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Resumo

A terapia óssea via ossificação endocondral através da implantação de tecido cartilaginoso artificial produzido a partir de células-tronco mesenquimais tem o potencial de contornar os inconvenientes das terapias convencionais. Os hidrogéis de ácido hialurônico são eficazes na ampliação de enxertos de cartilagem uniformemente diferenciados, bem como na criação de osso integrado com vascularização entre enxertos fundidos in vivo.

Resumo

A terapia convencional de regeneração óssea utilizando células-tronco mesenquimais (CTMs) é de difícil aplicação em defeitos ósseos maiores que o tamanho crítico por não possuir um mecanismo para induzir angiogênese. A implantação de tecido cartilaginoso artificial fabricado a partir de CTMs induz angiogênese e formação óssea in vivo via ossificação endocondral (ECO). Portanto, esta abordagem mediada pela ECO pode ser uma terapia promissora de regeneração óssea no futuro. Um aspecto importante da aplicação clínica desta abordagem mediada pela ECO é o estabelecimento de um protocolo para preparar cartilagem suficiente para ser implantada para reparar o defeito ósseo. Especialmente não é prático projetar uma única massa de cartilagem enxertada de um tamanho que esteja de acordo com a forma do defeito ósseo real. Portanto, a cartilagem a ser transplantada deve ter a propriedade de formar osso integralmente quando múltiplos pedaços são implantados. Os hidrogéis podem ser uma ferramenta atraente para a ampliação de enxertos projetados para ossificação endocondral para atender às necessidades clínicas. Embora muitos hidrogéis naturalmente derivados suportem a formação de cartilagem MSC in vitro e ECO in vivo, o material de arcabouço ideal para atender às necessidades de aplicações clínicas ainda não foi determinado. O ácido hialurônico (AH) é um componente crucial da matriz extracelular cartilaginosa e é um polissacarídeo biodegradável e biocompatível. Aqui, mostramos que os hidrogéis de AH têm excelentes propriedades para apoiar a diferenciação in vitro do tecido cartilaginoso à base de CTM e promover a formação óssea endocondral in vivo.

Introdução

O osso autólogo ainda é o padrão-ouro para reparação de defeitos ósseos decorrentes de trauma, defeitos congênitos e ressecção cirúrgica. No entanto, o enxerto ósseo autógeno tem limitações significativas, incluindo dor do doador, risco de infecção e volume ósseo limitado que pode ser isolado dos pacientes 1,2,3,4. Inúmeros biomateriais têm sido desenvolvidos como substitutos ósseos, combinando polímeros naturais ou sintéticos com materiais mineralizados, como fosfato de cálcio ou hidroxiapatita 5,6. A formação óssea nesses materiais de engenharia é geralmente obtida usando o material mineralizado como material de priming para permitir que as células-tronco se diferenciem diretamente em osteoblastos através do processo de ossificação intramembrana (IMO)7. Esse processo carece do passo angiogênico, resultando em vascularização insuficiente in vivo do enxerto após o implante8,9,10 e, portanto, abordagens utilizando esse processo podem não ser ideais para o tratamento de grandes defeitos ósseos11.

Estratégias aplicadas para recapitular o processo de ossificação endocondral (ECO), um mecanismo inato na esquelética durante o desenvolvimento, têm demonstrado superar problemas significativos associados às abordagens tradicionais baseadas na IMO. Na ECO, os condrócitos do molde cartilaginoso liberam fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), que promove infiltração vascular e remodelamento do molde cartilaginoso emosso12. A abordagem ECO-mediada para osteogênese via remodelamento cartilaginoso e angiogênese, que também é ativada durante o reparo de fraturas, usa tecido cartilaginoso criado artificialmente derivado de CTMs como material de priming. Os condrócitos podem tolerar hipóxia em defeitos ósseos, induzir angiogênese e converter um enxerto de cartilagem livre de vasculares em tecido angiogênico. Numerosos estudos têm relatado que enxertos de cartilagem à base de CTM geram osso in vivo com a implementação de tal programa ECO13,14,15,16,17,18,19,20,21.

Um requisito essencial para a aplicação clínica desta abordagem mediada pela ECO é como preparar a quantidade desejada de enxerto de cartilagem em um ambiente clínico. Preparar cartilagem clínica de um tamanho que se adapte ao defeito ósseo real não é prático. Portanto, a cartilagem do enxerto deve formar osso integralmente quando múltiplos fragmentos são implantados22. Os hidrogéis podem ser uma ferramenta atraente para a ampliação de enxertos manipulados por tecidos para ossificação endocondral. Muitos hidrogéis de origem natural suportam a formação de cartilagem MSC in vitro e ECO in vivo 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32; no entanto, o material de suporte ideal para atender aos requisitos de aplicação clínica permaneceu indeterminado. O ácido hialurônico (AH) é um polissacarídeo biodegradável e biocompatível presente na matriz extracelular da cartilagem33. O AH interage com as CTMs via receptores de superfície, como o CD44, para auxiliar a diferenciação condrogênica 25,26,28,30,31,32,34. Além disso, os scaffolds de AH promovem diferenciação osteogênica mediada pela IMO de células-tronco da polpa dentária humana35, e scaffolds combinados com colágeno promovem osteogênese mediada por ECO36,37.

Aqui, apresentamos um método para o preparo de hidrogéis de AH utilizando CTMs humanas adultas derivadas da medula óssea e seu uso para condrogênese hipertrófica in vitro e posterior ossificação endocondral in vivo38. Comparamos as características do AH com as do colágeno, um material amplamente aplicado na engenharia do tecido ósseo com CTMs e um material útil para a ampliação de enxertos artificiais para ossificação endocondral17. Em um modelo de camundongo imunocomprometido, construções de AH e colágeno semeadas com CTMs humanas foram avaliadas quanto ao potencial ECO in vivo por implante subcutâneo. Os resultados mostram que os hidrogéis de AH são excelentes como arcabouço para CTMs criarem enxertos de cartilagem artificial que permitem a formação óssea através de ECO.

O protocolo é dividido em duas etapas. Primeiro, construções de CTMs humanas semeadas com hidrogel de hialuronano são preparadas e diferenciadas em cartilagem hipertrófica in vitro. Em seguida, os construtos diferenciados são implantados subcutaneamente em um modelo nude para induzir a ossificação endocondral in vivo (Figura 1).

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Protocolo

Este protocolo usa camundongos machos nus de 4 semanas de idade. Aloja quatro ratos em uma gaiola sob um ciclo claro/escuro de 12 h a 22−24 °C e 50%−70% de umidade relativa. Todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes aprovadas pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Médica e Odontológica de Tóquio (ID de aprovação: A2019-204C, A2020-116A e A2021-121A).

1. Preparação de tampões e reagentes

  1. Preparar o meio de crescimento de células-tronco mesenquimais (meio de crescimento MSC) adicionando o kit de suplemento de meio de crescimento MSC ao meio basal MSC e armazená-lo a 4 °C.
  2. Preparar o meio Dulbecco's Modified Eagle Medium and Ham's F12 (DMEM/F-12) adicionando 10% de soro fetal bovino (FBS), 50 μg/mL de gentamicina, 200 μM L-alanil-L-glutamina e 1 ng/mL de fator de crescimento fibroblástico básico ao meio e armazená-lo a 4 °C.
  3. Preparar o meio condrogênico adicionando 1% de suplemento de ITS-G, 0,12% de albumina de soro bovino, 50 μg/mL de gentamicina, 0,35 mM L-prolina, 100 nM de dexametasona e 10 ng/mL de TGF-β3 ao DMEM imediatamente antes do uso.
  4. Preparar o meio hipertrófico adicionando 10 mM de β-glicerofosfato, 0,12% de albumina de soro bovino, 10 nM de dexametasona, 200 μM de ascorbato-2-fosfato, 50 nM de L-tiroxina, 50 μg/mL de gentamicina e 50 pg/mL de IL-1β ao DMEM imediatamente antes do uso.
  5. Revestir uma placa de cultura de 24 poços com 200 μL de parafina derretida pré-aquecida a 60 °C. Deixe repousar à temperatura ambiente até que a parafina esteja ajustada.

2. Expansão das CTMs humanas

NOTA: Antes de iniciar os experimentos, CTMs com alto potencial para condrogênese de CTM devem ser selecionadas em microcultura de massa, conforme descrito em17.

  1. De acordo com as instruções do fabricante, cultivar CTMs primárias derivadas da medula óssea humana (passagem 2) com meio de crescimento CTM em uma placa de 10 cm a uma densidade de 5 x 103 células/cm 2 a 37 °C em incubadora de ar umidificada a 5% CO2 e 95%.
  2. Troque o meio a cada 2-3 dias. Quando as células atingirem 80%-90% de confluência, aspirar o meio da placa de cultura celular usando uma bomba de vácuo, lavar com 5 mL de PBS e, em seguida, aspirar a solução com uma bomba de vácuo.
  3. Adicionar 1 mL de solução de tripsina a 0,05%/EDTA a 0,02% ao prato. Incubar o prato durante 5-10 min a 37 °C.
  4. Adicionar 1 mL de meio de cultura MSC para interromper a reação enzimática. Transfira a suspensão celular para um tubo de 50 mL.
  5. Combine a suspensão celular de outras placas no tubo de 50 mL e mantenha-a no gelo.
  6. Use o contador de células para contar as células misturando 10 μL da suspensão celular com 10 μL de coloração azul de tripano a 0,4%.
  7. Centrifugar a suspensão celular restante a 220 x g durante 3 minutos à temperatura ambiente. Retirar o sobrenadante e adicionar solução de criopreservação na concentração de 1,0 x 106 células por mL.
  8. Distribuir 1 ml da suspensão celular em cada criotubo e conservar a -80 °C durante 12 h antes de transferir para azoto líquido. As existências congeladas resultantes (passagem 3) são utilizadas para este protocolo.
  9. Para os experimentos, semear as CTMs estocadas em uma placa de 10 cm a uma densidade de 5 x 103 células/cm2. Cultivo de células até 80%-90% confluentes (passagem 4) em meio DMEM/F-12.

3. Preparação de hidrogéis encapsulados em MSC

  1. Tripsinizar as células e preparar a suspensão celular conforme descrito nos passos 2.3 - 2.6.
  2. Para fazer 10 construções (2,5 x 105 células por construto), aliquota a suspensão celular contendo 2,5 x 106 células em um microtubo de 1,5 mL.
  3. Centrifugar a suspensão a 220 x g por 3 min, remover o sobrenadante com uma bomba de vácuo e mantê-lo no gelo.
  4. Levar o ácido hialurônico modificado por tiol (AH), reticulante reativo a tiol, diacrilato de polietilenoglicol e garrafas de água desgaseificada à temperatura ambiente.
  5. Em condições estéreis, adicione 1,0 ml de água desgaseificada ao frasco contendo AH (ver instruções do fabricante) utilizando uma seringa com uma agulha.
  6. Vórtice ocasionalmente aquecendo a 37 °C até que a solução fique clara, em seguida, coloque no gelo. Leva menos de 30 minutos para que os sólidos se dissolvam completamente.
  7. Em condições estéreis, adicionar 0,5 mL de água desgaseificada ao frasco reticulante usando uma seringa com uma agulha. Dissolva invertendo várias vezes e coloque no gelo.
  8. Adicionar 120 μL da solução de AH dissolvido à pastilha de células alíquotas (2,5 x 106 células). Ressuspenda o pellet celular pipetando para frente e para trás.
  9. Adicionar 30 μL da solução de reticulante dissolvido ao tubo que contém o AH e as células (passo 3.8) e combinar batendo no tubo e, em seguida, girar brevemente para baixo. Combinar a solução de AH e a solução de reticulador numa proporção de 4:1.
  10. Lançar 15 μL da solução combinada contendo CTMs (2,5 x 105 células) sobre a placa de 24 poços revestida com parafina e deixá-la solidificar a 37 °C por 30 min (Figura 2). Devido à alta viscosidade, prepare pelo menos 10% a mais da mistura célula/hidrogel do que o necessário.
    NOTA: As características do hidrogel foram descritas anteriormente39.

4. Condições de diferenciação in vitro

  1. Adicionar 0,5 mL de meio de diferenciação condrogênica a uma construção de hidrogéis de AH com sementes de CTM. Troque o meio a cada 2-3 dias.
  2. Após 3 semanas, mudar para meio de diferenciação hipertrófica (0,5 mL por poço) e cultivar os construtos por mais 2 semanas.

5. Implantação in vivo de CTMs

  1. Após um total de 5 semanas de cultura in vitro, implantar-se os construtos por via subcutânea no dorso de camundongos nus, conforme descrito anteriormente38,40.
  2. Pesar camundongos e administrar um anestésico combinado preparado com 0,75 mg/kg de peso corporal (p.c.) medetomidina, 4,0 mg/kg de p.c. midazolam e 5,0 mg/kg de p.c. butorfanol por injeção intraperitoneal, conforme descrito38.
  3. Confirmar anestesia adequada por imobilidade aos estímulos cirúrgicos e monitorar a profundidade respiratória por movimentos torácicos lentos e regulares e suprimento adequado de oxigênio pela cor da mucosa rósea periodicamente durante a operação. Use pomada veterinária nos olhos para evitar o ressecamento durante a anestesia.
  4. Colocar o camundongo em um pano cirúrgico estéril em decúbito ventral, esterilizar o local da incisão com 50 ppm de água ácido hipoclorosa (pH 5,0; HAW), e coloque um pano cirúrgico perfurado sobre o rato.
    OBS: Esterilizar todos os materiais cirúrgicos em autoclave, gás óxido de etileno ou HAW. Os cirurgiões devem lavar os dedos e usar aventais e luvas cirúrgicas.
  5. Faça duas incisões de pele de 5 mm de comprimento com 2 cm de distância nas áreas do ombro e quadril ao longo da linha central da coluna usando uma tesoura.
  6. Insira uma espátula subcutânea através da incisão para criar uma bolsa subcutânea.
  7. Insira duas a três construções (~15 μL cada, passo 5.1) em cada bolso com pinças. Construções de AH implantadas na mesma loja são propensas à fusão com muita frequência. Para evitar a fusão, insira uma construção de AH em cada bolsa.
  8. Fechar as incisões com pontos de seda trançados 4-0. Injetar no camundongo um antagonista dos anestésicos preparados com atipamezol 0,75 mg/kg de p.c., conforme descrito38.
  9. Enquanto os camundongos se recuperam da anestesia, coloque os camundongos em gaiolas de recuperação estéreis contendo roupas de cama de chão estéreis sem garrafas de comida e água e monitore continuamente a temperatura corporal, o pulso e a respiração.
  10. Não deixe os ratos sozinhos até que ele tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. Após a recuperação total, retorne os animais ao criadouro com os demais animais.
  11. Monitorar os animais a cada dois dias durante o período de cicatrização para quaisquer possíveis complicações. Eutanasiar os camundongos por inalação de dióxido de carbono com pouco sofrimento nas 4 e 8 semanas pós-implantação.
  12. Incisar a pele nos locais enxertados e remover as construções implantadas com pinças. Fixar os construtos em paraformaldeído a 4% por 16 h e submetê-los à análise.

6. Análise estatística

  1. Relate dados quantitativos como média ± desvio padrão (DP). Realizar análise estatística utilizando software comercial.
  2. Use o teste t de Student ou ANOVA one-way seguido do teste de comparações múltiplas de Tukey para determinar diferenças significativas entre os grupos. p<0,05 e p<0,01 indicam diferenças significativas entre os dois grupos.

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Resultados

Hidrogéis de AH encapsulados em CTM foram cultivados em meio condrogênico suplementado com TGFβ3, um indutor da condrogênese41 (passo 4.1). Comparamos as propriedades do AH com as do colágeno, que tem se mostrado eficaz na criação de enxertos de cartilagem artificial à base de CTM para ossificação endocondral, como descrito anteriormente38. As CTMs indiferenciadas não foram incluídas como controles negativos neste estudo, pois foi demonstrado que as CTMs indifer...

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Discussão

O uso de materiais apropriados que promovam a transição da cartilagem hipertrófica para o osso é uma abordagem promissora para ampliar enxertos de cartilagem hipertrófica projetados baseados em CTM e tratar defeitos ósseos de tamanho clinicamente significativo. Aqui, mostramos que o AH é um excelente material de arcabouço para auxiliar na diferenciação do tecido cartilaginoso hipertrófico baseado em CTM in vitro e promover a formação óssea endocondral in vivo38. Al?...

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Divulgações

Os autores declararam que não existem interesses concorrentes.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por um Grant-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) da Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (grant nos. JP19K10259 e 22K10032 ao MAI).

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25w/v% Trypsin-1mmol/L EDTA.4Na SolutionFUJIFILM Wako Pure Chemical 209-16941
AntisedanNippon Zenyaku Kogyo
ascorbate-2-phosphateNacalai Tesque13571-14
BambankerGC LymphotecCS-02-001
basic fibroblastic growth factorReprocellRCHEOT002 
bovine serum albuminFUJIFILM Wako Pure Chemical 012-238817.5 w/v%
Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4%InvitrogenC10283
dexamethasoneMerckD8893
DomitorNippon Zenyaku Kogyo
DormicumAstellas Pharma
Dulbecco's Modified Eagle MediumMerckD6429high glucose
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 HamMerckD6421
Fetal bovine serumHycloneSH30396.03
Gentamicin sulfateFUJIFILM Wako Pure Chemical 1676045 10 mg/mL
Haccpper GeneratorTechnoMaxCH-400-5QB50 ppm hypochlorous acid water
Human Mesenchymal Stem CellsLonzaPT-2501
HyStem Cell Culture Scaffold KitMerckHYS020
IL-1ßPeproTechAF-200-01B
ITS-G supplementFUJIFILM Wako Pure Chemical 090-06741×100
L-Alanyl-L-GlutamineFUJIFILM Wako Pure Chemical 016-21841200mmol/L (×100)
L-prolineNacalai Tesque29001-42
L-ThyroxineMerckT1775
MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium
BulletKit		LonzaPT-3001
paraffinFUJIFILM Wako Pure Chemical 165-13375
PBS / pH7.4 100mlMedicago09-2051-100
TGF-β3 ProteintechHZ-1090
VetorphaleMeiji Seika Kaisha
Visiocare OintmentSAVAVET/SAVA Healthcare
β-glycerophosphateFUJIFILM Wako Pure Chemical 048-34332

Referências

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