Análise de testemunhos de árvores com tomografia computadorizada de raios X

Resumo

Aqui, mostramos como processar núcleos de árvores com um conjunto de ferramentas de tomografia computadorizada de raios-X. Exceto para extração química para alguns fins, nenhum tratamento físico adicional de laboratório é necessário. O conjunto de ferramentas pode ser usado para estimativas de biomassa, para obter dados MXD/largura dos anéis de árvores, bem como para obter dados quantitativos de anatomia da madeira.

Resumo

Um conjunto de ferramentas de tomografia computadorizada (TC) de raios-X é apresentado para obter a largura dos anéis das árvores (TRW), a densidade máxima do lenho tardio (MXD), outros parâmetros de densidade e dados quantitativos de anatomia da madeira (QWA) sem a necessidade de tratamento de superfície trabalhoso ou qualquer preparação física de amostras. O foco aqui está nos núcleos de incremento e nos procedimentos de varredura em resoluções que variam de 60 μm a 4 μm. São definidas três escalas nas quais a madeira deve ser observada: (i) escala entre anéis, (ii) escala de anel, ou seja, análise de anéis de árvores e escala de densitometria, bem como (iii) escala anatômica, esta última se aproximando da qualidade convencional de seção delgada. Suportes de amostra personalizados para cada uma dessas escalas permitem a varredura de alto rendimento de vários núcleos de incremento. Uma série de rotinas de software foi desenvolvida especificamente para tratar com eficiência imagens tridimensionais de TC de raios-X dos testemunhos das árvores para TRW e densitometria. Este trabalho explica brevemente os princípios básicos da TC, que são necessários para uma compreensão adequada do protocolo. O protocolo é apresentado para algumas espécies conhecidas que são comumente usadas em dendrocronologia. A combinação de estimativas de densidade aproximada, dados TRW e MXD, bem como dados quantitativos de anatomia, nos permite ampliar e aprofundar as análises atuais para reconstruções climáticas ou resposta de árvores, bem como desenvolver ainda mais o campo da dendroecologia / climatologia e arqueologia.

Introdução

A densidade da madeira é uma variável fácil de medir¹ que reflete as propriedades anatômicas e químicas da madeira². Nas estimativas de biomassa de biomassa aérea, a densidade da madeira é uma importante variável de pesagem ^3,4,5, que é multiplicada pelas dimensões da árvore e um fator que representa o teor de carbono da madeira. A densidade da madeira está intimamente ligada às propriedades mecânicas da madeira⁶ e reflete a história de vida de uma árvore⁷.

A densidade da parede celular é medida em aproximadamente 1500 kg/m³ e é considerada bastante constante⁸, no entanto, variações de densidade da parede celular intra-anel também devem ser consideradas ^8,9. As células lenhosas (em geral traqueídeos em coníferas, vasos, parênquima e fibras em madeiras duras) são orientadas/moldadas de diferentes maneiras e a espessura da parede celular e o tamanho do lúmen dessas células variam¹⁰. Portanto, a densidade da madeira varia entre as árvores, dentro de uma árvore (axial e transversal) e em intervalos curtos dentro de um anel de árvore^11,12. Em muitos casos, a variação da densidade da madeira na escala do anel também delimita o limite do anel das árvores¹³. A densidade da madeira e, em última análise, as frações de tecido são geradas e, neste artigo, são amplamente colocadas em três categorias (ou seja, três escalas de resolução diferentes), dependendo do objetivo do estudo (Figura 1), conforme descrito abaixo.

Escala entre anéis: Ao medir pedaços de madeira, obtém-se um único valor para essa amostra. Isso pode ser feito por imersão em água ou geometricamente¹⁴. Desta forma, biomassa geral ou madeira Para incluir a variação medula-casca, esses pedaços de madeira podem ser divididos em blocos que são medidos manualmente para obter informações sobre a estratégia de história de vida¹⁵. Ao mudar para TC de raios-X de baixa resolução, como em scanners médicos^17,18, os dados TRW em anéis médios a largos podem ser feitos de maneira eficiente em muitas amostras 18,19,20. Esta também é a escala que pode ser usada para avaliar a biomassa da medula à casca de árvores temperadas e tropicais ^4,22, normalmente variando em resoluções de 50 μm a 200 μm.

Escala de anel: A madeira é um registrador de condições ambientais passadas. O parâmetro mais conhecido é a largura dos anéis das árvores (TRW), mas para reconstruções de temperatura global, os registros de densidade máxima do lenho tardio (MXD) são comprovadamente um proxy melhor para a temperatura²². MXD é uma variável fácil de medir²³ e um proxy para a espessura da parede celular e o tamanho da célula nas últimas células de um anel de árvore, e estão na linha das árvores e nos locais boreais positivamente ligados à temperatura sazonal do ar²⁴: quanto mais quentes e longos os verões, mais lignificação da parede celular ocorre, o que aumenta a densidade dessas últimas células. Medições tradicionais, como imersão e geometria, são menos precisas para determinar essa densidade no nível do anel. Um trabalho anterior desenvolveu um conjunto de ferramentas para o uso de filme de raios-X em amostras de corte fino²⁵. Isso desencadeou uma revolução tanto na silvicultura quanto na paleoclimatologia posterior^15,18, definindo a densidade máxima do lenho tardio (MXD), ou seja, o valor da densidade de pico geralmente no final de um anel, como um proxy para a temperatura do verão. O princípio básico é que as amostras são serradas (aproximadamente 1,2 mm a 7 mm¹³) para ficarem perfeitamente paralelas à direção axial, e a amostra é colocada em um filme sensível exposto a uma fonte de raios-X. Em seguida, esses filmes de radiografia são lidos através de uma fonte de luz que detecta a intensidade e salva os perfis e os parâmetros anuais dos anéis das árvores. Essas ferramentas, no entanto, exigem uma quantidade significativa de preparação de amostras e trabalho manual. Recentemente, isso foi desenvolvido para TC de raios-X de forma mais padronizada ou com base em núcleos montados²⁶. A resolução aqui varia entre 10 μm e 20 μm. O TRW também é medido nesta escala, especialmente quando se trata de anéis menores.

Escala anatômica: Nesta escala (resolução < 4 μm), os níveis médios de densidade tornam-se menos relevantes à medida que as principais características anatômicas são visualizadas e sua largura e proporções podem ser medidas. Normalmente, isso é feito por meio de microsseções ou varreduras ópticas de alta resolução ou tomografias μ-CT. Quando a ultraestrutura das paredes celulares precisa ser visualizada, a microscopia eletrônica de varredura é o método mais comumente utilizado²⁷. Na escala anatômica, as frações individuais do tecido tornam-se visíveis para que os parâmetros fisiológicos possam ser derivados das imagens. Com base nos parâmetros anatômicos individuais e na densidade da parede celular da madeira, a densidade anatômica pode ser derivada para comparação com estimadores convencionais da densidade da madeira²⁴.

Devido a técnicas aprimoradas de seccionamento e software de imagem^29,30, a dendroanatomia³⁰ foi desenvolvida para ter um registro mais preciso da madeira, tanto para ter uma estimativa mais próxima do MXD em coníferas quanto para medir várias variáveis anatômicas de árvores de folha larga. Nessa escala, os parâmetros anatômicos reais são medidos e relacionados aos parâmetros ambientais³¹ . Com μCT esse nível também pode ser obtido^32,33.

Como a madeira é inerentemente higroscópica e anisotrópica, a densidade da madeira precisa ser cuidadosamente definida e as condições de medição precisam ser especificadas, seja como seca no forno, condicionada (normalmente com 12% de teor de umidade) ou verde (como derrubada na floresta)³⁴. Para grandes amostras e fins técnicos, a densidade da madeira é definida como o peso dividido pelo seu volume em determinadas condições. No entanto, o valor da densidade da madeira é fortemente dependente da escala em que é medida, por exemplo, da medula à casca, a densidade da madeira pode dobrar e, em uma escala de anel (em coníferas), a transição da madeira precoce para a madeira tardia também resulta em um aumento significativo na densidade da madeira, com um pico no limite do anel.

Aqui, um protocolo de tomografia computadorizada de raios-X de núcleos de incremento é apresentado para medir as características nas 3 escalas mencionadas acima (Figura 1). Desenvolvimentos recentes em TC de raios-X podem cobrir a maioria dessas escalas, devido a uma configuração flexível. Os objetivos da pesquisa determinarão o eventual protocolo de varredura.

Um fator limitante crucial (que está inerentemente ligado à natureza escalonada da densidade da madeira e da madeira em geral) é a resolução e o tempo necessários para a digitalização. Exemplos demonstram como: (i) obter perfis de densidade de madeira em escala de árvore entre anéis para estimativas de biomassa em Terminalia superba da Bacia do Congo, (ii) obter registros de densidade de cedro Clanwilliam (Widdringtonia cedarbergensis) com base em varredura helicoidal em um sistema HECTOR³⁵, e (iii) medir parâmetros de vasos em carvalho séssil, no sistema Nanowood. Ambos os scanners fazem parte do conjunto de scanners do UGent Center for X-ray Tomography (UGCT,

Figura 1: Árvore de decisão metodológica geral para tomografia computadorizada de raios-X. As linhas indicam as etapas a serem seguidas, desde o objetivo da pesquisa até o formato final dos dados. As caixas brancas são as etapas relevantes para essa cadeia de ferramentas. Caixas acinzentadas são etapas que podem ser executadas com outros softwares ou pacotes R, como dplr⁴⁷ e Treeclim⁴⁸ para análise de anéis de árvores, e ROXAS⁴⁴ , bem como ImageJ⁴² ou outros aplicativos (comerciais) para derivar parâmetros anatômicos da madeira com base nas imagens de TC. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Pesquisa X-CT em madeira
Configuração de um scanner: Um scanner de tomografia computadorizada de raios-X padrão consiste em um tubo de raios-X, um detector de raios-X, um estágio de rotação e um conjunto de motores para mover o estágio de rotação e, na maioria dos casos, também o detector, para frente e para trás (Figura 2).

Figura 2. O sistema de digitalização HEITOR. O sistema³⁵, mostrando a distância do detector de origem (SDD) e a distância do objeto de origem (SOD). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A maioria dos sistemas baseados em laboratório tem uma geometria de feixe cônico, o que significa que os raios X produzidos são distribuídos a partir da janela de saída do tubo em forma de feixe cônico, o que implica que, alterando a distância entre o objeto e o tubo (SOD = Source-Object-Distance) e o detector e o tubo (SDD = Source-Detector-Distance), a ampliação é controlada (veja a discussão sobre resolução). Devido ao poder de penetração dos raios X, eles passam pelo objeto, e a intensidade do feixe de atenuação é uma função da energia do feixe de raios X, da composição química do objeto (o número atômico dos elementos presentes) e da densidade do material. Dado um espectro de energia constante e uma composição constante do material da madeira, a atenuação do feixe de raios X é altamente dependente da densidade do material, o que explica seu uso para densitometria. A atenuação (ou transmissão) pode ser expressa pela lei de Beer-Lambert:

com I₀ o feixe de raios-X de entrada exponencialmente que decai para um feixe de raios-X transmitido I_d ao se propagar através do material a uma distância d. O coeficiente de atenuação linear μ depende de uma série de interações com o material do objeto. As projeções são, portanto, gravações do feixe transmitido.

Praticamente, o objeto é montado no estágio de rotação, um SOD e SDD adequados são selecionados, uma certa potência também é selecionada (relacionada ao tamanho, densidade e composição do objeto) e o objeto é girado 360° e durante essa rotação várias projeções são feitas. Essas projeções são então usadas para reconstruir a estrutura interior do objeto. Existem vários algoritmos de reconstrução disponíveis, dos quais os mais utilizados ainda são baseados no arcabouço analítico desenvolvido décadas atrás, contando com a transformação de Radon e o teorema da fatia de Fourier. Para mais detalhes, o leitor é encaminhado para literatura especializada³⁶.

Enigma da resolução, volume de dados e tamanho da amostra: A resolução é fundamental na tomografia computadorizada de raios-X. Em sistemas com geometria inversa ou geometria de feixe paralelo, como linhas de luz síncrotron, outras considerações desempenham um papel. Este protocolo discute apenas a tomografia computadorizada de raios-X padrão baseada em laboratório com geometria de feixe cônico. Aqui, o conceito de ampliação, tamanho do pixel do detector e tamanho do ponto são essenciais. A ampliação é definida como a proporção de SDD/SOD. Em seguida, o tamanho do pixel do detector obviamente também afeta a resolução: quanto menor o tamanho do pixel, maior a resolução, mas na maioria dos casos o campo de visão (FoV) também está diretamente relacionado ao tamanho do pixel e ao tamanho do detector (tamanho do pixel menor, FoV menor para o mesmo número de pixels). Além disso, o tamanho do ponto do feixe de raios-X também é importante: quanto maior o tamanho do ponto, menor a resolução, o que significa que menos detalhes podem ser vistos.

É importante abordar que se pode obter uma resolução superior à possível de acordo com os limites acima mencionados, portanto, é melhor usar o termo tamanho do voxel (um voxel é um pixel de volume) em vez de resolução. Além disso, existem outros fatores em jogo, como a nitidez do detector, que limitam ainda mais a verdadeira resolução na qual um objeto é digitalizado. Somente uma calibração verdadeira do sistema, usando metas estabelecidas, fornece a resposta verdadeira.

Na maioria dos casos, no entanto, o tamanho do voxel no qual um objeto pode ser verificado é limitado principalmente pelo tamanho do objeto. Isso significa que quanto maior o objeto, menor será o tamanho do voxel. Se o objeto não couber no FoV do detector para um determinado tamanho de voxel, o tamanho do voxel pode ser reduzido, por exemplo, limitando a ampliação.

É importante considerar o tempo de varredura e o volume de dados ao decidir o tamanho de voxel desejado. Em geral, quanto menor o tamanho do voxel, maior o detalhe que se deseja ver, menor a amostra ou menos amostras que podem ser digitalizadas de uma só vez, mais tempo é necessário e maiores os volumes de dados serão coletados. Imagine o seguinte exemplo teórico: pode-se escanear uma amostra medindo 10 cm x 10 cm x 10 cm a 50 μm de uma só vez com um determinado sistema de TC de raios-X e gostaria de escanear esse mesmo volume a 10 μm, o volume que cabe dentro do FoV seria de apenas 2 cm x 2 cm x 2 cm, assumindo que isso é fisicamente possível. Isso significa que são necessárias 125 varreduras (5³ = resolução 5 vezes maior, escala para a potência de 3 devido à natureza volumétrica da técnica de imagem) para cobrir todo o volume, e que o volume de dados aumentaria da mesma forma. Claro, isso é apenas um experimento mental, e é preciso considerar muito mais do que apenas resolução. Para obter mais informações, o leitor é encaminhado para uma visão geral das possibilidades de digitalização³⁷.

Flexibilidade dos instrumentos para escaneamento de objetos de madeira: Na última década, muitas empresas forneceram sistemas de TC de raios-X com um conjunto semelhante ao HECTOR³⁵. Uma visão geral de vários sistemas de TC, especialmente avaliados por sua resolução temporal, é dada em³⁸.

Ao todo, a flexibilidade e a facilidade de uso dos sistemas de TC de raios-X melhoraram consideravelmente. Muitos sistemas permitem a digitalização de uma gama diversificada de objetos, o que também é o caso dos sistemas da UGCT. O protocolo abaixo é demonstrado para o sistema HECTOR, que é adequado para análise de anéis de árvores. O protocolo, no entanto, é válido para qualquer outro sistema disponível se a resolução e o formato dos dados permitirem.

Esses sistemas permitem a digitalização de uma variedade de objetos. Algumas fotos de diferentes objetos de madeira digitalizados com o sistema HECTOR são fornecidas na Figura 3. É essa flexibilidade que compreende as três escalas que apresentamos na Figura 1, variando de uma resolução grosseira a uma resolução muito fina.

Figura 3. Exemplos de configuração de digitalização. (A) Um tronco, (B) um violoncelo⁴⁹, (C) porta-amostras (tipo 1) com três núcleos para varredura em lote e (D) porta-amostras tipo 2 com núcleos de incremento para varredura helicoidal montados no estágio de rotação do HECTOR. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Protocolo

1. Amostragem do núcleo

1. Prove a árvore com uma broca Pressler. Consulte referências sobre como retirar o núcleo de uma árvore manualmente³⁹. Este conjunto de ferramentas é apresentado para núcleos de 5,15 mm.
2. Coloque os núcleos das árvores descolados em canudos de papel de 6 mm ou em qualquer outro receptor que não necessite de cola. Não cole os núcleos das árvores em um suporte de madeira. Se os núcleos já estiverem montados, desmonte-os com bisturi/serra ou solvente, dependendo do tipo de cola.
3. Evite embrulhá-los em tubos de plástico, tente secá-los primeiro para evitar o crescimento de mofo e a decomposição de fungos.
4. Use lápis para escrever nos canudos de papel, pois a extração pode desbotar as escritas dos marcadores.
   NOTA: Este conjunto de ferramentas também é adequado para núcleos de 4 mm. Núcleos já montados e lixados podem ser usados, mas eles precisam ser desmontados primeiro. Para madeira arqueológica ou remanescente, uma amostra do tamanho de um núcleo precisa ser feita (serrando/reduzindo o tamanho) para digitalização.

2. Preparação do núcleo antes da digitalização

1. Realize uma extração de etanol/tolueno ou etanol ou acetona⁴⁰ Soxhlet por pelo menos 24 h (Figura 4A,B). Isso é necessário para garantir um volume de madeira livre de resina para ter um cálculo preciso da densidade (a resina atenua o sinal, Figura 4C^13,41).
   1. Faça uma solução de 1000 mL de etanol com 427 mL de tolueno (de acordo com, por exemplo, ASTM D 1107 - 96) ou etanol puro ou acetona. Muitas universidades têm uma oficina de vidro de laboratório que pode fazer uma versão adaptada do aparelho de Soxhlet para núcleos de árvores (Figura 4B).
   2. Encher o balão de fundo redondo com o solvente e colocar as amostras dentro dos canudos em um suporte de aço inoxidável no aparelho Soxhlet com refrigerador em um aquecedor de laboratório. Deixe pelo menos 6 sifões por h.
      NOTA: Um circuito fechado de água é preferencialmente usado para resfriamento (ou qualquer outro sistema de resfriamento moderno). Neste caso, uma bomba d'água circula a água, armazenada em uma bacia de 100 L com pastilhas de cloro (para evitar o desenvolvimento de algas), a 120 L/h (mas isso dependerá do tamanho do aparelho Soxhlet, bem como do calor aplicado pelo elemento de calor). Um refrigerador de ar é usado para resfriar a água na bacia de 100 L. Para economizar solvente, contas de vidro podem ser usadas para preencher o volume vazio do aparelho Soxhlet.
   3. Verifique a temperatura e o número de sifões regularmente. Seque os núcleos sob uma capa química (verifique a política do laboratório para isso) para remover o resíduo de solvente ou coloque um forno de secagem sob a capa química.
2. Secar os tarolos durante 24 h numa estufa de secagem (103,5 °C) sob ventilação de exaustão e efectuar um banho-maria quente (90 °C) ou uma aspiração de Soxhlet com água quente durante 24 h conforme descrito acima.
   1. Manter as amostras nos canudos de papel nos porta-amostras de aço. Seque novamente em forno seco por 24 h a 103,5 ° C e, em seguida, condicione a 60% de umidade relativa (UR) antes de digitalizar.
      NOTA: O valor de 60% é escolhido neste caso porque essas são aproximadamente as condições médias de umidade relativa do ambiente na sala de tomografia computadorizada de raios-X. Amostras secas de forno também podem ser usadas. O fator mais importante é que todas as amostras são digitalizadas nas mesmas condições.
   2. Caso a extração de água degenere os canudos de papel, coloque os núcleos das árvores de volta em novos canudos de papel de 6 mm²¹. Os núcleos de 5,15 mm e 4 mm podem ser colocados em canudos de papel de 6 mm.
   3. Certifique-se de que todo o canudo de papel esteja cheio de madeira. Enrole as duas pontas de palha e corte as pontas. Isso permite a fácil inserção dos canudos no suporte cilíndrico.
   4. Certifique-se de que o lado do câmbio (casca) esteja claramente indicado no núcleo, pois o CoreProcessor e o RingIndicator assumem que o lado da casca está voltado para baixo. Remova pedaços e peças, bem como núcleos com rachaduras, pois são difíceis de trabalhar.

Figura 4. Fluxo de trabalho para extração e secagem de núcleos antes da digitalização. (A) Os núcleos de incremento em canudos de papel são primeiro colocados em banho-maria quente e, posteriormente, em uma mistura quente de etanol-tolueno com um aparelho Soxhlet por 24 h, depois secos, colocados em banho-maria quente por 24 h, depois secos novamente a 103,5 ° C e condicionados antes da digitalização. (B) Imagens da configuração adaptada de Soxhlet na Universidade de Ghent. Vários aparelhos Soxhlet adaptados são conectados em série. Observe a folha de alumínio e os tubos de isolamento para manter o solvente ou a mistura de solventes quente o suficiente para a extração. (C) Exemplo da superfície de um núcleo de incremento de Pinus longaeva antes e depois da extração. Resinas e outros extrativos mascaram o verdadeiro sinal de densidade, devido à atenuação dos raios X. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Varredura principal

1. Selecione o tipo de suporte de amostra adequado (Figura 5) conforme descrito abaixo, dependendo do objetivo da pesquisa, conforme descrito na Figura 1.
   1. Para fins de escala entre anéis, use o suporte tipo 1 - papelão e espuma floral perfurada.
   2. Para os dados MXD, use o suporte tipo 2 - um suporte de amostra de plástico que contém 6 núcleos de 1 a 15 cm de comprimento e 3 cm de diâmetro.
   3. Use o suporte tipo 3 - para fins de anatomia dendro, que consiste em simplesmente amarrar canudos de papel.
2. Carregue os núcleos das árvores em canudos de papel no porta-amostras e preencha o modelo de planilha que pode ser baixado no https://dendrochronomics.ugent.be/#software. Cada número corresponde a uma determinada posição no suporte da amostra.
3. Digitalização em uma instalação de μCT de raios-X: consulte um especialista em TC de raios-X para obter as configurações e o protocolo de varredura adequados. Para o scanner usado neste protocolo, consulte³⁷.
4. Reconstrução das imagens digitalizadas: consulte um especialista em TC de raios-X para as configurações adequadas da reconstrução ou as configurações que acompanham o tomógrafo (pacote de software do tomógrafo de raios-X). Para parâmetros de reconstrução para este protocolo, consulte³⁷.

Figura 5. Tipos e resolução de porta-amostras. Desenho dos três principais tipos de suportes, que correspondem a (A) escala entre anéis, (B) escala de anéis de árvores e (C) escala anatômica. Devido ao tamanho resultante, o número de amostras diminui com o aumento da necessidade de resolução. As renderizações 3D correspondentes para (D) escala entre anéis (suporte 1), (E) largura do anel e MXD (suporte tipo 2) e (F) parâmetros anatômicos (suporte tipo 3). Barra de escala = 5 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Obtenha dados TRW, dados de densidade e dados anatômicos

1. Introdução ao software.
   1. Para obter valores de densidade (tipo de suporte 1 e 2), instale os três pacotes de software a seguir: (i) CoreProcessor, (ii) RingIndicator e (iii) caixas de ferramentas CoreComparison de
   2. Como essas caixas de ferramentas foram feitas no MATLAB, instale o tempo de execução do compilador MATLAB (MCR) correto, disponível em: http://nl.mathworks.com/products/compiler/mcr/. A versão necessária atualmente é MATLAB2022B. O MCR é gratuito, assim como os 3 pacotes de software.
   3. Ao lado da pasta dos volumes reconstruídos, crie uma nova pasta vazia para os arquivos MAT (um formato de arquivo do MATLAB que armazena variáveis, etc.), por exemplo, matfiles_useful_name_sample_holder, isso é necessário para armazenar parâmetros temporários.
   4. Certifique-se de que a planilha esteja na pasta dos volumes reconstruídos, para preencher as amostras em uma etapa posterior.
2. Pré-processamento dos volumes principais com o CoreProcessor.
   NOTA: Para dados de anatomia de alta resolução, não são necessárias as seguintes etapas de processamento (Figura 1), uma vez que os volumes reconstruídos estejam disponíveis, consulte as diretrizes do ImageJ para imagens 3D⁴². A segmentação pode ser feita através do plugin Weka⁴³ para indicar recipientes em fatias individuais, por exemplo¹², ou em plug-ins de software como ROXAS⁴⁴.
   1. Prepare a extração do núcleo: Prepare a extração automatizada dos núcleos de incremento (dependendo da escala entre anéis Figura 6A ou da escala em anel Figura 6B) conforme descrito abaixo.
      1. Selecione a pasta com arquivos reconstruídos (fatias TIFF de seção transversal de 16 bits) e o arquivo de planilha (XrayForm.xlsx).
      2. Selecione a pasta vazia de 4.1.3. Esta é a pasta onde o CoreProcessor criará um arquivo MAT que será usado em 4.2.2. para extração de núcleo de massa.
      3. Selecione a pasta de arquivo MAT vazia recém-criada ou, se não tiver sido criada, selecione qualquer outra pasta. O volume é carregado e uma seção transversal longitudinal do cilindro aparece, verifique algumas fatias horizontais para garantir se todos os núcleos e referências foram montados corretamente no cilindro.
      4. Clique de baixo para cima para selecionar fatias para avaliar isso. Essas seções transversais serão usadas para a próxima etapa, portanto, clique em todo o comprimento. Indique as referências escuras (ar) e brancas (Figura 6), quantas vezes forem indicadas no arquivo da planilha. Clique duas vezes após cada seleção.
      5. Para o suporte de amostra 1, inspecione a tela múltipla com 9 seções transversais, geradas através do material de referência para verificar se o cálculo da densidade foi realizado na madeira (e não no canudo de papel ou outro material não lenhoso). Isso é essencial para a conversão correta para valores reais de densidade da madeira.
      6. Em uma nova janela pop-up, selecione cada núcleo separadamente desenhando um círculo/elipse ao redor dele. Realize a rotulagem com base nas informações do arquivo da planilha, verifique se o nome está correto. Respeite a ordem em que o modelo é preenchido. Todas as informações são armazenadas em um arquivo MAT, que será usado durante a próxima etapa para extrair todos os núcleos de uma só vez.
   2. Clique em Extração de núcleo de massa para realizar a extração de núcleo para todos os núcleos em um determinado cilindro (que foram indicados em 4.2.1.2), dado que os metadados e os arquivos de planilha estão localizados na mesma pasta.
      NOTA: Ao usar a extração de núcleo em massa, todos os núcleos serão extraídos de acordo com a rotulagem do usuário (que são armazenados na pasta mat file). Como resultado dessa operação, uma nova pasta chamada Extraído será criada, contendo todos os núcleos separados. Quando vários suportes de amostra são preparados na primeira etapa e todos os arquivos MAT são armazenados na mesma pasta, todos os arquivos MAT nessa pasta serão processados.
   3. Na caixa de ferramentas CoreProcessor, clique em Correção manual de Tg e selecione a pasta Extraído para garantir a orientação adequada do plano transversal e radial de cada volume de núcleo, semelhante à montagem de amostras físicas em um suporte de amostra antes de lixar mantendo o plano transversal à vista (Figura 7B).
      1. Algumas seções transversais são exibidas para que o usuário possa ver a direção do grão. No último gráfico (canto inferior direito), inspecione a fatia apresentada e desenhe uma linha para indicar a direção do grão. Clique duas vezes para girar automaticamente o núcleo.
      2. Em seguida, aparece uma tela, aqui corta o volume do núcleo (Figura 7C), certificando-se de que o retângulo abrange todo o diâmetro do núcleo. Isso é necessário porque o ponto central do retângulo deve estar o mais próximo possível do eixo central (para alinhamento correto no módulo RingIndicator).
         NOTA: Se digitalizar em alta resolução, selecione apenas o material dentro do núcleo neste stage e use o conversor para alternar para o suporte de amostra tipo 2. Isso certamente é útil para espécies porosas em anel, por exemplo.
   4. Execute as etapas opcionais a seguir em caso de núcleos desalinhados, invertidos ou quebrados ou formatos de imagem incompatíveis.
      1. Correção da inclinação do núcleo (apenas para o suporte de amostra 1): Para corrigir automaticamente a inclinação do núcleo (por exemplo, quando o núcleo está ligeiramente inclinado no cilindro; Figura 7A). Isso é importante para as etapas posteriores. Selecione a pasta Extraída criada na etapa anterior.
         NOTA: Isso normalmente não é necessário se você tiver um porta-amostras tipo 2 ou tipo 3 (Figura 5) ou quando todas as amostras e porta-amostras são colocados perfeitamente na vertical.
      2. Inverter volumes: Caso a amostra não tenha sido colocada com o lado da casca voltado para baixo (a direção da casca da medula não é da esquerda para a direita), mude a direção invertendo os núcleos. A função pede uma pasta e criará uma nova pasta.
      3. Cole núcleos: Junte grandes partes de núcleos individuais virtualmente. A ideia não é costurar perfeitamente, mas garantir que, se necessário, núcleos únicos estejam no mesmo volume TIFF de várias páginas. Use a indicação do núcleo quebrado (consulte a etapa 4.3.4.9) para superar os espaços entre as peças do núcleo.
      4. Conversor: Se os volumes foram manipulados em outro pacote de software e são salvos fora da caixa de ferramentas (por exemplo, ImageJ), execute esta etapa para obter as informações do cabeçalho corretas. Use esta etapa para volumes TIFF de várias páginas de 16 bits provenientes de outro scanner de TC também e para usar a caixa de ferramentas RingIndicator.
         NOTA: Todas as etapas a partir daqui são para correções de direção da estrutura e, finalmente, densitometria e análise de anéis de árvores.
3. Corrigindo os ângulos e anéis indicadores no RingIndicator.
   NOTA: As seguintes etapas precisam ser executadas cronologicamente no módulo RingIndicator: (i) visualização do plano transversal e radial, (ii) correção da estrutura, (iii) criação do perfil de densidade e (iv) indicação dos anéis manual ou semiautomática.
   1. Realize a visualização do plano transversal e radial conforme descrito abaixo.
      1. Para se familiarizar com a GUI, abra a caixa de ferramentas e selecione um arquivo TIFF de várias páginas (um que foi criado após a extração e após a correção do tg, portanto, do nome da pasta Tg corrigido).
      2. Selecione a Meia espessura da imagem da fatia para exibir uma imagem média das fatias X centrais, com X variando de 1 a 10, com 1 sendo nenhuma média (ou seja, exibindo apenas a fatia central) e 10 sendo uma imagem média das 10 fatias centrais.
         NOTA: A média pode ser benéfica para destacar melhor as bordas do anel e suprimir o ruído, por outro lado, também pode fazer com que as bordas do anel pareçam menos distintas, especialmente quando o ângulo da fibra é substancial. Ajuste este valor de acordo com as necessidades. É importante mencionar que isso é apenas para exibição, não afeta o volume subjacente, nem afeta os eventuais cálculos/resultados.
      3. Inspecione a interface gráfica do usuário (GUI). A GUI contém uma figura superior com o plano transversal do núcleo e uma figura inferior com o plano radial do núcleo e um menu (Figura 8).
      4. Para carregar um novo volume principal, procure a função Volume > Carregar Volume para selecionar um novo arquivo TIFF de várias páginas no diretório. Agora o usuário está pronto para indicar a direção da estrutura para posteriormente indicar os anéis reais das árvores.
   2. Correção da estrutura para facilitar as indicações automáticas dos anéis das árvores.
      1. Clique manualmente na imagem para inserir barras verdes para correção da estrutura. Comece com a medula (ou anel mais antigo disponível) e termine com o anel mais recente. Ao longo do núcleo, corrija os desvios estruturais no plano transversal e radial.
      2. Certifique-se de indicar o anel e o ângulo da fibra corretamente, pois todas as indicações subsequentes terão um ângulo interpolado entre as respectivas indicações.
      3. Insira uma barra verde em um plano, ela gerará automaticamente uma no outro plano. Depois de inserir a barra, mova os nós (quadrados brancos) no final da barra para alterar o ângulo. Use o nó do meio para alterar a posição da barra. Ajuste o tamanho dos nós para facilitar o uso.
      4. Após cada etapa, certifique-se de pressionar Exportação de > de dados e Anéis > Exportar anéis, para garantir que as indicações de anel e fibra sejam gravadas nos arquivos de .txt adequados. Ao longo de todas as correções, certifique-se de sempre executar essas duas ações.
   3. Calculando o perfil de densidade.
      1. Use a plotagem Densitometria > Densitometria para calcular o perfil de densidade. Crie e plote um perfil de densidade selecionando Sobrepor plotagem > Plotar perfil de densidade, que pode servir como uma sobreposição nos planos principais.
      2. Para o cálculo do MXD, indique uma porcentagem (recomendado é 20%, por exemplo, 20% significa que apenas 20% dos valores de densidade mais altos estão incluídos), para excluir valores mais baixos de dutos de resina, madeira primitiva etc. Para valores médios de densidade, use 100%. Para densidade mínima, use também 100%.
   4. Execute a indicação manual e/ou automática dos limites dos anéis usando um clique esquerdo do mouse por anel, conforme descrito abaixo.
      NOTA: Insira as mesmas barras verdes do passo 4.3.2.1., desta vez o usuário deve fazer isso agora toque por anel (Figura 9).
      1. Use Plotagem de sobreposição > Perfil de densidade de plotagem para visualizar o perfil de densidade na imagem. É melhor indicar o limite do anel também em conjunto com este perfil.
         NOTA: Abra quantas instâncias das caixas de ferramentas forem necessárias, em combinação com a caixa de ferramentas CoreComparison (veja mais adiante).
      2. Para indicações automáticas (recomendadas para coníferas, por exemplo), use a detecção automática > Max/Min/Inflexion. Esta função indicará automaticamente os limites dos anéis das árvores com base no perfil de densitometria criado na etapa anterior. Para indicações automáticas (funciona melhor para coníferas boreais ou espécies com limites de anel claros definidos pelo perfil de densidade), use a detecção automática > Máx/Mín/Inflexão . Esta função indicará automaticamente os limites dos anéis das árvores com base no perfil de densitometria criado na etapa anterior.
      3. Dependendo da espécie (difusa-porosa/anel-porosa ou conífera), use o máximo/mínimo, ou a inflexão da curva (logo após o pico de densidade) como critério de limite do anel de árvore. O primeiro parâmetro é um limite para a função de pico, o segundo é uma função mais suave.
      4. Depois de realizar as indicações de anel automatizadas, execute o deslocamento automático (com tamanho de janela de 1 pixel e iterações definidas pelo usuário), certificando-se de que nenhuma indicação de anel seja plotada uma na outra devido a esse deslocamento e execute novamente o gráfico de densitometria.
      5. Altere a data de abate para o ano em que os testemunhos de incremento foram obtidos em árvores vivas ou qualquer outra data que seja adequada. O padrão é definido em 1900.
      6. Em Sobreposição de plotagem, selecione Anéis de plotagem e os anos serão exibidos. Selecione também o plano no qual deseja plotar os anéis e/ou o perfil de densidade.
      7. Quando houver dois núcleos totalmente indicados (por exemplo, da mesma árvore), faça comparações em pares das curvas de largura do anel do núcleo abrindo a caixa de ferramentas CoreComparison. Abra uma instância de RingIndicator por núcleo e edite as indicações, se necessário. Exporte-os novamente e use essa abordagem iterativa e interativa para obter dados de boa qualidade. Na próxima etapa (etapa 4.4.1.), faça isso para todos os núcleos para exportar os dados TRW e os valores de densidade correspondentes.
      8. Verifique as posições dos anéis duplos na opção Anéis > Verificar anéis ; Isso verificará se alguma indicação tem uma posição fora das imagens, bem como anéis que estão sobrepostos, por exemplo, caso um clique duplo tenha acontecido duas vezes na mesma posição.
      9. Para núcleos quebrados que têm pedaços, comece pela medula e demarque anomalias (ar devido a núcleos quebrados, pontos brilhantes devido a bolsas de resina, contaminação e peças deterioradas) como se fossem anéis para excluí-los depois. Termine com o limite do anel da árvore do último anel formado e exporte os dados. Tente evitar núcleos quebrados durante a amostragem (consulte as etapas 1.1. e³⁹).
         NOTA: Anéis ausentes e quebrados podem ser indicados, consulte a Figura 10. Dois casos são definidos, um em que o núcleo se quebra no meio de um anel e outro em que o núcleo se quebra em um limite de anel. Para o primeiro (Figura 10A), indique a lacuna, anote o número dessa lacuna seguido pelo número 1 e feche os colchetes. Em seguida, o programa somará as duas partes do anel para obter um valor TRW correto. No segundo caso, o número da lacuna é indicado seguido do número 2, e o programa omitirá esta seção (Figura 10B).
      10. Ao indicar anéis e gerar perfis de densidade, vários arquivos .txt são criados e armazenados na mesma pasta que os arquivos TIFF de várias páginas, e os mais importantes são listados na Tabela 1. Mantenha esses arquivos .txt na mesma pasta que as imagens TIFF, para tratá-los ainda mais no módulo CoreComparison (etapa 5.4).
          NOTA: Para calcular os valores de densidade de uma maneira diferente com base no perfil de densidade bruta (por exemplo, largura da madeira tardia versus largura da madeira inicial⁴⁵ ou outras métricas não suportadas pelas caixas de ferramentas CoreComparison e CoreProcessor), use os arquivos de texto zpos_corr e density_corr e use-os para esses cálculos.
4. Para comparar a série TRW e exportar os dados através do CoreComparison, siga os passos abaixo.
   NOTA: Ao usar esta caixa de ferramentas, duas janelas são abertas simultaneamente, o módulo CoreComparison e o módulo PatternMatching. O CoreComparison lida com datação cruzada e exportação de dados TRW, enquanto o módulo PatternMatching pode ser usado para exportar perfis de densidade e valores de densidade (MXD, densidade mínima (MND), densidade média e valores de 4 quartis). O principal objetivo do CoreComparison é gerar os valores TRW e os valores de densidade e ter uma estimativa aproximada da qualidade da datação cruzada, com um acoplamento ao RindIndicator em caso de anéis ausentes ou indicações erradas.
   1. Execute as etapas a seguir para datação cruzada ou correspondência do padrão de largura do anel com outras séries.
      1. Assim que a seção RingIndicator for concluída, selecione os arquivos de texto a serem comparados e uma tela será aberta com larguras de anel, juntamente com datação cruzada ou parâmetros estatísticos, como Gleichlaüfigkeit (GLK)⁴⁶ e/ou correlação de Spearman entre séries individuais (Figura 11).
      2. Para fazer alterações nas indicações de anel (por exemplo, durante a datação cruzada), reabra o RingIndicator, importe dados, exporte os dados e anéis modificados e use o botão Atualizar no módulo CoreComparison (veja o canto superior esquerdo) para ver as alterações.
      3. Abra várias instâncias de RingIndicator para fazer alterações em diferentes séries de anéis de árvores e use vários monitores de tela para fazer isso.
      4. No menu GLK e CORR (Figura 11), execute uma série de ações relacionadas ao GLK, como limitar os números, exportar os valores do GLK para uma planilha e classificá-los.
   2. Obtenha valores TRW do CoreComparison conforme descrito abaixo.
      1. Use a função de plotagem e exportação em CoreComparison para alterar o deslocamento entre as curvas (um valor maior resulta em um deslocamento menor). Visualize os dados TRW em um gráfico selecionando Plotar e Exportar > largura do anel.
      2. Exporte os dados TRW clicando em Plotar e exportar > Exportar dados RW. Exporte larguras de anel em formato de planilha ou no formato Tucson.
   3. Obtenha os perfis de densidade do módulo PatternMatching, conforme descrito abaixo.
      1. Para obter os perfis de densidade em planilha, acesse o módulo PatternMatching e, após carregar os perfis, no menu Outros , selecione Plotar > Exportar Perfis de Densidade Corrigidos.
      2. Para perfis de processo em lote ou para avaliar os dados usando métodos diferentes, use diretamente os arquivos .txt da Tabela 1 (consulte a etapa 4.3.4.11).
   4. Obtenha MXD, MND e outros valores de densidade do módulo PatternMatching, conforme descrito abaixo.
      1. Para obter a densidade média, MXD, MND e dados de quartil por anel de árvore, use Outra plotagem > Exportar dados agrupados. Uma planilha será gerada e pode ser encontrada na mesma pasta dos arquivos TIFF.
      2. As guias da planilha estão detalhadas na Tabela 2. Exporte essas variáveis de anéis de árvores para o Rstudio ou outro software para análise posterior.

Figura 6. Obtenção de valores de densidade de madeira a partir de valores de cinza. Conversão dos valores de cinza da imagem em estimativas reais da densidade da madeira, por meio de calibração com um material de referência. (A) Suporte de amostra 1, com resolução de 60 μm, mostrando a referência do ar, a referência branca e o núcleo. (B) Suporte de amostra, a 20 μm, ar, referência e núcleo também são mostrados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7. Etapas de pré-processamento do volume do núcleo 3D. Etapas de pré-processamento do volume do núcleo 3D antes da visualização e indicação dos anéis das árvores. (A) Correção de inclinação (axial), (B) correção tangencial, com as barras cinzas indicando a direção da fibra, (C) o corte do volume do núcleo para obter um volume apenas com voxels lenhosos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8. Captura de tela de um núcleo. Captura de tela de um núcleo (largura tangencial de aproximadamente 3 mm, resolução μm) aberto na caixa de ferramentas RingIndicator. O painel superior é a vista transversal, o painel inferior é a vista radial. As barras verdes mostram a indicação da estrutura (neste caso, no limite do anel), a linha vermelha é o perfil de densidade. Os números amarelos indicam o ano civil e os números azuis o número do anel genérico (contando a partir da primeira indicação). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 9. Indicação de anel e visualização do perfil de densidade no módulo RingIndicator. As linhas verdes são indicações, a linha vermelha é o perfil de densidade da madeira. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 10. Como lidar com rachaduras nos núcleos. (A) Quando ocorre uma rachadura no meio do anel, o número genérico do anel (começando pela medula) será rotulado como uma lacuna e TRW será calculado somando as larguras das duas partes do anel. Os parâmetros são 3 (número do anel) e 1 (caso 1: rachadura no meio de um anel)³¹. (B) Quando ocorre uma rachadura em um limite de anel, a folga será omitida do cálculo TRW. Os parâmetros são 3 (número do anel) e 2 (caso 2: trinca no limite do anel)³¹. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 11. Captura de tela do módulo Core Comparison. Captura de tela do módulo Core Comparison, onde as séries de largura do anel são distribuídas verticalmente para facilitar a comparação visual. O painel superior mostra a largura do anel de 4 núcleos de Fagus sylvatica, o painel inferior esquerdo mostra o Gleichlaüfigkeit (GLK) e o painel inferior direito o coeficiente de correlação de Spearman. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Nome do arquivo	Explicação
SAMPLENAME_density.txt	Valores de densidade não corrigidos para todo o comprimento da imagem, portanto, não corrigidos para o ângulo do anel e da fibra
SAMPLENAME _density_corr.txt	txt anterior, mas com valores de densidade corrigidos
SAMPLENAME _ring-and-fibre.txt	Posições e ângulos de indicação de anel e fibra
SAMPLENAME _zpos.txt	posição dos limites dos anéis das árvores em seu núcleo, sem correção de anel e fibra
SAMPLENAME _zpos.corr.txt	idem como zpos, mas depois corrigido para o ângulo do anel e da fibra
SAMPLENAME _ringwidth.txt	larguras de anel calculadas, considerando o ângulo do anel e da fibra

Tabela 1. Arquivos de texto gerados pelo RingIndicator. Lista de arquivos de texto que são gerados após a indicação de anéis e exportação do perfil de densidade no RingIndicator. Eles devem permanecer na mesma pasta que o arquivo .tiff para serem abertos no módulo CoreComparison.

Variável de anéis de árvores	Explicação
Densidade média	densidade média por anel de árvore
Densidade máxima com base na metade	MXD, mas apenas com base na segunda metade do anel de árvores para evitar que os valores de alta densidade do ano anterior não sejam incluídos
Densidade mínima	a densidade mínima por anel de árvore
Q1-Q4	valores médios e máximos para cada quartil do perfil de anel intra-anual

Tabela 2. Detalhes da planilha. As variáveis de anel de árvore que são exportadas para uma planilha chamada exportam dados clusterizados.

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Resultados

Se o objetivo é a estimativa de biomassa ou incremento de crescimento de árvores de muitas amostras, ou seja, escala entre anéis (Figura 1), então o suporte de amostra 1 (Figura 5) é usado para escanear amostras para obter perfis de densidade (ver etapa 5.4.3) e estimativas de crescimento de árvores, por exemplo, para árvores de crescimento rápido com grande TRW, o que permite uma resolução mais grosseira. A Figura 12 most...

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Discussão

Etapas críticas dentro do protocolo
As etapas críticas dentro do protocolo incluem o manuseio adequado da broca de incremento para obter núcleos de incremento de alta qualidade (etapa 1.1. e ver³⁹) para evitar pedaços e pedaços. Em seguida, é essencial que os núcleos sejam deixados desmontados (mas ver²⁶), tanto para inserção no suporte da amostra (Figura 5, ver²¹), quanto para extração adequada da resina

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 mm paper straws	http://artstraws.com/education/product/artstraws-thick-asst-cols/		Coring
Aluminium core holders
ASTM standard ASTM D 1107 – 96
Cardboard postal tubes	https://www.rajapack.co.uk/envelopes-mailing-bags/postal-tubes/1-5-2mm-brown-cardboard-postal-tubes_PDT05623.html
Column drill
Computer hardware for reconstruction and analysis			X-ray CT scanning
Cooling
Drying oven
Ethanol
Flask for under soxhlet (2000 ml)
Floral foam	https://www.oasisfloral.eu/		Sample holder type 1
Glass beads to fill void volume of Soxhlet to save solvent
Glue
Hot water bath	https://www.memmert.com/products/water-baths/water-bath/#!filters=%7B%7D		Soxhlet extraction
Increment borer	https://haglofsweden.com/project/increment-borers/
Plastic cylinder	Moonen et al. 2022		Sample holder type 2
Plastic cylinders
Reservoir
Tailored soxhlet apparatus
Toluene
Water pump
X-ray CT scanner