Efeito Analgésico de Tuina em Modelos de Rato com Compressão da Dor do Gânglio da Raiz Dorsal

Resumo

Este artigo apresenta uma manipulação para o tratamento da compressão crônica do gânglio da raiz dorsal em ratos utilizando a terapia com Tuina, juntamente com um método para avaliar sua eficácia baseado no comportamento da dor e nos resultados histopatológicos.

Resumo

A dor neuropática é uma condição prevalente que afeta de 6,9% a 10% da população e resulta de lesão nervosa devido a várias etiologias, como hérnia de disco lombar, estenose do canal vertebral e estenose do forame intervertebral. Embora Tuina, uma terapia manual tradicional chinesa, tenha mostrado efeitos analgésicos na prática clínica para o tratamento da dor neuropática, seus mecanismos neurobiológicos subjacentes permanecem obscuros. Modelos animais são essenciais para elucidar os princípios básicos de Tuina. Neste estudo, propomos um protocolo de Tuina padronizado para ratos com compressão do gânglio da raiz dorsal (DRG), que envolve induzir a compressão DRG através da inserção de uma haste de aço inoxidável no forame intervertebral, realizar a manipulação de Tuina com parâmetros específicos de localização, intensidade e frequência em um ambiente controlado, e avaliar os resultados comportamentais e histopatológicos do tratamento com Tuina. Este artigo também discute as potenciais implicações clínicas e limitações do estudo e sugere direções para futuras pesquisas sobre Tuina.

Introdução

Em situações clínicas, é comum observar dor patológica neurológica causada pela compressão da raiz nervosa devido a vários motivos. A forma mais típica dessa dor neuropática é a hérnia discal lombar (DHL), que muitas vezes é persistente, recorrente e de difícil cura. Aproximadamente 9% da população mundial é afetada pela LDH, levando a encargos sociais e econômicos significativos¹. A incidência desse tipo de dor neuropática vem aumentando a cada ano, com tendência a pacientes mais jovens, devido às mudanças na produção humana e no estilo de vida². Apesar do uso de analgésicos não esteroides, os sintomas dos pacientes não podem ser completamente aliviados. Como resultado, terapias alternativas, como Tuina, para o tratamento da dor causada pela LDH têm ganhado cada vez mais atenção.

A terapia com Tuina, uma forma de tratamento conservador da LDH, é amplamente recomendada em várias diretrizes de prática clínica em todo o mundo para prevenir e tratar a dor lombar ^3,4. Pesquisas mostraram que Tuina pode reduzir significativamente fatores inflamatórios, como níveis séricos de IL-6 e fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) em pacientes com LDH, melhorando a dor e o comprometimento da função lombar⁵. No entanto, o mecanismo específico por trás dos efeitos de alívio da dor da terapia Tuina permanece obscuro.

Modelos animais são uma ferramenta valiosa para o estudo da dor neuropática causada pela LDH⁶. Eles permitem medidas comportamentais para avaliar a eficácia da terapia com Tuina e fornecem amostras da fisiologia patológica da LDH. Por exemplo, amostras dos gânglios da raiz dorsal na coxa podem ser colhidas para verificar alterações nas células ganglionares da raiz dorsal. A compressão crônica do modelo do gânglio da raiz dorsal (CCD) é comumente utilizada para avaliar a fisiologia patológica da LDH, pois causa danos à morfologia das células ganglionares da raiz dorsal que são consistentes com as alterações patológicas observadas em casos clínicos de compressão nervosa causada por hérnia de^disco7.

Muitos estudiosos têm realizado diversos experimentos em animais sobre analgesia por acupressão 8,9,10. No entanto, ao implementar operações de acupressão em modelos animais, eles muitas vezes imitam a acupressão humana. O efeito terapêutico da acupressão é afetado por fatores como tamanho, frequência e direção da força aplicada^11,12,13. Se o experimento não tiver um padrão unificado de acupressão, como força, frequência e duração da operação, isso pode causar algum desvio nos resultados experimentais. Este artigo apresenta um conjunto de planos de tratamento com acupressão baseados nas características de ratos CCD e promove o desenvolvimento de operações padronizadas de acupressão em modelos animais.

Protocolo

Este trabalho foi realizado no Laboratório de Dor do Instituto de Neurobiologia da Universidade de Fudan. Os experimentos foram aprovados e seguiram rigorosamente as diretrizes de proteção de animais de laboratório estabelecidas pela Associação Internacional para o Estudo da Dor (LASP) para todos os procedimentos cirúrgicos e manuseio dos animais. Foram utilizados ratos Sprague-Dawley (SD) grau limpo, constituídos por 32 machos entre 40-50 dias de idade, com peso médio de 220 ± 1,38 g. Estes ratos foram obtidos do Centro de Animais Experimentais da Academia de Ciências da Vida de Xangai, Academia Chinesa de Ciências. Os animais foram devidamente cuidados e alojados em uma sala dedicada com ventilação independente, temperatura regulada (22 ± 1 °C) e umidade (40%-50%). Os ratos tiveram acesso a ração e água adequadas em suas gaiolas. A sala de animais de laboratório seguiu um ciclo claro-escuro de 12 h para manter a regularidade dos ritmos circadianos dos ratos, e o pessoal designado substituiu regularmente o preenchimento. O raio-X foi realizado no Departamento de Radiologia do Hospital Yueyang de Medicina Tradicional Chinesa Integrada e Ocidental, afiliado à Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Xangai.

1. Participantes do estudo e agrupamento

1. Atribuir 32 ratos em quatro grupos: virgens (controle), sham (operação simulada), CCD (compressão crônica do gânglio da raiz dorsal) e CCD + Tuina (8 ratos/grupo). Os ratos tiveram livre acesso a ração e água em biotérios.
   OBS: Ratos virgens não tiveram intervenção, enquanto o grupo sham foi submetido ao mesmo procedimento cirúrgico que os ratos do grupo CCD, porém sem deixar haste de aço inoxidável em forma de "L" no forame intervertebral L4 e L5. Os ratos do grupo DCC foram submetidos à cirurgia completa do modelo de compressão do gânglio da raiz dorsal crônica. Os ratos do grupo CCD + Tuina receberam terapia com tuina a partir do quarto dia após a cirurgia de DCC.

2. Estabelecimento do modelo animal

1. Administrar isofluorano para anestesiar ratos. Uma vez que os ratos perdem a consciência (sem reflexo de movimento da cauda ou reflexo de flexão das pernas), raspe os pelos na área cirúrgica usando uma navalha.
   OBS: As drogas analgésicas foram aplicadas 15 minutos antes da cirurgia e os ratos foram injetados por via subcutânea com tramadol 20 mg/kg.
2. Prenda o rato em uma placa de espuma (veja Tabela de Materiais) e use elásticos para prender seus membros e incisivos. Limpe a área preparada com uma preparação estéril de alternância de álcool e iodo por um mínimo de 3 ciclos.
3. Insira a sonda em forma de "L" (consulte a Tabela de Materiais).
   1. Use uma tesoura para fazer uma incisão de 2-3 cm através da pele, fáscia superficial e fáscia profunda camada por camada. Primeiro, localize a espinha ilíaca anterossuperior, que corresponde à quinta coluna lombar. Em seguida, localize sequencialmente o terceiro e quarto processos espinhosos.
   2. Aperte o processo espinhoso com pinça dentada e levante-o para permitir que a tesoura fique perto do lado direito do processo espinhoso e corte o músculo preso ao lado direito do processo espinhoso.
   3. Em seguida, dissecar bruscamente o músculo aderido à superfície externa da placa vertebral até que haja resistência para o lado direito. A protrusão é a articulação zigapofisária. Da mesma forma, dissecar bruscamente o músculo e a fáscia na articulação zigapofisial.
      NOTA: O processo transversal apontando para a direção da cabeça do rato será tocado primeiro na parte inferior externa frontal da articulação zigapofisial. Abaixo do processo transverso está o forame intervertebral, que é preenchido por raízes nervosas e tecidos moles circundantes e geralmente não é fácil de encontrar.
   4. Primeiro, use uma sonda em forma de "L" para determinar a posição do forame intervertebral e, em seguida, use uma haste de aço inoxidável em forma de "L" (que precisa ser feita com um diâmetro de 0,4 mm e um comprimento de 4 mm) para inseri-la no forame intervertebral.
   5. Se o gânglio da raiz dorsal for comprimido com sucesso, o rato exibirá um movimento da cauda e reflexo de flexão da perna. Inserir a haste de aço inoxidável no quarto e quinto forame intervertebral lombar. Em seguida, sutura (3-0, ver Tabela de Materiais) do músculo, fáscia e pele camada por camada.
4. Coloque o rato em uma caixa termostática até acordar. Após acordar, observe se a função do membro posterior direito do rato está normal. Se houver arrasto, significa que a operação lesionou os nervos motores, e o rato deve ser descartado. Se a função do membro posterior direito for normal, o rato pode ser usado e colocado em uma gaiola para alimentação.

3. Terapia Tuina

1. Estabeleça um ambiente confortável: antes de iniciar a terapia com Tuina, aclimate o rato no filtro por 30 min para permitir sua adaptação (Figura 1). Este dispositivo pode expor totalmente a coxa do rato e imobilizá-la, facilitando as manobras de Tuina (ver Tabela de Materiais).
   NOTA: A temperatura na sala de tratamento deve ser mantida entre 22-26 °C, e a umidade deve estar entre 40%-50%.
2. Padronização da Tuina: garantir que os terapeutas usem mangas de dedo sem fio que possam monitorar a pressão e a frequência da Tuina e fornecer dados de feedback em tempo real. Primeiro, pratique Tuina com os dados de feedback das mangas digitais, ajustando a força para 5 N e a frequência para 2 Hz. Em seguida, realizar as mesmas manobras nos ratos, mantendo força e frequência consistentes durante todo o procedimento (Figura 2).
   NOTA: Com base em nosso trabalho anterior, a força de pressão ideal calculada é de 5 N (consulte a seção Discussão para obter detalhes).
3. Identificar o acuponto: selecionar o músculo gastrocnêmio do membro posterior direito como a área de Tuina do rato, na junção das duas cabeças do músculo gastrocnêmio, aproximadamente no local da LB57¹⁴.
4. Realizar a Tuina: certifique-se de que o terapeuta fique voltado para a face posterior da coxa do rato e segure o membro posterior direito do rato com o membro superior direito. Posicione o polegar verticalmente sobre o acuponto BL57 e assegure-se de que o antebraço e os dedos exerçam força para realizar movimentos rotativos rítmicos de pequena amplitude enquanto aplicam uma pressão de 5 N (Figura 3).
5. Durante o tratamento, certifique-se de que a força e a frequência do feedback de manipulação correspondam aos valores predefinidos. Iniciar a intervenção a partir do quarto dia de pós-operatório, com Tuina realizada uma vez ao dia por 15 min, continuamente por 18 dias.

4. Teste comportamental para dor

OBS: Os testes comportamentais foram realizados antes da modelagem, após a modelagem, no dia 1 de intervenção, no dia 3 de intervenção, no dia 7 de intervenção, no dia 14 de intervenção, no dia 17 de intervenção e no dia 21 de intervenção.

1. Execute o Limiar de Resposta à Estimulação Mecânica (Paw Withdrawal Threshold, PWT) seguindo os passos abaixo (Figura 4).
   1. Utilizar o método de von Frey para testar o limiar de resposta da estimulação mecânica nos pés de ratos. Colocar os ratos em um compartimento de vidro temperado transparente medindo 20 cm × 10 cm × 20 cm, que foi colocado em um suporte de grade de arame metálico com aberturas de 10 mm × 10 mm a uma altura de 40 cm. Mantenha a temperatura ambiente em 23 ± 2 °C e o ambiente circundante silencioso.
   2. Meça o limiar de retirada mecânica com fibras eletrônicas de Von Frey (ver Tabela de Materiais). Estimule o centro do pé do rato até que ele se mova visivelmente, como levantar a perna ou evitá-la. A máquina registra o valor da pressão máxima (N) automaticamente.
   3. Aguarde 15 s ou mais antes de estimular o mesmo rato novamente. Mantenha cada estimulação abaixo de 5 s para evitar a sensibilização tátil nas patas do rato. Repetir o teste cinco vezes até que as três medidas consecutivas difiram em menos de 10 N.
2. Realizar a Latência de Retirada da Pata (LPP) em resposta à estimulação térmica (Figura 5).
   1. Avaliar a LEP pelo método de Hargreaves^15,16. Coloque os ratos em uma pequena câmara de vidro temperado transparente, medindo 20 cm x 10 cm x 20 cm, com tampa de vidro transparente com orifício de ventilação. Aqueça a área central da tampa de vidro a 45 °C usando uma placa de aquecimento até atingir uma temperatura estável.
   2. Durante a fase de teste comportamental, aclimatar os ratos ao laboratório comportamental por pelo menos 2 h por dia para minimizar o impacto dos fatores ambientais nos resultados do teste.
   3. Antes do teste formal, coloque os ratos no laboratório comportamental por 30 min para permitir que eles se adaptem ao ambiente e reduzam a interferência.
   4. Aqueça a placa de aquecimento a 45 °C e coloque os membros posteriores do rato na placa de aquecimento.
   5. A latência de retirada da pata (LPP) foi definida como o tempo desde o início do aquecimento até o aparecimento do reflexo de retirada da pata em resposta à estimulação térmica. Em cada teste, testar o mesmo membro pélvico três vezes seguidas, sendo o valor médio para obter a latência de resposta desse membro pélvico. Após os testes, devolva os ratos às suas gaiolas para alimentação.

5. Perfusão

1. Modo de preparo: preparar previamente uma solução salina a 0,9% e uma solução de paraformaldeído a 4%. Colocar a solução salina num forno regulado para uma temperatura constante de 37 °C e conservar a solução de paraformaldeído num frigorífico a 4 °C para utilização posterior.
2. Realizar anestesia e estabelecer acesso.
   1. Comece injetando 25% de uretano (0,6 mL/100 g, ver Tabela de Materiais) na cavidade abdominal do rato para induzir anestesia profunda. Aguarde até que nenhum reflexo de dedo, córnea ou giro seja observado. Fixe o rato em uma placa de espuma.
   2. Corte o osso do peito com tesoura e abra a pele e a fáscia camada por camada. Corte o diafragma e corte as costelas de ambos os lados para expor totalmente o coração. Separe cuidadosamente o pericárdio. Separe os pulmões do coração.
   3. Use pinças para puxar e expor a aorta, puxando o coração em direção a si mesmo. Alinhar a agulha, o ventrículo esquerdo e a aorta em linha reta e no mesmo plano horizontal. Em seguida, insira a agulha do ventrículo esquerdo na aorta até que a agulha fique visível dentro da aorta.
   4. Use pinça para pinçar a aorta e a agulha dentro da aorta e, em seguida, abra o átrio esquerdo com tesoura. Neste momento, uma grande quantidade de sangue jorrará para fora do átrio esquerdo. Abra a válvula para a solução salina e conecte a injeção de soro fisiológico para perfundir solução salina a 37 °C, totalizando cerca de 150-200 mL.
3. Após a perfusão salina, trocar para a solução de paraformaldeído a 4% e perfundir com solução de paraformaldeído a 4%, totalizando cerca de 400 mL a 4 °C. Ao iniciar a perfusão do paraformaldeído, segure os dentes da frente do rato com uma pinça e puxe-os para frente, segurando a cauda com uma mão e puxando-a para trás, o que é vantajoso para estender totalmente a coluna vertebral e aumentar o forame intervertebral para facilitar a amostragem do DRG.
4. Durante a perfusão, o fígado, o mesentério e o omento maior do rato gradualmente ficam pálidos até que o fígado fique rígido. Em seguida, diminua a taxa de fluxo e ajuste-a para cerca de 2 gotas por segundo até que todo o paraformaldeído seja perfundido.

6. Coleção do gânglio da raiz dorsal

NOTA: Após a perfusão, cortar rapidamente a seção lombar da coluna vertebral do rato. Localizar o forame intervertebral L5 e L4 conectando os pontos mais altos da crista ilíaca de ambos os lados ao processo espinhoso lombar de L5 usando este método de posicionamento e remover o gânglio da raiz dorsal do forame intervertebral. O método de coleta específico é o seguinte:

1. A partir da entrada do canal vertebral (canal espinhal torácico), insira a tesoura no canal espinhal e corte a lâmina de ambos os lados até que todas as lâminas possam ser completamente removidas, expondo todo o canal espinhal.
   NOTA: Tenha cuidado para não danificar a medula espinhal e as raízes nervosas fora do canal espinhal ao cortar as lâminas.
2. Remova cuidadosamente a medula espinhal e o ligamento longitudinal posterior. Separe a dura-máter presa ao orifício interno do forame intervertebral.
3. Use pinças oftálmicas para prender e puxar o gânglio da raiz dorsal, que tem a forma de uma pérola e ligeiramente amarelado.
   NOTA: Devido à fragilidade e pouca tenacidade do tecido nervoso, é necessário agarrar a força e a direção de tração ao puxar o gânglio da raiz dorsal e não usar força bruta.
4. Ao arrancar o gânglio da raiz dorsal, certifique-se de limpar os tecidos moles circundantes, incluindo a dura-máter e a aracnoide, com antecedência para facilitar a tração suave do gânglio da raiz dorsal.
5. Coloque o gânglio da raiz dorsal em papel absorvente, corte o axônio com uma lâmina e limpe os vasos sanguíneos na superfície do gânglio da raiz dorsal.
6. Após o corte, pesar o gânglio da raiz dorsal e mergulhá-lo em uma solução de paraformaldeído a 4% com uma concentração de 4% e uma temperatura de 4 °C por tempo suficiente, geralmente cerca de 2-4 h, em seguida, transferir o gânglio da raiz dorsal para 10%, 20% e solução de sacarose PB a 30% (4 °C) preparada com antecedência para desidratação gradual.

7. Criosecção

1. Iniciar colocando o gânglio da raiz dorsal em uma solução de PBS 0,01 M. Agite-os por 10 min e, em seguida, lave a solução de sacarose. Aparar cuidadosamente as fibras axonais de ambos os segmentos dos gânglios da raiz dorsal. Limpe a cabeça de congelamento da máquina de criossecção e adicione o composto de temperatura de corte ideal (OCT) a ela (consulte a Tabela de Materiais).
2. Coloque a cabeça de congelamento na superfície de uma casca de metal contendo nitrogênio líquido, espere até que o tecido esteja congelado, remova-o e corte-o plano. Depois disso, coloque a cabeça de congelamento na base da fatiadora. A espessura dos cortes dos gânglios da raiz dorsal deve ser de 15 mm. Disponha as seções finas fatiadas em uma caixa de madeira em ordem e guarde-as em uma geladeira de -20 °C, longe da luz.

8. Coloração por hematoxilina e eosina

1. Coloque as seções 2 min em xileno e desidrate-as em uma série de álcoois, incluindo 100%, 95%, 80% e 70%, por 2 min cada. Em seguida, colocar os cortes 2 min em água destilada, 1 min em hematoxilina, realizar 5 min de enxágue com água de torneira e realizar diferenciação em solução de álcool salino a 1% por 30 s, seguido de 30 s em carbonato de lítio saturado.
2. Em seguida, coloque as fatias 2 min cada em água destilada e água da torneira, 5 min em solução de eosina (0,5%), 1 min de enxágue rápido em água destilada, duas rodadas de 2 min cada em álcool 95% e 100%, 30 s em xileno 100% com adição de bicarbonato de sódio, três rodadas de 3 min cada em xileno e, finalmente, selo com bálsamo neutro (ver Tabela de Materiais).

Resultados

A terapia com Tuina pode ajudar a diminuir os limiares de estimulação mecânica e térmica de ratos causados pela modelagem de CCD
Após 17 dias de terapia com Tuina, foi observada uma diferença significativa nos limiares de PWT entre os ratos CCD que receberam terapia com Tuina e o grupo CCD não tratado (P = 0,021, <0,05) (Figura 6 e Tabela 1).

Os ratos do grupo CCD que receberam terapia com Tuina apresentaram mel...

Discussão

Nosso grupo de pesquisa tem realizado estudos relevantes sobre os parâmetros de manipulação de Tuina em estágio inicial. Primeiro, é importante definir a intensidade da força para a manipulação de Tuina. Na clínica Tuina, os profissionais ajustam a intensidade da força de acordo com sua experiência e os sentimentos subjetivos dos pacientes, alcançando o melhor efeito Tuina através da comunicação. No entanto, isso não é viável em experimentos com animais. Em experimentos com animais, um "limiar de respos...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
"L" stainless steel rod (4 mm long and 0.4 mm in diameter)	hand-made	/	For CCD models making
ALMEMO admeasuring apparatus	ahlborn	2450-1	Mechanical Withdrawal Threshold test
Constant temperature slicer CM-1900	Leica	1491950C1US	For specimen production
Disinfectant (iodine) 100 mL/bottle	LIRCON/Shandong Lilkang	/	For disinfection
Disposable sterile syringe 5 mL	Shanghai Misha Wa Medical Industry	/	For injection
Electron microscope CX-31	Olympus, Japan	BJ002318	For specimen observation
Finger pressure recordings	Suzhou Changxian Optoelectronic Technology	CX1003w	For Tuina manipulation
Foam board (35 cm x 20 cm)	hand-made	/	It is our homemade apparatus for fixing rats
MERSILK W2512	Johnson & Johnson	/	For tissue suture
Neutral balsam	Sinopharm Chemical Reagent	10004160	For specimen production
paraformaldehyde	China National Chemical Reagent	/	For specimen production
Pentobarbital sodium	Sigma-Aldrich	P3761	For anesthesia of rat
Plantar Test Apparatus (Hargreaves Method) for Mice and Rats	IITC Life Science	/	Paw Withdrawal Latency
Precision electronic scale for experiment JY3002	Shanghai Precision Scientific Instrument	/	Weighing of rat
Rat hair clipper	Philips	HP6341/00	Shaving of rat fur
Restrainer for rats	Tongji University (self-made)	/	It is a homemade apparatus made by Tongji University, which can effectively immobilize the rats and fully expose their hind limbs.
Tissue-Tek O.C.T. Compound	SAKURA	4583	For specimen production
Uratan	China National Chemical Reagent	/	For anesthesia of rat
X-ray detector XR-600	Dongguan Kaso Electronic Technology	/	Examination of CCD models
xylene	Shanghai Sinopharm Group	100092	For specimen production