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Neste Artigo

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Resumo

O protocolo descreve como esferas de compensação à base de porfirina para citometria de fluxo são preparadas pela reação de esferas de poliestireno funcionalizadas com amina com a porfirina TCPP e o reagente de acoplamento amida EDC. Um procedimento de filtração é usado para reduzir os subprodutos particulados.

Resumo

A citometria de fluxo pode caracterizar e quantificar rapidamente diversas populações celulares com base em medidas de fluorescência. As células são primeiramente coradas com um ou mais reagentes fluorescentes, cada um funcionalizado com uma molécula fluorescente diferente (fluoróforo) que se liga às células seletivamente com base em suas características fenotípicas, como a expressão de antígenos de superfície celular. A intensidade de fluorescência de cada reagente ligado às células pode ser medida no citômetro de fluxo usando canais que detectam uma faixa especificada de comprimentos de onda. Quando múltiplos fluoróforos são usados, a luz de fluoróforos individuais geralmente transborda para canais de detecção indesejados, o que requer uma correção nos dados de intensidade de fluorescência em um processo chamado compensação.

Partículas de controle de compensação, tipicamente esferas de polímero ligadas a um único fluoróforo, são necessárias para cada fluoróforo usado em um experimento de marcação celular. Os dados das partículas de compensação do citômetro de fluxo são usados para aplicar uma correção nas medidas de intensidade de fluorescência. Este protocolo descreve a preparação e purificação de esferas de compensação de poliestireno funcionalizadas covalentemente com o reagente fluorescente meso-tetra(4-carboxifenil) porfina (TCPP) e sua aplicação na compensação por citometria de fluxo. Neste trabalho, esferas de poliestireno funcionalizadas com amina foram tratadas com TCPP e o reagente de acoplamento amida EDC (cloridrato de N-(3-dimetilaminopropil)-N′-etilcarbodiimida) em pH 6 e à temperatura ambiente por 16 h com agitação. As esferas de TCPP foram isoladas por centrifugação e ressuspensas em tampão pH 7 para armazenamento. Partículas relacionadas ao TCPP foram observadas como subproduto. O número dessas partículas poderia ser reduzido usando um protocolo de filtração opcional. As esferas TCPP resultantes foram usadas com sucesso em um citômetro de fluxo para compensação em experimentos com células de escarro humano marcadas com múltiplos fluoróforos. As esferas de TCPP mostraram-se estáveis após armazenamento em geladeira por 300 dias.

Introdução

As porfirinas têm sido de interesse há muitos anos na área biomédica devido às suas propriedades fluorescentes e de direcionamento tumoral 1,2,3. Aplicações terapêuticas como a terapia fotodinâmica (TFD) e a terapia sonodinâmica (TSD) envolvem a administração sistêmica de uma porfirina a um paciente com câncer, o acúmulo da droga no tumor e a exposição localizada do tumor a uma luz laser de um comprimento de onda específico ou ultrassom. A exposição à luz laser ou ao ultrassom leva à geração de espécies reativas de oxigênio pela porfirina e subsequente morte celular 4,5. No diagnóstico fotodinâmico (TID), a fluorescência da porfirina é usada para distinguir células cancerosas de células normais6. Nesse contexto, a protoporfirina IX, uma porfirina fluorescente natural que se acumula nos tumores após a injeção sistêmica ou local de seu precursor, o ácido 5-aminolevulínico (5-ALA), é utilizada para identificar tumores estromais gastrointestinais, câncer de bexiga e câncercerebral7,8. Mais recentemente, o tratamento com 5-ALA foi explorado como uma abordagem para detectar doença residual mínima no mielomamúltiplo9. Nosso laboratório vem utilizando a tetraarila porfirina TCPP (5,10,15,20-tetraquis-(4-carboxifenil)-21,23H-porfina) por sua capacidade de corar seletivamente células de câncer de pulmão e células associadas ao câncer em amostras de escarro humano, propriedade que tem sido explorada em ensaios diagnósticos baseados em lâminas e citometria de fluxo10.

Algumas porfirinas são bifuncionais, podendo ser utilizadas como agentes terapêuticos ediagnósticos 2,11. Em pesquisas biomédicas, tais porfirinas bifuncionais são utilizadas para avaliar como sua capacidade de atingir e matar seletivamente células cancerosas é função de sua estrutura, bem como é afetada pela presença de outros compostos 12,13,14,15,16. Tanto a captação celular de porfirinas quanto sua citotoxicidade podem ser medidas em uma plataforma de citometria de fluxo de maneira de alto rendimento. Os espectros de absorção e emissão de porfirinas fluorescentes são complexos, mas a maioria das plataformas de citometria de fluxo está equipada para identificá-los corretamente. O espectro de absorção das porfirinas fluorescentes é caracterizado por uma forte banda de absorção na faixa de 380-500 nm, conhecida como banda de Soret. Duas a quatro bandas de absorção mais fracas são geralmente observadas na faixa de 500-750 nm (bandas Q)17. Um laser azul de 488 nm, presente na maioria dos citômetros de fluxo, ou um laser violeta (405 nm) podem gerar luz do comprimento de onda apropriado para excitar porfirinas. Os espectros de emissão das porfirinas tipicamente exibem picos na faixa de 600-800 nm18, o que resulta em muito pouca sobreposição espectral com fluoróforos de isotiocianato de fluoresceína ou ficoeritrina (PE), mas considerável sobreposição com outros fluoróforos frequentemente usados, como aloficocianina (APC), bem como fluoróforos tandem, como PE-Cy5 e outros. Portanto, ao usar porfirinas em ensaios de citometria de fluxo multicolorida, controles de fluoróforo único são essenciais para corrigir adequadamente o transbordamento da fluorescência em canais diferentes daquele designado para medir a fluorescência da porfirina.

Idealmente, os controles de fluoróforo único usados para calcular a matriz de transbordamento para um painel de fluoróforos (também chamados de "controles de compensação") devem consistir no(s) mesmo(s) tipo(s) de célula que a amostra. No entanto, usar a amostra para esse propósito não é ideal se houver muito pouca amostra para começar ou se a população-alvo dentro da amostra for muito pequena (por exemplo, se quisermos olhar para doença residual mínima ou células cancerosas nos estágios iniciais da doença). Uma alternativa útil às células são as esferas acopladas ao mesmo fluoróforo que é usado para analisar a amostra. Muitas dessas contas estão disponíveis comercialmente; Essas esferas são pré-marcadas com o fluoróforo desejado (esferas específicas de fluoróforo pré-marcadas)19,20, ou um anticorpo fluorescentemente marcado pode ser anexado a elas (esferas de captura de anticorpos)20,21. Enquanto esferas de compensação comercial estão disponíveis para muitos fluoróforos, tais contas não estão disponíveis para porfirinas, apesar de seu uso crescente em pesquisa básica e clínica.

Além da preservação da amostra e do dimensionamento adequado das populações positivas versus negativas, as outras vantagens do uso de esferas como controles de compensação são a facilidade de preparo, a baixa fluorescência de fundo e a excelente estabilidade ao longo do tempo22. A desvantagem potencial do uso de contas como um controle de compensação é que o espectro de emissão do anticorpo fluorescente capturado em esferas pode diferir daquele do mesmo anticorpo usado para marcar as células. Isso pode ser de importância específica quando se utiliza um citômetro de fluxo espectral20. Portanto, o desenvolvimento de contas como controle de compensação precisa ser realizado no citômetro de fluxo que será utilizado para o ensaio para o qual as contas são desenvolvidas. Além disso, o desenvolvimento das esferas precisa incluir uma comparação com células marcadas com o mesmo reagente de coloração fluorescente.

Aqui, descrevemos a preparação de esferas de compensação de poliestireno funcionalizadas com amina TCPP, cuja intensidade mediana de fluorescência no canal de detecção foi comparável à das células marcadas com TCPP no escarro, e seu uso como controles de compensação para citometria de fluxo. A autofluorescência de esferas equivalentes não funcionalizadas foi suficientemente baixa para seu uso como controles de compensação de fluorescência negativa. Além disso, essas contas demonstraram estabilidade no armazenamento por quase 1 ano.

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Protocolo

Todos os procedimentos precisam ser feitos com equipamentos de proteção individual adequados.

1. Preparo da solução-estoque de TCPP, 1,0 mg/mL

NOTA: Isso pode ser preparado mensalmente.

  1. Usando uma balança analítica, espátula e papel de pesagem, pesar 49,0-50,9 mg de TCPP. Arredondar o peso para 1/10 de miligrama. Separe a quantidade medida de TCPP protegida da luz.
    Observação : use uma arma estática se a leitura de peso é instável.
  2. Determinar as quantidades necessárias de água purificada e isopropanol (IPA) da Tabela 1 com base na quantidade de TCPP pesada na etapa 1.1. Adicione a água purificada e o isopropanol a um copo de vidro de 100 mL e cubra com parafilme para proteger da evaporação.
  3. Determinar a quantidade necessária de bicarbonato de sódio na Tabela 1 com base na quantidade de TCPP pesada na etapa 1.1 .
  4. Usando a balança analítica, espátula e papel de pesagem, pesar a quantidade necessária de bicarbonato de sódio determinada na etapa 1.3. Arredondar o peso para 1/10 de miligrama.
    Observação : use uma arma estática se a leitura de peso é instável.
  5. Adicionar o bicarbonato de sódio ao copo de 100 mL contendo água purificada e isopropanol. Cubra a solução com parafilme para proteger da evaporação.
  6. Coloque a solução do passo 1.5 num prato agitado e mexa até dissolver (aprox. 10 min)
  7. Medir o pH para garantir que a solução contendo bicarbonato de sódio do passo 1.6 tem um pH entre 9 e 10.
  8. Adicione lentamente o TCPP pesado no passo 1.1 à solução do passo 1.7 e continue a mexer até dissolver (~30 min). Proteja da luz durante esta etapa.
  9. Conservar num recipiente de vidro ou polipropileno à temperatura ambiente e protegido da luz.

2. Preparação de ácido 2-(N-morfolino)-etanossulfónico (MES) e solução tampão de sal hemissódico, 0,1 M, pH 6,0-6,2 ("tampão MES")

NOTA: Este deve ser preparado no dia da utilização e mantido à temperatura ambiente.

  1. Pesar 2,50 g de sal hemissódico MES e adicioná-lo a um frasco plástico de 150 ml.
  2. Adicionar 121 mL de água purificada e dissolver por agitação manual até que nenhum sólido seja visível.
  3. Medir o pH do tampão MES para garantir que está entre 6 e 6.2.
  4. Manter em temperatura ambiente para uso no mesmo dia.

3. N-(3-Dimethlyaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide (EDC) pó

  1. Retire o pó de EDC do congelador e deixe descansar à temperatura ambiente até ser utilizado no passo 5.

4. Combinando esferas de poliestireno funcionalizadas com amina com solução TCPP

  1. Adicionar 4,3 ml da solução tampão 0,1 M MES preparada no passo 2 a um tubo de polipropileno de 15 ml.
  2. Vortex a suspensão de esferas de poliestireno funcionalizado com amina (10 μm, 2,5% p/v) por 60 s na velocidade máxima.
  3. Adicionar 288 μL desta suspensão de contas recém-vórtice ao tampão MES a partir do passo 4.1.
  4. Vórtice a solução MES/grânulos por 15 s na velocidade máxima.
  5. Vórtice a solução de TCPP 1 mg/mL preparada na etapa 1 por 60 s na velocidade máxima.
  6. Adicionar 1,20 ml desta solução-mãe TCPP recém-vórtice à suspensão MES/grânulos do passo 4.4.
  7. Vórtice a suspensão MES/bead/TCPP por 15 s na velocidade máxima.
  8. Cubra o tubo com papel alumínio enquanto a solução de EDC é preparada.

5. Preparação da solução-mãe de N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida (EDC) hidrocolédeo (HCl)

NOTA: A solução de EDC é perecível e deve ser usada imediatamente após a preparação.

  1. Adicionar 20,0 mL de água purificada a um novo tubo cônico de 50 mL.
  2. Pesar 200 mg de EDC HCl a partir do passo 3 e adicioná-lo à água (passo 5.1).
  3. Vortex o EDC HCL por 15 s na velocidade máxima para gerar uma solução clara.

6. Preparação da solução de trabalho EDC HCl/MES

NOTA: A solução EDC HCl/MES é perecível e deve ser utilizada imediatamente após a preparação.

  1. Adicionar 54,0 ml de solução tampão MES (preparada no passo 2) a um frasco de plástico de 150 ml.
  2. Adicionar 6,0 ml da solução-mãe EDC HCl (preparada no passo 5) à solução-tampão MES e misturar agitando durante 10 s.

7. Rotulando as contas com TCPP

  1. Adicionar 4,5 ml de solução de trabalho EDC (a partir do passo 6) ao tubo de polipropileno de 15 ml que contém as esferas e o TCPP no tampão MES (passo 4.7).
  2. Coloque o tubo num rotador inversor a 35 rpm durante 16 h à temperatura ambiente e protegido da luz.
  3. Centrifugar o tubo à temperatura ambiente durante 10 min a 1.000 × g.
  4. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as esferas em 0,8 mL de solução salina balanceada de Hanks (HBSS).
  5. Transferir a solução de esferas para um frasco para injetáveis de polipropileno âmbar com uma pipeta de 1 ml e conservar a 4 °C até nova utilização.
    NOTA: As contas são estáveis por pelo menos 3 meses neste momento.

8. Verificação da qualidade (QC) das esferas de TCPP por citometria de fluxo

NOTA: O CQ deve centrar-se em saber se a intensidade média de fluorescência (MFI) das esferas TCPP é suficientemente brilhante para a sua utilização pretendida e a quantidade de partículas geradas pelo procedimento. Consulte a seção de resultados representativos para obter mais detalhes.

  1. Rotule um tubo de poliestireno de 5 mL como "contas TCPP negativas".
    NOTA: As contas negativas são diferentes das contas funcionalizadas com amina usadas para rotulagem. Veja a Tabela de Materiais.
  2. Rotule outro tubo como "contas TCPP positivas".
  3. Rotule outro tubo como "contas do arco-íris".
  4. Alíquota 300 μL de HBSS gelado nos tubos marcados com "contas TCPP negativas" e "contas TCPP positivas".
  5. Adicione 500 μL de HBSS gelado no tubo rotulado como "Contas do arco-íris".
  6. Vórtice a suspensão de esferas de poliestireno não funcionalizado (não rotulado) brevemente à velocidade máxima (2-3 s) e adicione 10 μL dela ao tubo rotulado como "contas negativas TCPP".
  7. Vórtice a suspensão de contas marcada com TCPP (finalizada na etapa 7.5) brevemente na velocidade máxima e adicione 3 μL dela ao tubo "contas positivas TCPP".
  8. Vortex a suspensão de contas Rainbow brevemente na velocidade máxima, e adicione duas gotas dela no tubo "Rainbow beads".
  9. Mantenha todos os tubos no gelo, cobertos e protegidos da luz.
  10. Inicie os procedimentos de inicialização diários apropriados do citômetro de fluxo e execute um CQ para verificar os fluidos ideais e o alinhamento do laser.
    OBS: Para esta parte do protocolo, presume-se que o operador seja treinado no uso do citômetro de fluxo disponível, incluindo os procedimentos de padronização da dispersão de luz e intensidade de fluorescência, bem como os princípios básicos de cálculo da matriz de compensação correta.
  11. Execute as contas Rainbow e as contas TCPP sem alterar as configurações de tensão entre as diferentes corridas.
    1. Corra e colete 10.000 eventos das contas do arco-íris.
    2. Realize um enxágue com água e colete 10.000 eventos das contas TCPP-negativas.
    3. Realize um enxágue com água e colete 10.000 eventos das contas TCPP-positivas.
    4. Realize um enxágue com água de 1 min.
      OBS: É importante realizar um enxágue com água após passar as contas TCPP. Se o TCPP não for enxaguado das linhas no citômetro, existe a possibilidade de que o TCPP residual possa marcar as células no próximo tubo a ser adquirido.
    5. Executar os protocolos de limpeza e desligamento apropriados específicos para as instruções do fabricante para o citômetro.
      NOTA: Para obter resultados representativos, consulte a Figura 1.

9. Filtração de contas

NOTA: Se o CQ das esferas por citometria de fluxo (passo 8) mostrar uma alta proporção de partículas (70% ou mais), considere filtrar a suspensão do cordão usando o protocolo abaixo (Figura 2).

  1. Adicionar 3,20 mL de HBSS gelado a 0,8 mL da suspensão do cordão TCPP finalizada na etapa 7.5 (criando uma diluição de cinco vezes).
  2. Vórtice a suspensão de esferas diluídas à velocidade máxima durante 15 s.
  3. Retire o êmbolo de uma seringa descartável de 5 mL.
  4. Encaixe a seringa com um filtro de ponta de fibra de vidro (5 μm, 13 mm de diâmetro).
  5. Adicionar 4 ml de HBSS à seringa.
  6. Adicionar 0,5 ml da suspensão de grânulos diluídos em vórtice (passo 9.2).
  7. Use o êmbolo para filtrar a suspensão através da configuração da seringa/filtro a aproximadamente 2 gotas/s.
  8. Lave as contas retirando 5 mL de HBSS fresco para a seringa através do filtro a aproximadamente 2 gotas/s.
  9. Empurre o HBSS novamente para o recipiente de resíduos a aproximadamente 2 gotas/s.
  10. Para remover as contas do filtro, introduza mais 5 ml de HBSS fresco na seringa através do filtro.
  11. Retire cuidadosamente o filtro da seringa.
  12. Ejetar a suspensão do talão da seringa para um tubo de centrífuga cônica de 50 mL.
  13. Coloque o filtro novamente na seringa e repita as etapas 9.10-9.12 mais quatro vezes. Em seguida, descarte o filtro e a seringa.
  14. Repita as etapas 9.2-9.13 até que todas as contas da etapa 9.1 tenham sido filtradas. Use uma seringa fresca e filtre cada vez.
  15. Centrifugar as suspensões de esferas filtradas por 10 min a 1.000 × g à temperatura ambiente.
  16. Aspirar o sobrenadante de cada tubo de 50 mL e ressuspender suavemente as contas, combinando-as em 0,5 mL de HBSS fresco.
  17. Transfira as contas com uma micropipeta p1.000 para um novo frasco para injetáveis de âmbar, vidro ou polipropileno e armazene a 4 °C.
  18. Repita a etapa 8 para determinar se a proporção de partículas relacionadas ao TCPP na suspensão do cordão filtrado diminuiu. Para obter resultados representativos, consulte a Figura 3.

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Resultados

Este protocolo para a marcação TCPP de contas é relativamente rápido e eficiente. A Figura 1 mostra um resultado representativo do processo de marcação de esferas TCPP determinado por citometria de fluxo. A Figura 1A mostra o perfil padronizado das contas Rainbow, conforme detectado no canal apropriado para detecção de TCPP. Essas esferas servem como um QC para a padronização das tensões do laser para a detecção de TCPP pelo citômetro de fluxo.

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Discussão

Apesar das inúmeras aplicações das porfirinas no diagnóstico e terapêutica docâncer2, há pouca literatura sobre seu potencial uso como reagente de citometria de fluxo para a identificação de populações de células cancerosas versus não cancerosas em tecidos humanos primários24,25,26. Nossa pesquisa na análise por citometria de fluxo do escarro humano24,27

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Divulgações

Todos os autores são funcionários da bioAffinity Technologies.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer a David Rodriguez pela assistência com a preparação da figura e Serviços de Patologia de Precisão (San Antonio, TX) pelo uso de seu citômetro de fluxo Navios EX.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Amber plastic vials, 2 mL, U- bottom, polypropyleneResearch Products International  ZC1028-500
Amine-funtionalized polystyrene divinylbenzene crosslinked (PS/DVB) beads, 10.6 μm diameter, 2.5% w/v aqueous suspension, 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ beadSpherotechAPX-100-10Diameter spec. 8.0-12.9 um, suspension 2.5% w/v 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead
Conical tubes, 50 mL, FalconFisher Scientific14-432-22
Centrifugewith appropriate rotor
Disposable polystyrene bottle with cap, 150 mLFisher Scientific09-761-140
EDC (N- (3- dimethylaminopropyl)- N'- ethylcarbodiimide hydrochloride), ≥98%Sigma03450-1GCAS No:  25952-53-8
FlowJo Single Cell Analysis Software (v10.6.1)BD
Glass coverslips, 22 x 22 mmFisher Scientific12-540-BP
Glass fiber syringe filters (Finneran, 5 µm, 13 mm diameter)Thomas Scientific1190M60
Glass microscope slides, 275 x 75 x 1 mmFisher Scientific12-550-143
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)Fisher Scientific14-175-095
Isopropanol, ACS gradeFisher ScientificAC423830010
Mechanical pipette, 1 channel, 100-1000 uL with tipsEppendorf3123000918
MES (22- (N- mopholino)- N'- ethanesulfonic acid, hemisodium saltSigmaM0164CAS No:  117961-21-4
Navios EX flow cytometerBeckman Coulter
Olympus BX-40 microscope with DP73 camera and 40X objective with cellSens softwareOlympusor similar
Pasteur pipettes, glass, 5.75"Fisher Scientific13-678-6B
pH meter (UB 10 Ultra Basic)Denver Instruments
Pipette controller (Drummond)Pipete.comDP101
Plastic Syringe, 5 mLFisher Scientific14955452
Polystyrene Particles (non-functionalized), SPHERO,  2.5% w/v, 8.0-12.9 µmSpherotechPP-100-10 
Polypropylene tubes, 15mL, conicalFisher Scientific14-959-53A
Polystyrene tubes, round bottom Fisher Scientific14-959-2A
Rainbow Beads (Spherotech URCP-50-2K)Fisher ScientificNC9207381
Serological pipettes, disposable - 10 mLFisher Scientific07-200-574
Serological pipettes, disposable - 25 mLFisher Scientific07-200-576
Sodium bicarbonate (NaHCO3)SigmaS6014CAS No:  144-55-8
TCPP (meso-tetra(4-carboxyphenyl)porphine)  Frontier Scientific Fisher Scientific50-393-68CAS No:  14609-54-2
Tecan Spark Plate Reader (or similar)Tecan Life Sciences
Tube revolver/rotatorThermo Fisher88881001
Vortex mixerFisher Scientific2215365

Referências

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