O cultivo em larga escala de nematoides para estudar seus comportamentos coletivos

Resumo

Aqui, um sistema é relatado para estudar os comportamentos coletivos de nematoides através de cultivá-los a granel usando meio ágar ração para cães. Este sistema permite aos pesquisadores propagar um grande número de vermes dauer e pode ser aplicado a Caenorhabditis elegans e outras espécies relacionadas.

Resumo

Os animais exibem comportamentos coletivos dinâmicos, como observado em bandos de aves, cardumes de peixes e multidões de humanos. Os comportamentos coletivos dos animais têm sido investigados nos campos da biologia e da física. Em laboratório, os pesquisadores usaram vários animais-modelo, como a mosca-da-fruta e o peixe-zebra, por aproximadamente um século, mas continua sendo um grande desafio estudar o comportamento coletivo complexo em grande escala orquestrado por esses animais-modelo geneticamente tratáveis. Este artigo apresenta um protocolo para criar um sistema experimental de comportamentos coletivos em Caenorhabditis elegans. Os vermes propagados sobem na tampa da placa de Petri e apresentam comportamento de enxame coletivo. O sistema também controla as interações e comportamentos dos vermes, alterando a umidade e a estimulação luminosa. Esse sistema nos permite examinar os mecanismos subjacentes aos comportamentos coletivos, alterando as condições ambientais e examinando os efeitos da locomoção em nível individual sobre os comportamentos coletivos usando mutantes. Assim, o sistema é útil para futuras pesquisas em física e biologia.

Introdução

Tanto os não-cientistas quanto os cientistas são fascinados pelos comportamentos coletivos dos animais, como em bandos de pássaros e cardumes de peixes. Comportamentos coletivos têm sido analisados em uma ampla gama de campos, incluindo física, biologia, matemática e robótica. Em particular, a física da matéria ativa é um campo de pesquisa crescente que se concentra em sistemas compostos por elementos autoproppelidos, isto é, sistemas dissipativos, como bandos de aves, cardumes de peixes, biofilmes de bactérias móveis, citoesqueletos compostos por moléculas ativas e grupos de coloides autoproppelidos. A teoria da física da matéria ativa sustenta que, por mais complexos que sejam os comportamentos dos indivíduos, os movimentos coletivos de um grande número de seres vivos são governados por um pequeno número de regras simples. Por exemplo, o modelo de Vicsek, um candidato para uma descrição unificada do movimento coletivo de partículas autopropelidas, prevê que a interação de alinhamento de curto alcance de objetos em movimento é necessária para formar uma fase ordenada de longo alcance com flutuação excêntrica em 2D, como em rebanhos de animais¹. Abordagens experimentais de cima para baixo relativas à física da matéria ativa estão se desenvolvendo rapidamente. Experimentos anteriores confirmaram a formação de uma fase ordenada de longo alcance em Escherichia coli². Outros trabalhos recentes empregaram células ^3,4, bactérias⁵, coloides móveis⁶ ou proteínas em movimento ^7,8. Modelos mínimos simples, como o modelo de Vicsek, descreveram com sucesso esses fenômenos reais. Em contraste com esses sistemas experimentais unicelulares, comportamentos coletivos de animais são geralmente observados na natureza, pois ninguém poderia esperar realizar experimentos controlados com 10.000 aves ou peixes reais.

Os biólogos compartilham o mesmo interesse que os físicos: como os indivíduos interagem uns com os outros e se comportam funcionalmente como um grupo. Um dos campos de pesquisa tradicionais para analisar o comportamento individual é a neurociência, na qual os mecanismos subjacentes ao comportamento têm sido examinados nos níveis neuronal e molecular. Muitas abordagens neurocientíficas ascendentes foram desenvolvidas até agora. Abordagens de cima para baixo em física e abordagens de baixo para cima em biologia podem ser facilitadas usando animais modelo como a mosca-da-fruta, o verme Caenorhabditis elegans e o camundongo⁹. No entanto, há poucos achados sobre o comportamento coletivo em larga escala desses animais modelo em^{laboratório10}; Ainda é difícil preparar animais modelo geneticamente tratáveis em larga escala em laboratório. Portanto, nas pesquisas atuais sobre comportamentos coletivos em biologia e física, tem sido difícil para os cientistas que geralmente fazem pesquisas em laboratório estudar os comportamentos coletivos dos animais.

Neste estudo, estabelecemos um método para o cultivo em larga escala de nematoides para estudar seus comportamentos coletivos. Esse sistema permite alterar as condições ambientais e examinar o efeito da locomoção em nível individual sobre comportamentos coletivos usando mutantes¹⁰. Em física da matéria ativa, os parâmetros do modelo matemático podem ser controlados tanto em experimentos quanto em simulações, o que permite a verificação desse modelo para identificação de descrições unificadas. A genética é utilizada para entender o mecanismo do circuito neural subjacente ao comportamento coletivo¹¹.

Protocolo

1. Preparação de vermes

NOTA: Preparar as cepas selvagem N2 Bristol¹² e ZX899 (lite-1(ce314); ljIs123[mec-4p::ChR2, unc-122p::RFP]⁾¹³ para a observação de comportamentos coletivos e experimentos optogenéticos, respectivamente. Mantenha a cepa ZX899 em condições escuras.

1. Depositar quatro vermes adultos bem alimentados em placa de 60 mm contendo 14 mL de meio de cultura de nematoide (NGM) com ágar e semeado com E. coli OP50¹².
2. Cultivar vermes F1 até a fome na placa NGM a 23 °C por 7 dias. O rendimento de vermes F1 é de aproximadamente 100 vermes/placa neste ponto. Os estágios dos vermes compreendem uma população mista de larvas de dauer e L1 famintas.

2. Preparo de pratos médios de ágar ração para cães (DFA)

1. Autoclave um frasco de vidro contendo 2 g de ração em pó para cães e 5 mL de meio ágar 1% e resfriá-lo à temperatura ambiente (Figura 1A).
   NOTA: Outros alimentos para cães de diferentes fabricantes podem ser usados neste experimento.

3. Inoculação de vermes em placas de meio DFA

1. Transfira pequenas quantidades (aproximadamente 0,5 g) de meio DFA para o centro de uma placa NGM semeada com E. coli OP50 (Figura 1B). Para experimentos optogenéticos, despeje 40 μL de 50 μM all-trans-retinal, o cofator da rodopsina 2 do canal, sobre o DFA antes da inoculação de vermes.
2. Coletar os vermes famintos de quatro placas NGM usando água autoclavada.
3. Coloque um pequeno fragmento de ração para cães (aproximadamente 0,5 g) sobre o meio DFA, a aproximadamente 2 mm de distância da tampa do prato.
4. Ilumine a placa NGM com luz ultravioleta por 15 min dentro de uma bancada limpa para evitar contaminação.
5. Inocular os vermes coletados (aproximadamente 400 vermes) no meio DFA em placas NGM. Não sele a placa com parafilme para evitar aumentar a umidade dentro da placa de Petri e gerar gotículas de água que prendem vermes em uma tampa.
6. Propagar os vermes a 23 °C e deixá-los subir até a tampa da placa por aproximadamente 10-14 dias.
   NOTA: Como o número de vermes nas tampas quase não aumentou após 10-14 dias, presumiu-se que os vermes provavelmente ficaram sem comida.

4. Observação do comportamento coletivo

1. No dia do experimento, colocar uma nova placa de NGM que não incluísse E. coli e meio ágar ração para cães sobre uma placa de alumínio no palco de um microscópio macrozoom (Figura 2A). Mantenha o fundo desta nova placa NGM a 23 °C usando uma unidade controladora de temperatura Peltier por pelo menos 5 min (Figura 2B). Em seguida, substitua a tampa dessa nova placa NGM pela tampa da placa em que os vermes subiram. Utilizar a objetiva (x2, NA = 0,5) como objetiva de baixa magnificação (Figura 2A).
2. Aumentar a temperatura do fundo da placa de Petri de 23 °C para 26 °C para alterar a umidade no interior dessa placa (Figura 2).
3. Adquira imagens da superfície interna da tampa da placa com a câmera a 20 quadros s⁻¹ (Vídeo Suplementar S1).
4. Salve as imagens adquiridas no formato Arquivo de Imagem Marcada.

5. Experimento optogenético

1. Use uma lâmpada de mercúrio de 100 W para fornecer luz azul, filtrada com um conjunto de filtros. Controle o tempo de iluminação com precisão usando um sistema de obturador eletromagnético (Figura 2B).
2. Mantenha o ZX899 no DFA nessas condições por 5 minutos antes da iluminação da luz azul.
3. Iluminar vermes ZX899 presos à tampa de uma placa de Petri no estágio do microscópio mantido a 23 °C.
4. Adquira imagens da superfície interna da tampa da placa com uma câmera a 20 quadros s⁻¹ (Vídeo Suplementar S2).

Resultados

Aqui, vermes dauer selvagens foram usados para observações de comportamento coletivo. As minhocas foram cultivadas a 23 °C por aproximadamente 10-14 dias e subiram até a superfície interna da tampa de uma placa média de DFA. No dia do experimento, apenas a pálpebra foi transferida para uma nova placa de NGM sem E. coli e meio DFA. O fundo dessa placa de Petri foi inicialmente mantido a 23 °C usando o sistema Peltier e, em seguida, sua temperatura foi aumentada para 26 °C. Um filme foi feito ao microsc?...

Discussão

Neste estudo, mostramos um protocolo para a preparação de um sistema para o comportamento coletivo em larga escala de C. elegans em laboratório. O método baseado em DFA foi originalmente estabelecido com Caenorhabditis japonica¹⁴ e Neoaplectana carpocapsae Weiser¹⁵, ambos animais não modelo. No entanto, esse método não foi aplicado para investigar comportamentos coletivos. O C. elegans é um animal modelo geneticamente tratável11,...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Escherichia coli and C. elegans strains
E. coli OP50	Caenorhabditis Genetics Center	OP50	Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B.
lite-1(ce314); ljIs123[mec-4p::ChR2, unc-122p::RFP]	author	ZX899	lite-1(ce314) mutant carrying the genes expressing ChR2 and RFP under the control of the mec-4 and unc-122 promoter, respectively
N2 Bristrol	Caenorhabditis Genetics Center		Wild-type C. elegans strain
For worm cultivation
Agar purified, powder	Nakarai tesque	01162-15	For preparation of NGM plates
All-trans retinal	Sigma-Aldrich	R2500	For optogenetics
Bacto pepton	Becton Dickinson	211677	For preparation of NGM plates
Calcium chloride	Wako	036-00485	For preparation of NGM plates
Cholesterol	Wako	034-03002	For preparation of NGM plates
di-Photassium hydrogenphosphate	Nakarai tesque	28727-95	For preparation of NGM plates
Dog food	Nihon Pet Food	VITA-ONE	For preparation of dog food agar medium
LB broth, Lennox	Nakarai tesque	20066-95	For culture of E. coli OP50
Magnesium sulfate anhydrous	TGI	M1890	For preparation of NGM plates
Petri dishes (60 mm)	Nunc	150270	For preparation of NGM plates
Potassium Dihydrogenphosphate	Nakarai tesque	28720-65	For preparation of NGM plates
Sodium Chloride	Nakarai tesque	31320-05	For preparation of NGM plates
Observation
Computer	CT solution	CS6229	Windows10 Pro with Intel Xeon Gold 6238R CPU and 768 GB of RAM
CMOS Camera	Hamamatsu photonics	ORCA-Lightning C14120-20P	For data acquisition
CMOS Camera	Olympus	DP74	For data acquisition
Microscope with SZX-MGFP set	Olympus	MVX10	For data acquisition
x2 Objective lens	Olympus	MV PLAPO 2XC	Working distance 20 mm and numerical aperture 0.5
Shutter control
Shutter	OptoSigma	BSH2-RIX	For controlling temporal pattern of  light illumination
Shutter controller	OptoSigma	SSH-C2B-A	For controlling temporal pattern of  light illumination
Temperature control
Peltier temperature controller unit	VICS	WLVPU-30	For controlling humidity inside a Petri plate
UNI-THEMO CONTROLLER	Ampere	UTC-100	For controlling humidity inside a Petri plate
Data acquisition software
HCImage	Hamamatsu photonics		For data acquisition