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Resumo

Este protocolo descreve um modelo de acúmulo de lipofuscina em culturas altamente diferenciadas e polarizadas do epitélio pigmentado da retina humana (EPR) e um ensaio melhorado de fagocitose do segmento externo (EO) para detectar o consumo/capacidade de degradação total do EPR. Esses métodos superam as limitações de modelos anteriores de lipofuscina e ensaios clássicos de fagocitose do segmento externo de perseguição de pulso.

Resumo

A fagocitose diária dos segmentos externos dos fotorreceptores pelo epitélio pigmentar da retina (EPR) contribui para o acúmulo de um pigmento envelhecido intracelular denominado lipofuscina. A toxicidade da lipofuscina está bem estabelecida na doença de Stargardt, a degeneração hereditária da retina mais comum, mas é mais controversa na degeneração macular relacionada à idade (DMRI), a principal causa de cegueira irreversível no mundo desenvolvido. Determinar a toxicidade da lipofuscina em humanos tem sido difícil, e modelos animais de Stargardt têm toxicidade limitada. Assim, modelos in vitro que mimetizem o EPR humano in vivo são necessários para melhor compreender a geração, depuração e toxicidade da lipofuscina. A maioria dos modelos de lipofuscina em cultura celular até o momento foi em linhagens celulares ou envolveu a alimentação de EPR com um único componente da complexa mistura de lipofuscina em vez de fragmentos/pontas de todo o segmento externo do fotorreceptor, o que gera um modelo de lipofuscina mais completo e fisiológico. Descrito aqui é um método para induzir o acúmulo de material semelhante à lipofuscina (denominado material de autofluorescência não digestível, ou UAM) em EPR pré-natal humano primário altamente diferenciado (hfRPE) e PSE derivado de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC). As MAU acumularam-se nas culturas por repetidas alimentações de fragmentos de OS tratados com luz ultravioleta absorvidos pelo EPR via fagocitose. As principais maneiras pelas quais o UAM se aproxima e difere da lipofuscina in vivo também são discutidas. Acompanhando esse modelo de acúmulo semelhante à lipofuscina, métodos de imagem para distinguir o amplo espectro de autofluorescência dos grânulos de UAM da coloração concomitante de anticorpos são introduzidos. Finalmente, para avaliar o impacto da MAU na capacidade de fagocitose do EPR, um novo método para quantificar a captação e a degradação de fragmentos/pontas do segmento externo foi introduzido. Denominado "Capacidade de Consumo Total", esse método supera potenciais erros de interpretação da capacidade de fagocitose do EPR inerente aos ensaios clássicos de "perseguição de pulso" do segmento externo. Os modelos e técnicas aqui introduzidos podem ser usados para estudar as vias de geração e depuração da lipofuscina e a toxicidade putativa.

Introdução

O epitélio pigmentado da retina (EPR) fornece suporte crítico para fotorreceptores sobrejacentes, incluindo a captação e degradação diárias de pontas ou fragmentos do segmento externo do fotorreceptor (ao longo deste protocolo, a abreviatura OS significa pontas ou fragmentos de SO em vez de segmentos externos inteiros). Essa captação diária no EPR pós-mitótico acaba sobrecarregando a capacidade fagolisossomal e levando ao acúmulo de material intracelular autofluorescente e indigesto, denominado lipofuscina. Curiosamente, vários estudos também demonstraram que a lipofuscina por EPR pode se acumular sem fagocitose do EO 1,2. A lipofuscina possui vários componentes, incluindo adutos reticulados derivados de retinóides do ciclo visual, e pode ocupar cerca de 20% do volume celular do EPR para pessoas com mais de 80 anos3.

Se a lipofuscina é tóxica tem sido muito debatido. A doença de Stargardt é uma degeneração autossômica recessiva dos fotorreceptores e EPR na qual uma mutação no ABCA4 desencadeia o processamento inadequado dos retinóides do ciclo visual contidos nos segmentos externos dos fotorreceptores. O processamento inadequado dos retinóides leva à reticulação aberrante e à formação de espécies bis-retinoides, incluindo o N-retinilideno-N-retiniretanolamina (A2E) bis-retinireóide. Estudos têm demonstrado múltiplos mecanismos para a toxicidade do A2E 4,5. A lipofuscina contribui para os sinais de autofluorescência do fundo de olho durante exames de imagem clínicos, e tanto os pacientes de Stargardt quanto os modelos animais apresentam aumento da autofluorescência do fundo de olho antes da degeneração retiniana, sugerindo uma correlação entre os níveis de lipofuscina e toxicidade 6,7. No entanto, com a idade, a lipofuscina se acumula em todos os seres humanos sem desencadear uma degeneração do EPR. Além disso, na degeneração macular relacionada à idade (DMRI), em que a degeneração do EPR ocorre apenas em pacientes idosos, aqueles com formas precoce e intermediária da doença têm menos sinais de autofluorescência do fundo do que humanos não doentes pareados por idade8. Esses achados clínicos também foram verificados em nívelhistológico9,10.

Modelos animais de acúmulo de lipofuscina por EPR também deixaram alguma ambiguidade sobre a toxicidade da lipofuscina. O camundongo knockout ABCA4 não apresenta degeneração retiniana em fundo pigmentado, enquanto o faz em fundo albino ou quando exposto à luz azul11,12. Além disso, a toxicidade da lipofuscina derivada via nocaute ABCA4 provavelmente difere da lipofuscina de acúmulo mais lento que ocorre com o envelhecimento natural, como visto na DMRI13.

Modelos in vitro de acúmulo de lipofuscina fornecem uma alternativa para estudar os efeitos do acúmulo de lipofuscina na saúde do EPR. Tais modelos permitem a manipulação de componentes da lipofuscina, desde a alimentação de componentes retinóides únicos até a alimentação de EO, e permitem o estudo em PSE humano e não animal. Nas últimas duas décadas, vários métodos foram desenvolvidos para modelar a lipofuscina de EPR em cultura. Juntamente com outros grupos, o grupo do Dr. Boulton alimentou diariamente a OS bovina por até três meses na passagem de 4 a 7 células humanas primárias de EPR de doadores com idades entre 4 e 85 anos14. Alternativamente, a inibição da autofagia também levou ao acúmulo de lipofuscina nas passagens 3 a 7 culturas primárias de EPR humano15. No entanto, a inibição lisossômica subletal em culturas de EPR pré-natal humano (RPEh) altamente diferenciadas, passagem 1, falhou em induzir lipofuscina, mesmo com a adição repetida de EO diariamente16.

Como uma abordagem mais reducionista, outros têm fornecido componentes únicos de lipofuscina para culturas, especialmente o bis-retinóide A2E 4,17. Tais estudos são valiosos na medida em que definem potenciais mecanismos diretos de toxicidade para componentes individuais da lipofuscina, implicando, por exemplo, colesterol lisossomal e homeostase da ceramida18. Ao mesmo tempo, discute-se a toxicidade da A2E19, e alimentá-la diretamente às células contorna a via típica de acúmulo de lipofuscina, que envolve a fagocitose do fotorreceptor OS. Na tentativa de entregar todos os componentes da lipofuscina às culturas de EPR, Boulton e Marshall purificaram a lipofuscina de olhos humanos e alimentaram esta para a passagem de 4 a 7 culturas humanas primárias de EPR derivadas de doadores humanos fetais e idosos20. Embora inovador, este método representa uma fonte limitada de lipofuscina para experimentos repetidos.

Embora a alimentação repetida de EO para culturas de EPR produza lipofuscina em muitos sistemas, ela falha em culturas de EPR primário altamente diferenciadas16. O EO fotooxidante induz reações de reticulação como a formação de bis-retinóides que ocorre naturalmente durante a formação de lipofuscina in vivo. Isso pode acelerar a formação de grânulos semelhantes à lipofuscina em sistemas de cultura de EPR, mesmo aqueles que são altamente diferenciados e resistentes ao acúmulo de lipofuscina16. Aqui é introduzido um método para induzir o acúmulo de grânulos lipofuscin-like em hfRPE altamente diferenciado e iPSC-RPE humano, modificado a partir do protocolo publicado porWihlmark21. Este método tem a vantagem de induzir grânulos lipofuscin-símile empregando a mesma fonte (fotorreceptor OS) e via (captação de OS fagolisossomal) que ocorre para lipofuscinogênese in vivo. Além disso, é feito em culturas de EPR humano que são altamente diferenciadas e validadas em múltiplos estudos para replicar EPR humano in vivo22,23,24. Esses grânulos semelhantes à lipofuscina são denominados material autofluorescente não digerível (MAU) e fornecem dados e discussão neste protocolo comparando a MAU com a lipofuscina in vivo. Juntamente com métodos para construir e avaliar culturas carregadas de VAM em EPR humano altamente diferenciado, um método atualizado para avaliar a fagocitose do EO do EPR também é introduzido. Vários métodos excelentes de perseguição de pulso para quantificar a fagocitose do EO foram introduzidos, incluindo Western blotting, imunocitoquímica e FACS25,26,27. No entanto, no início da perseguição de pulso do sistema operacional, as condições que levam à baixa absorção do sistema operacional podem ser confundidas com condições que promovem a rápida degradação do sistema operacional internalizado. O método aqui apresentado mede a quantidade total de SO introduzida que é totalmente consumida/degradada pela EPR ("Capacidade Consumptiva Total"), ajudando a eliminar essa ambiguidade. Espera-se que conhecimentos sobre a toxicidade da lipofuscina utilizando estes protocolos, incluindo efeitos sobre as taxas de fagocitose do EO utilizando o método da "Capacidade de Consumo Total", sejam usados para esclarecer a toxicidade da lipofuscina in vivo.

Protocolo

O presente protocolo envolvendo a aquisição e uso de tecido humano foi revisado e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade de Michigan (HUM00105486).

1. Preparação de pontas e fragmentos foto-oxidados do segmento externo

NOTA: As retinas bovinas adaptadas ao escuro foram compradas e enviadas no gelo (ver Tabela de Materiais). A partir dessas retinas, os EO foram purificados seguindo protocolo previamentepublicado23.

  1. Reticulação do segmento externo com uma lâmpada UV
    1. Imergir lâminas revestidas de politetrafluoretileno (ver Tabela de Materiais) completamente em etanol 70% por 10 min em um gabinete de biossegurança para esterilizar as lâminas. Deixe as lâminas secarem ao ar em uma placa estéril de cultura de células de 100 mm.
    2. Colocar cada lâmina numa nova placa de cultura celular de 100 mm e adicionar 200 μL de meio de cultura celular contendo soro (qualquer que seja o meio normalmente utilizado para as culturas de EPR em questão) em cada retângulo e, em seguida, colocar uma luz UV portátil de 254 nm (ver Tabela de Materiais) na placa de cultura de células de 100 mm (sem tampa) com o bulbo directamente virado para a lâmina, e expor por 20 min. A mídia utilizada especificamente para este estudo e os números de produtos específicos para os componentes da mídia foram previamente publicados22,23. Essa mídia é denominada "mídia RPE" em todo este protocolo.
      NOTA: O tratamento UV da mídia bloqueia a superfície de vidro e impede que o sistema operacional grude durante as próximas etapas.
    3. Descongelar alíquotas congeladas de OS a 37 °C (na mão ou em banho-maria). A quantidade de SO necessária depende do aplicativo. Em geral, pode-se tratar até 500 μL de 2 x 108 OS/mL por retângulo na lâmina.
    4. Uma vez descongelado, gire o SO a 2400 x g por 5 min à temperatura ambiente. Aspirar imediatamente o sobrenadante no gabinete de biossegurança usando uma pipeta em vez de um vácuo para evitar a perda acidental do pellet.
    5. Ressuspenda suavemente o pellet com PBS estéril.
      NOTA: Acompanhe o volume ressuspendido e a concentração esperada. por exemplo, ressuspender o pellet de um tubo de 1 mL de 1 x 108 OS/mL com 500 μL PBS produz 2 x 108 OS/mL. O volume e a concentração máximos por retângulo na lâmina revestida com politetrafluoretileno é de 500 μL de 2 x 108 OS/mL.
    6. Aspirar o meio das lâminas e colocar até 500 μL de solução de PBS 2 x 108 OS/mL em cada retângulo da lâmina. Coloque a luz UV portátil sobre a placa de cultura celular (sem tampa) com a lâmpada diretamente voltada para o sistema operacional.
      NOTA: Durante os 40 min de exposição, cubra a lâmpada UV e o prato com uma toalha ou absorvente, feche a faixa do armário de biossegurança e desligue o ventilador. Isso evitará que ocorra qualquer evaporação significativa. Se a lâmpada UV utilizada neste protocolo não estiver disponível para um pesquisador, existem duas alternativas para garantir que a quantidade adequada de reticulação seja alcançada. A primeira é seguir a exposição quantitativa aos raios UV descrita na etapa 1.2, seja com o dispositivo descrito na etapa 1.2 ou outro dispositivo que possa fornecer a mesma exposição radiante quantitativa que o referido dispositivo na etapa 1.2. Outra alternativa é expor OS à irradiação UV por um tempo que induza o grau de reticulação na coloração de Coomassie visto na Figura 1C.
    7. Coletar a solução de PBS OS tratada em tubos de microcentrífuga estéreis, relavar o retângulo da lâmina revestida com 200-500 μL de PBS (2-3x) e coletar cada lavagem no tubo de microcentrífuga. Uma vez feito, olhe para a lâmina sob um microscópio de sala de cultura de tecidos para confirmar que quase todos os sistemas operacionais foram removidos da lâmina.
    8. Gire a solução OS PBS a 2400 x g durante 5 minutos à temperatura ambiente, aspirar o PBS no gabinete de biossegurança com um pipetador e ressuspender em meio padrão de 500 μL que será utilizado para culturas de EPR (por exemplo, - "meio de EPR" definido na secção 1.1.2). O volume de ressuspensão pode ser ajustado com base na concentração desejada de EO fotooxidado (OxOS).
    9. Colocar 10 μL da suspensão em um novo tubo de microcentrífuga, diluir 50-100x com mais meios de cultura celular e contar os EO's com um hemocitômetro.
    10. Com base na contagem de SO, diluir a suspensão de OxOS para uma concentração final de estoque. Para alimentar culturas de EPR altamente maduras em Transwells de 24 poços (área de superfície de 0,33 cm 2; ver Tabela de Materiais), recomenda-se uma concentração final do meio de 2 x 107 OS/mL.
      1. Para isso, distribuir o OxOS em alíquotas de 25 μL na concentração de 5,6 x 107 OS/mL, suspensas em meio de cultura padrão de EPR. Após o descongelamento de uma alíquota de 25 μL, misturar toda a alíquota com 45 μL de meio de cultura padrão de EPR, fornecendo um volume final de 70 μL e concentração de OS de 2 x 107 OS/mL para cada alimentação de OxOS Transwell.
    11. Antes de aliquotar o OxOS, adicione ligantes de ponte de fagocitose (Proteína S e MFG-E8, ver Tabela de Materiais), que facilitam a captação de OS e o acúmulo de lipofuscina. As concentrações de trabalho dos ligantes em ponte em um Transwell de 24 poços são 4 μg/mL para a proteína S purificada humana e 1,5 μg/mL para MFG-E8 recombinante humano. Assim, para alíquotas de 25 μL de OxOS a 5,6 x 107 OS/mL, a concentração de estoque para a proteína S é de 11,2 μg/mL, e para MFG-E8 é de 4,2 μg/mL.
      NOTA: As concentrações de ligantes em ponte foram otimizadas para culturas de hfRPE em Transwells de 24 poços, com uma contagem celular aproximada de 320.000 células por poço de 0,33cm2 . As concentrações dos ligantes podem precisar ser ajustadas para outros tipos de EPR e densidades celulares, uma vez que ligantes presentes em excesso na disponibilidade do receptor de fagocitose podem, paradoxalmente, bloquear a captação de EO28.
    12. Congele rapidamente as alíquotas em nitrogênio líquido.
      NOTA: Vários congelamento-descongelamento são altamente prejudiciais à integridade do sistema operacional.
  2. Reticulação de segmento externo com um dispositivo reticulador UV
    Observação : siga a etapa 1.1, com exceção das etapas abaixo, que substituem as etapas 1.1.2 e 1.1.6, respectivamente:
    1. (substitui a etapa 1.1.2) Coloque cada lâmina em uma nova placa de cultura celular de 100 mm e adicione 200 μL de meio de cultura celular contendo soro (por exemplo, -"meio RPE" ou qualquer outro substituto) em cada retângulo, em seguida, coloque as lâminas em um dispositivo de reticulante ultravioleta (ver Tabela de Materiais), tratando com UV de 254 nm a uma exposição radiante de 3-6 J/cm2 para bloquear a superfície de vidro e evitar a aderência do OS durante as próximas etapas.
    2. (substitui a etapa 1.1.6) Aspirar o meio das lâminas e colocar até 500 μL de 2 x 108 OS/mL em PBS estéril em cada retângulo da lâmina. Coloque as lâminas no dispositivo Crosslinker Ultravioleta, defina a exposição radiante de tratamento conforme necessário (3-9 J/cm2) e trate a 254 nm.
      NOTA: A exposição radiante necessária pode ser cuidadosamente determinada titulando a exposição radiante entre 3-9 J/cm2 até que o grau de autofluorescência e a reticulação de proteínas (como visto na Figura 1B e na Figura 1C) seja alcançada.
      CUIDADO: Manipular o sistema operacional fora de um armário de biossegurança pode resultar em contaminação. Após a exposição do SO ao dispositivo de reticulador UV, colete o SO com pontas de pipeta estéreis, transfira para tubos de microcentrífuga estéreis e manipule todas as etapas adicionais no capô de biossegurança.
  3. Caracterização do EO oxidado
    1. Quantificar o espectro de emissão de autofluorescência por imagem
      1. Coloque 20-50 μL de solução-mãe de OS e OxOS não tratados em dois tubos de microcentrífuga separados. Centrifugar a 2400 x g durante 5 minutos à temperatura ambiente, ressuspender o pellet em paraformaldeído a 4% tamponado (por exemplo, PBS) e fixar durante 15 minutos à temperatura ambiente.
      2. Após a fixação, gire para baixo como acima, lave com PBS x 2 (girando para baixo entre as lavagens) e ressuspenda em menos de 30 μL de PBS.
      3. Coloque alguns microlitros da ressuspensão em uma lâmina de microscópio, adicione a mídia de montagem (consulte a Tabela de Materiais) e, finalmente, uma lamínula.
      4. Imagem OxOS em um microscópio confocal (ver Tabela de Materiais).
        NOTA: A autofluorescência do OxOS pode ser excitada por uma ampla gama de comprimentos de onda de laser, mas uma linha de laser de 405 nm ou 488 nm é normalmente empregada. A emissão é igualmente ampla, mas uma configuração típica de filtro de excitação/emissão GFP/FITC é adequada para visualizar a autofluorescência.
      5. Para medir o espectro de emissão do OxOS, use λ-scanning em um microscópio confocal. Configurações típicas de varredura λ incluem excitação com 405 nm ou 488 nm, e detecção de emissão que varia de 10 nm deslocados para o vermelho da linha de excitação do laser até aproximadamente 800 nm, com um tamanho de passo λ de 10 nm. Cada sistema de microscopia tem suas próprias instruções sobre como empregar o modo λ, e o leitor precisa consultar o manual para seu confocal específico.
    2. Como alternativa, quantificar a autofluorescência por citometria de fluxo.
      1. Gire 2 x 10 7 OS não tratados e separadamente 2 x 107 OxOS em tubos de microcentrífuga e ressuspenda em 1 mL de PBS.
        NOTA: A fixação não é necessária se a citometria de fluxo for realizada diretamente após o descongelamento.
      2. Carregue amostras de OS e OxOS não tratadas em citômetro de fluxo (consulte a Tabela de Materiais). Ajuste a dispersão direta (FSC) e a dispersão lateral (SSC) para uma dispersão aceitável no gráfico de dispersão FSC-SSC. Use PBS como controle para descartar qualquer contaminação de pequenas partículas. Observe que os sistemas operacionais são consideravelmente menores do que as células.
      3. Use o canal FITC padrão do citômetro de fluxo para quantificação de autofluorescência. Conte pelo menos 10.000 eventos. Use o valor da área de pulso do histograma FITC para representar a intensidade da fluorescência.
        NOTA: Para o presente estudo, todos os dados são analisados usando o software de análise de citômetro de fluxo (ver Tabela de Materiais), seguindo as instruções do fabricante.
    3. Avaliar o grau de reticulação no OxOS
      1. Gire 2 x 10 7 OS não tratados e separadamente 2 x 107 OxOS em tubos de microcentrífuga. Remova o sobrenadante e lise diretamente a pastilha adicionando 1,2x Buffer de amostra Laemmli (o suficiente para cobrir; consulte Tabela de materiais). Vórtice, manter à temperatura ambiente durante 30 min, girar à temperatura ambiente a temperatura ambiente igual ou superior a 12000 x g durante 10 minutos e recolher o sobrenadante.
        NOTA: Avaliar o grau de reticulação de proteínas no OxOS dá uma noção da adequação do tratamento UV. A comparação é feita entre OS não tratado e OxOS, e a reticulação adequada ocorre quando a banda de rodopsina monomérica que domina a coloração de Coomassie (Figura 1C, seta) é apenas perceptível, com o surgimento de agregados de ordem superior e um esfregaço proteico no topo do gel.
        CUIDADO: Ao usar o buffer de amostra para lisar o sistema operacional, não aqueça subsequentemente a solução de lise, pois isso pode desencadear a agregação de rodopsina. Evite também resfriar o sistema operacional lisado até que esteja pronto para armazenamento, pois isso precipitará o SDS. Os lisados não utilizados podem ser mantidos a -20 °C. Em caso de descongelamento, certifique-se de que os lisados estão completamente descongelados à temperatura ambiente antes da utilização.
      2. Quantificar a concentração de proteínas utilizando um ensaio proteico tolerante a altas concentrações de SDS e redutores29. Consulte a Tabela de Materiais para obter sugestões sobre reagentes apropriados para ensaios proteicos e siga o protocolo do fabricante para esses reagentes.
      3. Execute amostras de OS e OxOS não tratadas por eletroforese SDS-PAGE30 em um gel de gradiente de 4%-15%, empregando tampão padrão de SDS tris-glicina. O gel é executado a 80 V até que as amostras entrem na pilha e, em seguida, a 120 V por 50-60 minutos à temperatura ambiente.
      4. Coloração do gel com azul de Coomassie utilizando protocolos padrão31. A coloração de Coomassie demonstrará a adequação das ligações cruzadas induzidas pelo tratamento UV.

2. Construção de grânulos semelhantes à lipofuscina (UAM) em culturas de EPR

  1. Alimentação por OxOS: quantidade, frequência e ligantes em ponte de fagocitose
    OBS: As mamadas ocorrem em culturas humanas de iPSC-RPE ou hfRPE na passagem 1, cultivadas de acordo com o protocolo delineado pelo laboratório Bharti (para iPSC-RPE)32 ou nosso protocolo previamente delineado para hfRPE, adaptado do laboratório SheldonMiller22,23. Todos os cálculos abaixo são baseados na alimentação do OxOS ou OS para um Transwell de 24 poços (6,5 mm de diâmetro, 0,33 cm2 de área de crescimento).
    1. Descongelar 25 μL de 5,6 x 107 OxOS/mL a 37 °C e adicionar 45 μL de meio de cultura celular à alíquota de OxOS, resultando em um volume final de 70 μL.
      NOTA: Alíquotas de OxOS preparadas na etapa 1 conterão ligantes de ponte de fagocitose MFG-E8 e Proteína S. No entanto, se esses ligantes não foram adicionados às alíquotas antes do congelamento, eles podem ser adicionados nesta etapa, garantindo que a concentração final dos ligantes no meio a ser alimentado seja de 4 μg/mL para a proteína S e 1,5 μg/mL para MFG-E8. Tal como indicado no ponto 1.1.11, as concentrações de ligantes em ponte podem ter de ser alteradas para outros tipos de EPR ou densidades celulares.
    2. Remover o meio apical de Transwell e adicionar 70 μL de 2 x 107 OxOS/mL com os ligantes em ponte de fagocitose à câmara apical. Após 24 h, remova e substitua por uma nova alimentação OxOS. A alimentação ocorre diariamente durante a semana, pulando fins de semana, até que 20 mamadas sejam concluídas (~1 mês). Trocar o meio de cultura de células basolaterais (400-550 μL) 2-3x/semana.
    3. Após a conclusão de 20 mamadas, retome as mudanças normais de mídia para o poço.
      NOTA: São necessárias várias alterações adicionais de mídia para lavar o OxOS pegajoso da superfície apical do RPE, portanto, os experimentos com as culturas carregadas de UAM devem ser feitos pelo menos 1-2 semanas após a conclusão das alimentações com OxOS.
      CUIDADO: É importante ter controles adequados para o acúmulo de UAM por meio de alimentações OxOS. Como as mudanças diárias na mídia podem afetar a biologia da EPR, recomendam-se os seguintes poços de controle: Controle 1: Substitua os meios diariamente durante a semana pelo mesmo número de mamadas que o grupo tratado com OxOS. Controle 2: Alimentar o EPR não tratado diariamente durante os dias úteis na mesma concentração e volume que as alimentações com OxOS, para o mesmo número de mamadas.
  2. Monitoramento da saúde de culturas carregadas de grânulos semelhantes à lipofuscina por ensaios de resistência elétrica transepitelial (TEER) e morte celular
    NOTA: Durante e após a alimentação com OxOS, a saúde das culturas de EPR pode ser medida avaliando-se a integridade da junção apertada do EPR e a morte celular. Foi demonstrado anteriormente que a avaliação da integridade das tight junctions, por meio da medição da resistência elétrica transepitelial (TEER), é um marcador sensível para a saúde celular geral33. Marcadores não invasivos mais tradicionais de morte celular, como a liberação de lactato desidrogenase (LDH), também podem ser empregados.
    1. Realizar TEER
      NOTA: O TEER é testado com um medidor de resistência elétrica transepitelial (TEER) e eletrodo TEER, geralmente seguindo as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).
      1. Para esterilizar o eletrodo TESE, use um limpador de tarefas embebido em etanol 70% para limpar o eletrodo e, em seguida, imergir as pontas da sonda do eletrodo em etanol 70% por 10 min.
      2. Deixe o eletrodo secar completamente e, em seguida, mergulhe o eletrodo em meio estéril.
      3. Retirar a sonda do meio estéril e inserir as duas sondas do eletrodo TEER nas câmaras apical e basolateral de um Transwell cultivado; A ponta da sonda mais longa se encaixa na câmara basolateral.
        NOTA: É fácil raspar o fundo da câmara apical com o eletrodo TEER sem prática, e essa raspagem alterará drasticamente as leituras TEER à medida que a monocamada de EPR confluente é interrompida. Assim, recomenda-se que os iniciantes pratiquem Transwells não importantes antes de testar em culturas experimentais de EPR. Além disso, depois que cada placa de culturas de EPR é testada, o experimentador deve verificar se há raspagem da monocamada de EPR sob um microscópio de cultura de tecido padrão.
      4. Uma vez que as sondas apicais e basolaterais estejam no lugar no Transwell, pressione o botão de leitura ou pise no interruptor de pé do medidor para registrar o TEER. Entre placas ou grupos de células, lavar a sonda do eletrodo com meios estéreis. Se a infecção for uma alta preocupação, reesterilize entre as placas.
      5. Calcule o TEER tomando a leitura de resistência do medidor, subtraindo o valor de um Transwell em branco com meio, mas sem células (geralmente 100-110 Ω para um Transwell de 24 poços com área de superfície de 0,33cm2 ) e, em seguida, multiplicando pela área de superfície do Transwell.
        NOTA: Os valores TEER devem ser reportados normalizados para a área de superfície celular. Os valores típicos para culturas saudáveis de hfRPE variam de 350-1100 Ωcm2. Os valores de TEER aumentam à medida que a temperatura diminui. Assim, ao remover culturas de uma incubadora de 37 °C para uma capela à temperatura ambiente, os valores de TEER tenderão a aumentar em toda a placa. Para se proteger contra essa variabilidade, trabalhe rapidamente (se experiente) ou aguarde 10-15 minutos para que a temperatura da placa se equilibre com a temperatura ambiente.
    2. Realizar ensaio de liberação de LDH
      NOTA: A libertação de LDH no sobrenadante da cultura celular ocorre durante a morte celular e é medida com um kit padrão (ver Tabela de Materiais).
      1. Recolher o sobrenadante acima das células após uma incubação de 24 h e diluir para 1:100 utilizando meios padrão.
      2. Induzir a liberação total possível de LDH, que é importante para normalizar todos os valores da etapa 2.2.2.1, pela adição de 2 μL 10% triton X-100 aos 100 μL do meio apical das células controle em um Transwell de 24 poços. Depois de incubar a mistura tritão/sobrenadante celular por 15 minutos a 37 °C, misturar o meio acima das células agora lisadas e coletar para medir a liberação total possível de LDH.
      3. Uma vez que os sobrenadantes são coletados, execute o ensaio usando as instruções padrão do fabricante, medindo a luminescência após uma incubação de 30 minutos usando a solução tampão do kit.
        NOTA: Todos os valores de LDH são normalizados para a quantidade total possível de liberação de LDH.
  3. Caracterização do espectro e composição dos grânulos lipofuscin-like
    1. Aquisição de quantificação e espectros de autofluorescência
      1. Fixar culturas carregadas de UAM com PFA a 4% à temperatura ambiente durante 15 minutos, seguido de lavagem com PBS 5x.
      2. Mantenha uma pequena quantidade de PBS na câmara apical e, em seguida, vire o Transwell de cabeça para baixo. Usando um microscópio dissecante e uma lâmina de barbear, corte a membrana semiporosa do Transwell, aplicando força de corte na junção da membrana e Transwell.
        NOTA: Mantenha a consistência sobre o quão perto do lábio do Transwell o corte é feito, pois a membrana Transwell tem uma tendência a empenar e enrugar quando os cortes não são consistentes.
      3. Uma vez cortada a membrana Transwell, coloque imediatamente em uma lâmina de microscópio usando pinças, tomando cuidado para evitar tocar partes da membrana Transwell com células. Evite o excesso de PBS com uma limpeza de tarefa, evitando tocar nas células. Adicione mídia de montagem e uma lamínula. Certifique-se de manter o controle de qual lado do Transwell está "do lado direito para cima" ao cobrir o Transwell.
      4. Adquira a intensidade e os espectros autofluorescentes usando as mesmas configurações e procedimentos das etapas 1.3.1.4 e 1.3.1.5.
        NOTA: Ao criar imagens de UAM, um confundidor importante é que os OxOS são autofluorescentes e muitas vezes aderem à superfície apical do EPR por dias e, às vezes, até semanas após a conclusão da alimentação do OxOS. Como resultado, ao quantificar UAM, um método precisa ser empregado para garantir que a autofluorescência medida seja proveniente de UAM e não de OxOS. O método mais fácil é co-corar culturas de lipofuscina com um anticorpo rodopsina. Por exemplo, o anticorpo anti-rodopsina 4D2 pode ser usado em uma diluição de 1:1000 e com um protocolo padrão de imunocitoquímica de fixação de PFA34. O anticorpo secundário para rodopsina deve ser um anticorpo conjugado com corante vermelho-distante (por exemplo, com um máximo de excitação próximo de 647 nm), já que a autofluorescência UAM e OxOS tende a ser mais fraca nesse comprimento de onda. As imagens confocais podem então ser adquiridas sequencialmente em dois canais, excitando a autofluorescência UAM e OxOS com um laser de 405 nm e emissão de 415 nm a 550 nm, enquanto a rodopsina residual, indicando OxOS não digerida, pode ser excitada com parâmetros padrão de imagem de corante vermelho distante em um canal separado. Após a aquisição, o canal de rodopsina pode ser usado como uma máscara subtrativa em um programa como o ImageJ para remover a autofluorescência vinda do OxOS restante pegajoso, deixando para trás apenas a autofluorescência UAM para quantificar.
        CUIDADO: Mesmo os sistemas operacionais que não são foto-oxidados exibem alguma autofluorescência e, mesmo com lavagem rigorosa, alguns OS e OxOS aderem à superfície do RPE. Assim, sem gerar uma máscara subtrativa usando a imunomarcação por rodopsina, como sugerido na NOTA acima, a quantificação precisa dos níveis de autofluorescência de UAM em culturas alimentadas com OxOs ou EO padrão não é possível.
    2. Realizar detecção simultânea de grânulos semelhantes a lipofuscina e outros marcadores de imunofluorescência
      NOTA: Conforme detalhado na etapa 2.3.1, o amplo espectro de autofluorescência da lipofuscina limita as escolhas para a cocoloração de fluorescência. Os seguintes métodos podem ser considerados para facilitar a cocoloração.
      1. Utilize um fluoróforo vermelho-distante. A autofluorescência da lipofuscina é fraca no infravermelho próximo. Assim, a utilização de um corante vermelho-distante para detecção de fluorescência de um antígeno de interesse, combinada com ajustes cuidadosos de configurações de canal em um microscópio confocal, geralmente pode distinguir autofluorescência de co-coloração.
      2. Aproveite a longa cauda de emissão de fluorescência da lipofuscina.
        NOTA: Como a lipofuscina tem um espectro de emissão de fluorescência muito amplo, muitas vezes pode ser excitada em um comprimento de onda de nm baixo (por exemplo, laser de 405 nm) e ter emissão ainda detectada na porção laranja/vermelha do espectro (por exemplo, 585-635nm). Esta combinação única de comprimentos de onda de excitação e emissão pode muitas vezes ser adaptada em torno de outro fluoróforo de co-coloração.
        1. Detectar o antígeno de interesse usando um fluoróforo que tem pico de excitação em torno de 488 nm, com detecção de emissão em 500-530 nm. Configure um canal separado para detecção de autofluorescência com excitação de 405 nm e emissão de 585-635 nm. Este segundo canal detectará apenas a MAU, enquanto o primeiro canal detectará o antígeno de interesse mais a lipofuscina.
        2. Usando um programa free-ware como o ImageJ, utilize este segundo canal somente UAM-somente como uma máscara subtrativa para remover o sinal UAM do primeiro canal (que contém o sinal de antígeno e o sinal UAM).
      3. Utilize desmistura espectral. A maioria dos microscópios confocais modernos contém uma opção de desmistura espectral. Isso permite adquirir o espectro de uma amostra apenas com UAM e outra amostra apenas com o fluoróforo co-corante de interesse. A amostra experimental, que contém tanto UAM quanto o fluoróforo de co-coloração, pode então ser adquirida e submetida a métodos de desmistura linear para calcular qual porcentagem do sinal veio de autofluorescência versus co-coloração.
        NOTA: Guias abrangentes para desmistura espectral estão disponíveis com a maioria dos microscópios confocais modernos.
      4. Utilize imagens de fluorescência ao longo da vida. Embora o espectro de emissão entre UAM e um fluoróforo de co-coloração de interesse possa ser semelhante, é provável que seus tempos de fluorescência difiram significativamente. Em geral, o UAM demonstra tempos de fluorescência mais curtos do que a maioria dos fluoróforos específicos. Com acesso a um microscópio confocal que permite imagens por toda a vida, pode-se portar sinais de fluorescência para detectar aqueles que são mais longos do que a vida útil típica da lipofuscina.
        NOTA: Em geral, limitar a vida útil da fluorescência a sinais com mais de 2 ns reduz muito a contaminação do UAM, embora não elimine totalmente o sinal.
      5. Utilização de um supressor de autofluorescência. Tradicionalmente, o Sudan Black tem sido usado para extinguir a autofluorescência antes da coloração por imunofluorescência específica35. Vários produtos de quencher de autofluorescência disponíveis comercialmente relatam para melhorar os resultados do Sudan Black, e esses produtos são detalhados na Tabela de Materiais. A supressão da autofluorescência, é claro, destruirá a capacidade de detectar lipofuscina.
    3. Determinar a composição de grânulos semelhantes a lipofuscina
      1. Avaliar lipídios neutros
        1. Fixar PSE carregado de UAM e poços de controle (alimentados com SO não tratado) em PFA 4% à temperatura ambiente por 15 min e lavar com PBS 5x.
        2. Corar para lipídios neutros usando 10 μg/mL de Vermelho do Nilo ou 3,33 μg/mL de Bodipy 493/503 em uma solução de BSA PBS a 3% à temperatura ambiente por 1 h, seguida de lavagem com PBS por 5 min 3x.
        3. Recorte e monte Transwell como nas etapas 2.3.1.2 e 2.3.1.3 e imagem. Em geral, use as seguintes larguras de banda de excitação e emissão para geração de imagens: Nile Red - ex 543 nm, em 620-700 nm e Bodipy 493/503 - ex 488 nm, em 500-550 nm.
      2. Avaliar o colesterol esterificado e não esterificado
        1. Siga o passo 2.3.3.1.1
        2. O filipino é um corante fluorescente que reconhece o colesterol não esterificado, mas não o colesterol esterificado36. Assim, para avaliar a quantidade de colesterol total (não esterificado e esterificado) na UAM, primeiro pré-tratar a amostra com colesterol esterase para converter o colesterol esterificado em colesterol não esterificado. Tratar as células com 20 U/ml de colesterol esterase em tampão fosfato de potássio 0,1 M (pH 7,2) (ver Tabela de Materiais) a 37 °C durante 3,5 horas, seguido de lavagem com PBS durante 5 min 3x.
        3. Coloração com 50 μg/mL de filipina (ver Tabela de Materiais) em PBS à temperatura ambiente por 1 h, e lavar com PBS por 5 min 3x. Mantenha as amostras cobertas, longe da luz, pois a filipina fotobranqueia facilmente.
          NOTA: Se apenas o colesterol não esterificado deve ser quantificado, a colesterol esterase na etapa 2.3.3.2.2 pode ser ignorada. Se a quantidade de colesterol esterificado deve ser quantificada, ela pode ser deduzida pela diferença entre o colesterol total e o colesterol não esterificado na amostra.
        4. Recorte e monte Transwell como nas etapas 2.3.1.2 e 2.3.1.3 e imagem.
          NOTA: Ao criar imagens de filipina, ele fotobranqueia muito rapidamente. É preciso minimizar a intensidade e a duração da excitação, e esperar que algum fotoclareamento possa até ocorrer com a visualização da amostra através dos olhos. Portanto, durante a aquisição de imagens, deve-se: (1) procurar uma área apropriada para a obtenção de imagens usando um canal de fluorescência diferente do canal de filipina, (2) imagem de filipina em um microscópio de campo largo em vez de confocal (para limitar a intensidade da exposição à luz) e (3) evitar imagens repetidas de uma área. Em geral, use as seguintes larguras de banda de excitação e emissão para imagens de filipina - ex 380 nm, em 480 nm.

3. Avaliação dos efeitos dos grânulos lipofuscin-símile na fagocitose do EPR: Capacidade de Consumo Total

NOTA: A justificativa para medir a fagocitose do EO por meio do protocolo somente de pulso do SO abaixo é detalhada na seção de resultados representativos. O método, denominado "Capacidade Consumptiva Total", evita ambiguidades sobre a eficiência da fagocitose que podem surgir com os ensaios tradicionais de fagocitose de perseguição de pulso. Os ensaios são feitos em placas Transwell de 24 poços usando 50 μL de meio contendo 4 x 106 OS/mL.

  1. Calcular o número de poços necessários para o experimento e, em seguida, descongelar uma quantidade apropriada de EO regular, girar para baixo a 2400 x g por 5 min à temperatura ambiente e ressuspender em meio de cultura de células de EPR padrão para 4 x 106 OS/mL. Adicionar ligantes em ponte para facilitar as taxas de fagocitose.
    NOTA: A concentração final dos ligantes em ponte no meio a ser alimentado com as células é de 4 μg/mL para a proteína S e 1,5 μg/mL para MFG-E8. Tal como indicado no ponto 1.1.11, as concentrações de ligantes em ponte podem ter de ser alteradas para outros tipos de EPR ou densidades celulares.
  2. Remover o meio apical e adicionar 50 μL 4 x 106 OS/mL, idealmente com concentrações adequadas de ligantes em ponte.
  3. Em vários momentos após a adição de OS (por exemplo, - 0 h, 1 h, 4 h e 24 h), adicione 16,67 μL 4x tampão de amostra Laemmli com inibidores de protease para lisar ambas as células e o sobrenadante contendo OS. Use uma pipeta P-200 para arranhar a superfície Transwell, tomando cuidado para não perfurar a membrana Transwell ou desprender a membrana do Transwell, e coletar o sobrenadante celular combinado mais lisado celular juntos. Vórtice, gire para baixo e deixe à temperatura ambiente por 30 minutos para uma desnaturação completa.
    CUIDADO: Apesar de usar o Buffer de amostra para lisar o sistema operacional, não aqueça posteriormente a solução de lise, pois isso pode desencadear a agregação de rodopsina. Evite também resfriar o SO lisado até que esteja pronto para armazenamento, pois isso precipitará a proteína. Congelar os lisados não utilizados a -20 °C, certificando-se de que os lisados são totalmente descongelados antes da utilização.
  4. Execute lisados no SDS PAGE usando as mesmas configurações da etapa 1.3.3, carregando volumes iguais de lisados por poço. GAPDH, β-actina ou outra proteína housekeeping devem ser usados para normalizar o número celular, pois as taxas de fagocitose são dependentes do número celular.
  5. Sonda Western blots com anticorpos contra o término N ou C da rodopsina. Use condições padrão de Western blotting, e as diluições de anticorpos estão listadas na Tabela de Materiais.
    NOTA: Abaixo da banda de rodopsina principal, haverá vários fragmentos de rodopsina. Esses fragmentos representam rodopsina parcialmente digerida, processo que se inicia antes da fusão do fagossomo com o lisossomo32,33. Um aumento no número de fragmentos de rodopsina no EPR carregado de VAM em comparação com o EPR controle poderia indicar um defeito a jusante na capacidade do fagolisossomo, no nível de fusão fagossomo-lisossomo, acidificação lisossomal e/ou função enzimática degradativa 16,34,35.

Resultados

A configuração para foto-oxidação do EO é demonstrada na Figura 1Ai. As lâminas revestidas de politetrafluoretileno permitem que um grande volume de OS em solução seja carregado por retângulo aberto sem se espalhar pelo resto da lâmina. A lâmina com OS está contida dentro de uma placa de Petri estéril com a tampa desligada, e uma lâmpada UV é colocada sobre a lâmina, como mostrado na Figura 1Aii. Alternativamente, a lâmina pode ser colocada em u...

Discussão

Embora a lipofuscina por EPR seja estudada há décadas, sua toxicidade é debatida 2,9,16,42. Dada a ambiguidade sobre a toxicidade da lipofuscina em modelosanimais11, modelos in vitro utilizando EPR humano são valiosos. Uma variedade de modelos de acúmulo de lipofuscina in vitro tem sido descrita, mas nenhum utilizou tanto a alimentação OS quanto ...

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho é apoiado, em parte, por subsídios da Vitreo-Retinal Surgery Foundation (VRSF), Fight for Sight (FFS) e International Retinal Research Foundation (IRRF). J.M.L.M. é atualmente apoiado por uma bolsa K08 do National Eye Institute (EY033420). Não foram utilizados recursos federais para a pesquisa em HFT. Outro apoio vem da James Grosfeld Initiative for Dry AMD e dos seguintes doadores privados: Barbara Dunn e Dee e Dickson Brown.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm cell culture dishCorning#353003Others also work
24-well TranswellsCorning#3470
Anti-LC3 antibodyCell Signaling Technology#4801S1:1000 dilution
Anti-rhodopsin antibody 1D4Abcam#54171:1000 dilution. Epitope is C-terminal.
Anti-rhodopsin antibody 4D2EnCor BiotechMCA-B6301:5000 dilution for western blot, 1:1000 dilution for immunostaining. Epitope is N-terminal.
Autofluorescence quencherBiotium#23007TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher
Autofluorescence quencherVector LaboratoriesSP-8400Vector TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit
Bodipy 493/503Life TechnologiesD3922
Cholesterol esterase Life TechnologiesFrom A12216 kit
Confocal microscopeLeicaLeica Stellaris SP8 with FALCON module
Dark-adapted bovine retinasW. L. Lawson CompanyDark-adapted bovine retinas (pre-dissected)Contact information:
https://wllawsoncompany.com/
(402) 499-3161
stacy@wllawsoncompany.com
FilipinSigma-AldrichF4767
Flow cytometerThermo FisherAttune NxT
Flow cytometer analysis software BDFlowJo
Handheld UV light Analytik Jena USUVGL-55
Human MFG-E8Sino Biological10853-H08B
Human purified Protein SEnzyme Research LaboratoriesHPS
Laemmli sample bufferThermo FisherJ60015-AD
LDH assayPromegaJ2380LDH-Glo Cytotoxicity Assay
Mounting mediaInvitrogenP36930Prolong Gold antifade reagent
Nile redSigma-Aldrich#72485
Polytetrafluoroethylene-coated slidesTekdonCustomizedCustomized specifications: PTFE mask with the following "cut-outs" -  3 glass rectangles, each measuring 17 mm x 9 mm, oriented so that the 17 mm side is 4 mm from the top of the slide and 4 mm from the bottom of the slide, assuming a standard microscope slide of 25 mm x 75 mm. Each rectangle is spaced at least 6 mm away from other rectangles and the edges of the slide. Print PTFE mask on a slide with frosted glass on one side to allow for labeling of the slide.
Protease inhibitors Cell Signaling Technology#5872
Protein assayBio-Rad#5000122 RC DC protein assay
TEER electrodeWorld Precision InstrumentsSTX3
Trans-epithelial electrical resistance (TEER) meterWorld Precision InstrumentsEVOM3
Ultraviolet crosslinker deviceAnalytik Jena USUVP CL-1000

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