
   1. No painel de navegação esquerdo, em Análise (+), clique em Y e, em seguida, clique em Iniciar análise na janela Configurar (etapa 6, Arquivo Suplementar 1).
   2. Clique em ANOVA no menu superior e observe a tabela de resultados exibindo a análise de variância (passo 7, Arquivo Suplementar 1).
   3. No menu superior, clique em Gráficos de Modelo e, em seguida, em Superfície 3D para obter os gráficos de superfície de resposta refletindo os efeitos dos parâmetros de processamento sobre os escores sintéticos (etapa 8, Arquivo Suplementar 1).
10. Realizar a validação do modelo de superfície de resposta em triplicata sob as condições ótimas previstas (etapa 9, Arquivo Suplementar 1) para verificar a estabilidade da tecnologia de processamento. No painel de navegação esquerdo, em Otimização, clique em Numérico e, no menu superior, clique em Soluções. Observe as condições ótimas previstas.

6. Avaliação do modelo

NOTA: Esta etapa deve ser executada após a conclusão de cada experimento de fator único ou experimento de superfície de resposta. Após cada experimento (por exemplo, comparação da espessura de corte) ser concluído, o conteúdo de MDA e DDAs nas diferentes amostras é medido para obter cinco conjuntos de dados, de acordo com as etapas 1.2 e 2. Os dados são apresentados na Tabela Suplementar S1.

1. Processamento adimensional do índice
   Observação : esta etapa transforma o valor medido (X_ij) em um valor relativo adimensional, para que o valor de cada índice esteja no mesmo nível de quantidade. Essa operação pode facilitar a análise e a comparação abrangentes de indicadores em diferentes unidades ou ordens de grandeza¹⁸. Para fins de ilustração, foram utilizados valores de espessura de corte para os cálculos mostrados a seguir (Tabela Suplementar S1).
   1. Padronizar o conteúdo do MDA (obter y_MDA; MDA refere-se à benzoilacenitina) usando a fórmula na Eq. (2).
      NOTA: O índice "i" representa um dos quatro fatores, e a espessura de corte é o primeiro fator investigado. Assim, o valor de i é igual a 1. O índice "j" representa cada nível de fatores; Assim, quando a espessura do corte é o primeiro nível (0,5 cm), j é igual a 1; Quando a espessura do corte é o quinto nível (4 cm), j é igual a 5. Os teores de MDA (X_IJ) nos CBT processados com espessuras de 0,5, 1, 2, 3 e 4 cm foram 0,9693, 1,0876, 1,3940, 1,4185 e 1,3614 mg/g, respectivamente. Assim, x j, max é 1,4185 e x_{j, min é 0,9693}.
      (2º)
      Assim
      Aqui, X_ij é o conteúdo medido do MDA do experimento no i-ésimo fator e no j-ésimo nível; x_{j, min} é o conteúdo mínimo do MDA neste grupo de experimentos; e x_{j, max} é o conteúdo máximo do MDA neste grupo de experimentos. Assim, i = 1, 2, ..., m e j = 1, 2, ..., n.
      NOTA: Assim, os valores padronizados do MDA são 0,0000, 0,2634, 0,9455, 1,0000 e 0,8729 usando a Eq. (2).
   2. Padronizar o conteúdo total dos DDAs (obter_{y DDAs}; DDAs refere-se à aconitina e 3-desoxiacoconitina) usando a fórmula na Eq. (3).
      NOTA: i é um dos quatro fatores, e j é cada nível dos fatores; X_ij é o conteúdo medido dos DDAs do experimento no i-ésimo fator e no j-ésimo nível; x_{j, min} é o conteúdo mínimo dos DDAs neste grupo de experimento de dados; e x_{j, max} é o conteúdo máximo dos DDAs neste experimento de grupo de dados. Dessa forma, i = 1, 2, ..., m e j = 1, 2, ..., n. Os teores de DDAs (X_ij) nos CBT processados com espessuras de 0,5, 1, 2, 3 e 4 cm foram 0,3492, 0,2692, 0,2962, 0,5354, 0,5124 mg/g, respectivamente. Assim, x j, max é 0,5354 e x_{j, min é 0,2692}.
      (3º)
      
      NOTA: Os valores padronizados são 0,6995, 1,0000, 0,8986, 0,0000 e 0,0864 usando a Eq. (3).
2. Calcule a intensidade de contraste correspondente (S i), conflito (δ i), informação (C i) e peso do índice (W _i) de acordo com Eqs. (4) a (7), respectivamente^19,20.
   NOTA: i = 1, 2, ..., m. y_ij são os dados padronizados do conteúdo de MDA ou DDAs do experimento no i-ésimo fator e no j-ésimo nível.
   1. Para estimar a intensidade do contraste, primeiro calcule o valor médio de MDA.
      
      Onde é o valor médio do MDA.
      (4º)
      
   2. Para calcular o valor de conflito, primeiro estime o coeficiente de correlação_{γ ij} usando a função CORREL no Excel²¹.
      (5º)
      
   3. Calcule os valores de informação da seguinte maneira.
      (6)
      
      Observação : da mesma forma, C_{1, DDAS = 0,7210}
   4. Calcule o peso do índice da seguinte maneira.
      (7º)
      
      OBS: Portanto, os coeficientes de peso do MDA e DDAs em comparação com a espessura de corte foram estabelecidos como 0,4945 e 0,5055, respectivamente.
3. Calcule as pontuações abrangentes de espessuras de fatia.
   
   
   
   
   
   NOTA: Y₁₃ é o valor máximo. Portanto, o melhor parâmetro de espessuras de corte é o terceiro nível - 2 cm.

   

Resultados

Neste estudo, o gradiente de eluição utilizado apresentou boa resolução (Figura 1) para os três componentes do índice no CBT Zanba-stir-fried, determinado após repetidas depurações. Os três componentes do índice no CBT frito com zanba apresentaram boa relação linear dentro de uma faixa de concentração específica (Tabela 2). A precisão (Tabela 5), a estabilidade (Tabela 6), a repetibilidade (Tabela 7) e a recuperação da amostra (

Discussão

O TBC é um importante medicamento tibetano com os efeitos de dissipar o frio e aliviar a dor. Tem sido mais utilizada para tratar lesões traumáticas e artralgia reumática na China há milhares de anos^24,25,26. Alcaloides diterpenóides são ingredientes ativos e tóxicos do CBT^27,28,29. Os principais efeitos tóxicos dos alcaloides ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Deoxyaconitine	Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd.	DST221109-033
Aconitine	Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd.	DSTDW000602
Ammonium acetate	Tianjin Kermel Chemical Reagent Co., Ltd	Chromatographic grade
Benzoylaconitine	Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd.	DSTDB005502
Design-Expert software	Stat-Ease, Inc., Minneapolis, MN, USA	version 13.0
Electronic analytical balance	Shanghai Liangping Instruments Co., Ltd.	FA1004
High performance liquid chromatography	SHIMADZU Co., Ltd.	LC-20A
High-speed smashing machine	Beijing Zhongxing Weiye Instrument Co., Ltd.	FW-100
Millipore filter	Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd	φ13 0.22 Nylon66
stir-Fry machine	Changzhou Maisi Machinery Co., Ltd	Type 5
Tiebangchui	Gannan Baicao Biotechnology Development Co., Ltd	20211012
Ultra pure water systemic	RephiLe Bioscience, Ltd.	Genie G
Ultrasonic cleansing machine	Ningbo Xinyi Ultrasonic Equipment Co., Ltd	SB2200
Zanba	27 Chuanzang Road, Ganzi County	-