Bioimpressão 3D de hidrogéis fototáveis para estudo da ativação de fibroblastos

Resumo

Este artigo descreve como bioimprimir hidrogéis fototáveis em 3D para estudar o enrijecimento da matriz extracelular e a ativação de fibroblastos.

Resumo

Os hidrogéis fotosajustáveis podem transformar-se espacial e temporalmente em resposta à exposição à luz. A incorporação desses tipos de biomateriais em plataformas de cultura celular e o desencadeamento dinâmico de mudanças, como o aumento da rigidez microambiental, permite aos pesquisadores modelar as mudanças na matriz extracelular (MEC) que ocorrem durante a progressão da doença fibrótica. Neste trabalho, é apresentado um método para bioimpressão 3D de um biomaterial hidrogel fototável capaz de duas reações sequenciais de polimerização dentro de um banho suporte de gelatina. A técnica de bioimpressão Freeform Reversible Embedding of Suspended Hydrogels (FRESH) foi adaptada ajustando-se o pH do banho de suporte para facilitar uma reação de adição de Michael. Primeiro, a biotinta contendo poli(etilenoglicol)-alfa metacrilato (PEGαMA) foi reagida fora da estequiometria com um reticulante degradável por células para formar hidrogéis moles. Esses hidrogéis moles foram posteriormente expostos ao fotoinibidor e à luz para induzir a homopolimerização dos grupos não reagidos e enrijecer o hidrogel. Este protocolo abrange síntese de hidrogel, bioimpressão 3D, fotoenrijecimento e caracterizações de desfechos para avaliar a ativação de fibroblastos em estruturas 3D. O método aqui apresentado permite aos pesquisadores bioimprimir em 3D uma variedade de materiais que sofrem reações de polimerização catalisadas por pH e pode ser implementado para projetar vários modelos de homeostase, doença e reparo tecidual.

Introdução

A bioimpressão 3D é uma tecnologia transformadora que permite aos pesquisadores depositar com precisão células e biomateriais em volumes 3D e recriar a complexa estrutura hierárquica dos tecidos biológicos. Na última década, avanços na bioimpressão 3D criaram tecidos cardíacos humanos batidos¹, modelos funcionais de tecidos renais², modelos de trocas gasosas dentro do pulmão³ e modelos tumorais para pesquisa de câncer⁴. A invenção de técnicas de bioimpressão 3D incorporadas, como a bioimpressão Freeform Reversible Embedding of Suspended Hydrogel (FRESH), tornou possível reproduzir estruturas complexas de tecidos moles, como vasos sanguíneos pulmonares⁵ e até coração humano⁶ em 3D. A bioimpressão 3D FRESH facilita a impressão camada por camada de biotintas macias e de baixa viscosidade através da extrusão em um banho de suporte de desbaste de cisalhamento. O banho de suporte consiste em um material como micropartículas de gelatina bem embaladas que atua como um plástico Bingham e mantém a forma e a estrutura pretendidas da biotinta após a impressão. Uma vez que a construção impressa tenha se solidificado, o banho de suporte pode então ser dissolvido aumentando a temperatura para 37 °C⁷.

Um artigo de revisão recente resumiu os materiais que foram bioimpressos em 3D em várias publicações usando a técnica FRESH. Esses materiais de origem natural variam desde colágeno tipo I até ácido hialurônico metacrilado e representam vários mecanismos diferentes de gelificação⁷. A maioria das pesquisas realizadas com essa técnica de bioimpressão 3D emprega biomateriais estáticos que não se alteram em resposta a estímulos externos. Biomateriais dinâmicos de hidrogel fotosajustáveis têm sido utilizados por nosso laboratório e outros 8,9,10,11,12 para modelar uma variedade de doenças fibróticas. Ao contrário dos biomateriais estáticos, as biotintas fotosajustáveis permitem que um modelo amolecido com menor valor de módulo de elasticidade seja criado e posteriormente enrijecido para explorar respostas celulares a aumentos no enrijecimento microambiental.

As doenças fibróticas caracterizam-se pelo aumento da produção de matriz extracelular, que pode causar cicatrizes e enrijecimento¹³. O enrijecimento tecidual pode iniciar novas lesões e destruição do tecido impactado, causando danos permanentes aos órgãos e até a morte; As desordens fibróticas são responsáveis por um terço da mortalidade mundial. Os fibroblastos produzem excesso e matriz extracelular aberrante nesse estado^{patológico 14,15}. O aumento da proliferação fibroblástica e a deposição de matriz extracelular enrijecem ainda mais o tecido e ativam uma alça de feedback positivo profibrótico^16,17,18,19. O estudo da ativação de fibroblastos é vital para a compreensão das doenças fibróticas. Aqui apresentamos a hipertensão arterial pulmonar (HAP) humana como um exemplo de um distúrbio fibrótico no qual é importante imitar a geometria 3D do vaso sanguíneo usando bioimpressão 3D e introduzir as capacidades de enrijecimento dinâmico dos hidrogéis fotosajustáveis. A HAP é uma condição na qual a pressão nas artérias pulmonares principais ultrapassa os níveis normais e aplica tensão no coração, aumentando a ativação do fibroblasto adventício da artéria pulmonar humana (FAAPH) e enrijece os tecidos dos vasos sanguíneos^16,17,18,19. Uma formulação de biotinta de poli(etilenoglicol)-alfa metacrilato (PEGαMA) fototunable permite o enrijecimento temporal em construtos e ajuda a modelar tanto o tecido saudável quanto a progressão da doença 5,8,9,10. A exploração desta característica única permite a quantificação da ativação e proliferação de HPAAF em resposta ao enrijecimento microambiental em 3D e pode fornecer informações valiosas sobre os mecanismos celulares envolvidos nesta doença. O protocolo aqui descrito permitirá aos pesquisadores criar modelos 3D que recapitulam mudanças no microambiente extracelular durante a progressão da doença ou reparo tecidual e estudar a ativação de fibroblastos.

Protocolo

1. Síntese e caracterização de PEGαMA

NOTA: A síntese de poli(etilenoglicol)-alfametacrilato (PEGαMA) foi adaptada de Hewawasam e col. e realizada em condições livres de umidade⁹.

1. Pese os reagentes.
   NOTA: Por exemplo, pesar 5 g de PEG-hidroxila de 8 braços de 10 kg/mol (PEG-OH) e 0,38 g de hidreto de sódio (NaH) (ver Tabela de Materiais).
2. Adicionar uma barra de agitação a 250 ml de balão de Schlenk e purgar com argónio.
3. Dissolver o PEG-OH no menor volume de tetraidrofurano anidro (THF) necessário para a dissolução no frasco de Schlenk.
   NOTA: Aproximadamente 80 mL de THF dissolverão 5 g de PEG-OH. Adicione a quantidade mínima de THF necessária para dissolver o PEG-OH.
4. Adicionar 3 vezes o excesso molar de NaH à mistura de reação e agitar à temperatura ambiente (TR) por 30 min.
5. Adicionar 6 vezes o excesso molar de Ethyl 2-(bromomethyl)acrilate (EBrMA, ver Tabela de Materiais) gota a gota ao frasco de Schlenk e cobrir o recipiente de reação com folha de alumínio para protegê-lo da luz. Agite a reação à temperatura ambiente durante aproximadamente 48 horas.
   NOTA: Para 5 g de PEG-OH e 0,38 g de NaH, utilizar 3,68 mL de EBrMA para esta reação.
6. Adicione algumas gotas de 1 N de ácido acético para apagar a reação. Filtre a vácuo a solução através de um auxiliar de filtração.
   NOTA: A adição de ácido acético produzirá bolhas de gás. Pare de adicionar gotas de ácido acético quando as bolhas pararem de se formar, pois isso indica que a mistura foi extinta com sucesso.
7. Concentrar o filtrado num evaporador rotativo e precipitar em éter dietílico a 4 °C. Deixe o precipitado protegido da luz a 4 °C durante 12-18 h.
8. Adicione um papel de filtro Whatman a um funil Buchner. Despeje lentamente a mistura de reação sobre o papel de filtro e use sucção a vácuo para separar o precipitado do éter dietílico. Recolher o precipitado num balão de filtração seco e limpo.
9. Secar o produto a vácuo por pelo menos 5 h ou durante a noite à temperatura ambiente e dissolver no volume mínimo de água deionizada necessário. Transfira o produto dissolvido para a tubulação de diálise (ver Tabela de Materiais) e dialise contra 3,5 L de água deionizada por pelo menos quatro dias. Troque a água da diálise a cada 12 h.
   NOTA: O produto aparecerá como pó sólido branco puro completamente seco após a secagem a vácuo.
10. Congelar o produto e liofilizar por aproximadamente 72 h ou até secar completamente.
11. Dissolver o produto em clorofórmio D (CDCl₃). Execute a amostra usando RMN ^{de 1}H com um protocolo que executa 248 varreduras com tempo de relaxamento de 2,5 s.
12. Verifique a funcionalização e pureza do produto calibrando o pico de solvente CDCl₃ para 7,26 PPM. Integre o pico para prótons de backbone PEG (d3.71) e calibre a integração para 114.
13. Integrar os picos restantes: PEGαMA 1 H RMN (300 MHz, CDCl 3): d (ppm) ^1,36(t, 3H, CH 3-),_3,71 (s, 114H, PEG CH 2-CH 2), 4,29 (t, s, 4H, -CH 2-C(O)-O-O, -O-CH _2-C(=CH 2)-), 5,93 (q, 1H, -C=CH₂), 6,34 (q, 1H, -C=CH ₂) e comparar a integração para os picos do grupo final de alcenos αMA com o valor esperado (1H) com base na calibração do backbone do PEG (Gráfico 1).
    OBS: Faça a média dos dois picos rotulados como "a" (Figura 1) e multiplique por 100 para obter a porcentagem média de funcionalização do PEGαMA.

Figura 1: A RMN de prótons confirmou o sucesso da funcionalização do PEGαMA. A análise de RMN foi realizada em clorofórmio-D (CDCl₃) e mostrou a funcionalização de 96,5%. PEGαMA 1 H RMN (300 MHz, CDCl3): d (ppm) ^1,36(t, 3H, CH 3-),_3,71 (s, 114H, PEG CH 2-CH 2), 4,29 (t, s, 4H, -CH 2-C(O)-O-O, -O-CH_2-C(=CH 2)-), 5,93 (q, 1H, -C=CH 2), 6,34 (q, 1H, -C=CH ₂). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Projeto do modelo e configuração da bioimpressora 3D

NOTA: Uma impressora 3D comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais) foi modificada substituindo a extrusora termoplástica por uma extrusora de bomba de seringa personalizada e adaptada de Hinton et al.20. Projetos de código aberto estão disponíveis on-line: https://3d.nih.gov/users/awfeinberg.

1. Abra o software Fusion 360 (consulte a Tabela de Materiais) e faça um projeto de cilindro oco assistido por computador 3D.
   Observação : um arquivo para download que pode ser usado para esta etapa e imita a geometria do vaso sanguíneo pode ser encontrado no arquivo suplementar 1.
2. Salve o arquivo e abra-o no software Slic3r (consulte Tabela de Materiais). Verifique se todos os parâmetros estão conforme desejado e, em seguida, pressione o botão de código G de exportação. Salve o código G no computador.
3. Abra o software Pronterface (consulte Tabela de Materiais) e carregue o arquivo de código G.
   NOTA: O software Pronterface faz interface com a bioimpressora e fornece controle de entrada de hardware suficiente. Um arquivo de código G utilizável pode ser encontrado no Arquivo Suplementar 2.
4. Transfira a bioimpressora e todas as peças associadas para um gabinete de biossegurança (BSC) usando técnicas assépticas.
5. Monte uma ponta de agulha romba de 30 G e 0,5" de comprimento (consulte Tabela de Materiais) na seringa de vidro de impressão e reserve.
6. Conecte o cabo de alimentação da bioimpressora a uma tomada. Pressione o botão liga/desliga vermelho na parte frontal da bioimpressora para ligá-la. Conecte o cabo USB (barramento serial universal) entre o computador e a bioimpressora e certifique-se de que todas as conexões de fio estejam estabelecidas e conectadas.

3. Preparo do banho de apoio e reagentes

OBS: Executar todas as etapas em um gabinete de biossegurança utilizando técnicas assépticas.

1. Preparar meio de cultura celular composto por meio basal SmBM (CC-3181) e suplementos SmGM-2 SingleQuots (CC-4149), excluindo soro fetal bovino (FBS), de acordo com as instruções do fabricante. Conservar a 4 °C até à utilização.
2. Alíquota 50 mL do meio de cultura celular e adicionar 1% v/v de FBS (CC-4149) (ver Tabela de Materiais) para fazer um meio de soro baixo. Conservar a 4 °C até à utilização.
3. Ressuspenda o pó de pasta de gelatina de acordo com as instruções do fabricante usando meios de cultura de células estéreis sem FBS como solvente (consulte a Tabela de Materiais). Imediatamente antes da utilização, ajustar o pH final da pasta de gelatina para pH 9 utilizando hidróxido de potássio (KOH) 2 M e/ou ácido clorídrico 2 M (HCl) para ajustar o pH da solução, conforme necessário, utilizando um medidor de pH.
4. Encha o número desejado de poços de uma placa de 24 poços cada um aproximadamente meio cheio usando 1 mL de pasta de gelatina por poço usando uma seringa sem a agulha.
   NOTA: Preencha uniformemente o centro dos poços e confirme que não existem bolsões de ar. Bata na placa para ajudar a distribuir uniformemente a lama de micropartículas. Ajuste a altura e o volume da lama conforme necessário para acomodar cada tamanho e forma de bioimpressão. Os usuários podem criar uma seringa caseira para transferir a pasta de gelatina para cada poço. Isso pode ser feito adicionando um êmbolo de seringa de tamanho correto em um tubo de ensaio de 50 mL já contendo a pasta de gelatina compactada na parte inferior. Ao inserir o êmbolo, insira um pequeno fio-guia ao lado do tubo de ensaio para ajudar a escapar do ar e, em seguida, remova-o quando o êmbolo estiver em contato com a pasta de gelatina. Imediatamente antes de usar, corte a ponta do tubo de ensaio com uma lâmina de barbear para criar um orifício para que a pasta de gelatina saia e pressione o êmbolo.
5. Coloque a placa cheia de 24 poços no centro do palco da bioimpressora e fixe-a no palco.
   NOTA: A Figura 2 mostra uma configuração genérica da bioimpressora. Coloque um elástico ao redor do palco de impressão para prender uma placa de 24 poços à plataforma e evitar o movimento.

Figura 2: Configuração básica da bioimpressão 3D. A bioimpressora foi montada dentro de um ambiente estéril, como um gabinete de biossegurança, e a cabeça de impressão foi montada de modo que a seringa de vidro e a agulha fossem abaixadas verticalmente na área de impressão do banho de apoio abaixo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Cultura celular

OBS: Executar todas as etapas em um gabinete de biossegurança utilizando técnicas assépticas.

1. Descongelar células HPAAF (obtidas comercialmente, ver Tabela de Materiais) e expandi-las em frascos plásticos tratados com cultura de tecidos T-75 contendo Meio Basal SmBM (CC-3181) e todos os suplementos SmGM-2 SingleQuots (CC-4149) de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais).
   NOTA: Protocolos padrão de cultura de células para células aderentes devem ser usados, mantendo as células a 37 °C e 5% CO₂ e repondo o meio a cada poucos dias.
2. Uma vez que os HPAAFs tenham atingido ~80-90% de confluência, aspirar o meio e enxaguar as células uma vez com solução salina tamponada com fosfato (PBS).
3. Adicionar aproximadamente 4 mL de tripsina-EDTA a 0,05% pré-aquecido a cada frasco T-75. Inclinar o balão para garantir que toda a superfície de cultura celular seja coberta com solução de tripsina-EDTA a 0,05%. Incubar os frascos durante 3-5 minutos a 37 °C e verificar o desprendimento celular.
4. Uma vez que as células estejam flutuando, adicionar pelo menos 6 mL de meio de águia modificada de Dulbecco (DMEM) a cada frasco e transferir as células para um tubo cônico de 50 mL.
5. Centrifugar a suspensão celular a 300 x g por 5 min à temperatura ambiente para peletizar as células. Aspirar o sobrenadante da pastilha celular e ressuspender as células em meio de 1-3 mL com FBS usando uma pipeta de 1000 μL, garantindo uma suspensão de célula única.
6. Transferir 10 μL da suspensão celular para um tubo de microcentrífuga. Adicione 10 μL de solução de Azul de Tripano e misture bem. Use 10 μL dessa mistura para contar células dentro de um hemocitômetro usando um microscópio de luz invertida.
   NOTA: Para atingir uma concentração final de biotinta de 4 x 10⁶ células/mL, 800.000 fibroblastos foram reservados para cada 200 μL de biotinta.

5. Preparação da biotinta hidrogel

NOTA: A preparação de biotinta foi adaptada de Davis-Hall et ^al.5. As etapas 5.1-5.2 podem ser concluídas em paralelo com as etapas 4.1-4.3 para minimizar o tempo entre a coleta celular e a ressuspensão na biotinta. Executar etapas em um gabinete de biossegurança usando uma técnica asséptica.

1. Preparar uma solução de fosfina tris(2-carboxietil) de 20 mM (TCEP, ver Tabela de Materiais) pH 7 e filtro estéril usando um filtro de seringa de 0,2 μm. Imediatamente antes da utilização, adicionar 2 M KOH e/ou 2 M HCl para ajustar o pH da solução, conforme necessário. Meça com medidor de pH e ajuste de acordo.
   NOTA: O CEP reduz as ligações dissulfeto.
2. Preparar uma solução-mãe de 0,25 mg/mL de PEGαMA ressuspensa em meio de cultura celular estéril sem FBS, soluções-estoque de 250 mM de 1,4-ditiotreitol (DTT), reticulante degradável de MMP2 e peptídeo CGRGDS (RGD) (ver Tabela de Materiais), ressuspendendo tudo em TCEP estéril de 20 mM e uma solução estoque de 15% em peso de poli(óxido de etileno) (PEO) em água destilada (DI) usando pipetas conforme necessário.
3. Seguindo a Tabela 1 como guia, combine as respectivas quantidades necessárias de PEGαMA, TDT, reticulante degradável para MMP2, PEO, CGRGDS e meios de cultura de células de baixo soro juntamente com os fibroblastos em um tubo cônico de 50 mL.
   NOTA: Recomenda-se verificar o pH com tiras de pH depois de adicionar todos os meios de cultura celular, exceto o meio de cultura celular, pois esta combinação deve resultar no pH muito próximo de 6,2. Se forem necessários mais ajustes de pH, acompanhe quanto volume adicional é necessário para ajustar o pH da solução precursora. Aumentar o volume total para 200 μL adicionando o volume restante do meio de cultura celular menos qualquer volume adicionado durante o ajuste final do pH.
4. Misture a biotinta usando uma pipeta de deslocamento positivo para garantir que as células sejam células únicas e confirme se a solução precursora final é pH 6,2 para evitar a polimerização catalisada por base durante a bioimpressão 3D.
5. Coloque a biotinta na seringa de vidro removendo o êmbolo e usando uma seringa separada com uma ponta de agulha romba de 1,5" de comprimento de calibre 15 (ver Tabela de Materiais) conectada para transferir a biotinta do tubo da centrífuga para a seringa, tomando cuidado para evitar a formação de bolhas de ar dentro da solução.
6. Coloque a seringa de vidro dentro da cabeça de impressão e conecte os componentes da cabeça de impressão para que tudo esteja firmemente montado e pronto para impressão.
   NOTA: Neste ponto, a seringa de vidro dentro da cabeça de impressão deve ter uma ponta de agulha romba de 30 gauge de 0,5" de comprimento acoplada a ela para impressão.

   

Componente	Concentração da Solução Estoque	Valor a ser adicionado
PEGαMA	0,25 mg/ml	140 μL
TDT	250 mM	12,24 μL
Reticulante Degradável MMP2	250 mM	5,25 μL
RGD	250 mM	1,6 μL
PEO	15% em peso	33,33 μL
Meio de Ativação e/ou Reagentes de Ajuste de pH	-	7,58 μL
Fibroblastos	-	800000 células

Tabela 1: Exemplos de volumes necessários para preparar 200 μL de biotinta (solução precursora de hidrogel e células de fibroblastos).

6.3D bioimpressão

OBS: Executar todas as etapas em um gabinete de biossegurança utilizando técnicas assépticas.

1. Usando as setas direcionais dentro do software Pronterface, ajuste manualmente a posição da agulha de extrusão no centro de um poço e dentro da lama do banho de suporte. Deixe pelo menos 1 mm de lama de banho de apoio abaixo da ponta da agulha.
   NOTA: O software não tem capacidade de dizer onde a agulha está dentro do espaço. Cabe completamente ao usuário mover a agulha clicando manualmente nas setas dentro do software (por exemplo, clicar na seta para cima moverá a agulha para cima ou para longe da plataforma de impressão, etc.). Manobrar a agulha cuidadosamente para garantir que ela não atingirá nenhum limite do poço.
2. Uma vez que a ponta da agulha esteja situada no centro da lama dentro do poço, aperte o botão de partida dentro do Pronterface e aguarde a impressão ser concluída para obter construções, como demonstrado na Figura 3A.
   Observação : para bioimprimir uma construção usando o arquivo fornecido (arquivo suplementar 1), levará aproximadamente 3 min. Leva aproximadamente 5 minutos para orientar e mover a agulha e, em seguida, imprimir uma construção completamente do início ao fim.
3. Repita as etapas 6.1-6.2 até que o número de construções bioimpressas desejadas seja atingido.
   Observação : é recomendável fazer mais construções do que o necessário para contabilizar quaisquer impressões malsucedidas. Se ocorrer uma falha, vá para o próximo poço, redefina tudo e repita as etapas 6.1-6.2 novamente.
4. Deixe a placa do poço à temperatura ambiente e cubra-a no BSC por 1 h após o término da impressão para permitir a polimerização catalisada por base do hidrogel fotosintonizável.
5. Coloque a placa de poço contendo construções bioimpressas em 3D em uma incubadora estéril a 37 °C e deixe-as por 12-18 h para derreter a lama do banho de suporte.

Figura 3: Esquema experimental. Esse protocolo foi descrito em três grandes etapas: (A) bioimpressão 3D de tubos ocos de PEGαMA com células emblocadas para mimetizar a vasculatura pulmonar. (B) Fotoiniciação da reação de homopolimerização para enrijecimento do microambiente celular. (C) Avaliação de marcadores celulares de proliferação e ativação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

7.3D cultura de construção bioimpressa e fotoenrijecimento

OBS: Todas as etapas devem ser realizadas em gabinete de biossegurança utilizando técnicas assépticas.

1. Preparar 2,2 mM de fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato de lítio (LAP) (ver Tabela de Materiais) solução-mãe em PBS e filtro estéril usando um filtro de seringa de 0,2 μm. Mantenha a solução de LAP protegida da luz.
2. Após 12-18 h, mude a mídia em torno das construções bioimpressas. Remova manualmente o meio e o banho de suporte de gelatina derretida dentro dos poços e tenha cuidado para não perturbar as construções bioimpressas.
   NOTA: É útil remover lentamente a mídia enquanto segura a placa em um ângulo de 45° para que as construções surjam dentro do poço e possam ser vistas. Um cilindro de hidrogel transparente deve ser identificável em cada poço com impressão bem-sucedida (Figura 4A).
3. Adicione um volume apropriado de meio de soro baixo a cada poço.
   NOTA: Para uma placa de 24 poços, o meio de 700 μL por poço deve cobrir completamente as construções bioimpressas. Ajuste conforme necessário.
4. Retornar a placa à incubadora e trocar o meio das amostras a cada 3 dias ou de acordo com o planejamento experimental.
5. Vinte e quatro horas antes do tempo de enrijecimento desejado, retirar os meios das amostras e substituí-los por meios de soro baixo suplementados com 2,2 mM de LA estéril.
   NOTA: Para rotular fluorescentemente a estrutura, inche construções bioimpressas em 3D em PBS suplementadas com 10 μM de metacriloxietil tiocarbamoilrodamila B (verT capaz de Materiais) durante a noite, em seguida, enrijeça conforme descrito na etapa 7.6 para rotular fluorescentemente a estrutura. Transferir para PBS por 2 dias a 4 °C para remover o excesso de rodamina e imagem usando um filtro TRITC (Figura 4B,C).
6. No momento de enrijecimento desejado, retire metade do meio dos poços a serem enrijecidos e coloque a placa com a tampa desligada sob luz UV. Ligue a luz UV e enrijeça essas construções aplicando 10 mW/cm² 365 nm de luz por 5 min usando Omnicure (consulte Tabela de Materiais) e um filtro passa-banda de 365 nm (Figura 3B).
   NOTA: Use o radiômetro/fotômetro para confirmar se a intensidade da luz está correta antes de expor as células à luz UV.
7. Remova o meio restante desses poços e adicione meios frescos de baixo soro a cada poço. Devolva a placa à incubadora.
8. Retire a placa da incubadora e realize o estudo de ativação de fibroblastos no momento desejado seguindo o passo 9.

Figura 4: Estruturas de hidrogel bioimpressas em 3D suportaram a viabilidade celular ao longo do tempo. (A) Fotografia da estrutura de hidrogel impressa em 3D em uma placa de 24 poços. (B) Projeção de intensidade máxima do hidrogel impresso em 3D PEGαMA fluorescentemente marcado. Barra de escala = 1 mm. A microscopia de maior magnificação mostrou poros dentro da estrutura do hidrogel induzidos por micropartículas de gelatina no banho suporte de bioimpressão FRESH. (C) O tubo PEGαMA impresso em 3D com regiões endurecidas marcadas fluorescentemente em microscópio confocal (100 μm z-stack exibido como projeção de intensidade máxima) mostrou controle espacial sobre o enrijecimento em 3D. Barra de escala = 500 μm. (D) Viabilidade da HPAAF em construções bioimpressas em 3D medidas por ensaios vivos/mortos. Construções com 300 μm de espessura e 4 × 10⁶ células/mL superaram todas as outras condições em todos os momentos. A viabilidade atingiu o pico no dia 7. Essa condição e o momento foram selecionados para experimentos futuros. As colunas mostram a média ± EPM, n = 3. *, p < 0,05, ANOVA, Tukey HSD. (E) Imagens confocais representativas de células em construções 3D coradas com reagente vivo/morto no dia 7, o momento com maior viabilidade global. Calceína AM marcou células vivas em verde e iodeto de propídio marcou células mortas em vermelho. A coluna mais à direita mostra que a condição de melhor desempenho tinha uma distribuição celular uniforme e uma alta porcentagem de células vivas. Barra de escala = 500 μm. Reproduzido com permissão de Davis-Hall et ^al.5. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

8. Avaliação da viabilidade de fibroblastos

1. Nos momentos de viabilidade desejados, corar usando calceína AM e iodeto de propídio (ver Tabela de Materiais).
   NOTA: Para resumir, os meios devem ser removidos de cada poço e as construções devem ser lavadas com PBS estéril. Incubar as construções em uma solução de coloração viva/morta por 40 min a 37°C em um balancim. A solução corante deve conter calceína AM (diluição 1:1000) e iodeto de propídio (diluição 1:1000) para identificar células vivas ou mortas nos exames de imagem.
2. Transfira as construções para PBS estéril e imediatamente a imagem em um microscópio confocal de fluorescência. Adquira três diferentes imagens z-stack de 100 μm por amostra por ponto de tempo e expresse viabilidade como a porcentagem média de células vivas (Figura 4D,E).

9. Avaliação da ativação fibroblástica

1. Preparar 3% p/v de albumina de soro bovino (BSA) e 0,1% v/v Tween 20 em PBS. Esta solução será referida como a solução de imunofluorescência (IF).
2. Nos momentos desejados, remova o meio dos poços de amostra e lave as construções com PBS. Substitua o PBS por paraformaldeído (PFA) a 4% e mantenha essas amostras a 37 °C por 30 min em um balancim. Em seguida, substitua o PFA 4% por glicina 100 mM em PBS e deixe essas amostras em balancim à temperatura ambiente (TR) por mais 15 min.
3. Em seguida, transfira essas amostras para criomoldes Tissue-Tek, cubra a amostra completamente com solução de temperatura de corte ideal (OCT) (consulte Tabela de Materiais) e permita que a OCT se difunda nas amostras por 12-18 h a 4 °C.
4. Congelar rapidamente as amostras embebidas em OCT em 2-metilbutano utilizando azoto líquido. Encha uma caixa de isopor ou outro recipiente apropriado com nitrogênio líquido e, em seguida, coloque um segundo recipiente cheio de 2-metilbutano dentro do nitrogênio líquido para que ele fique pelo menos submerso pela metade. Use pinças para segurar cada criomold contendo uma amostra coberta de OCT em nitrogênio líquido resfriado com 2-metilbutano até congelar visivelmente. Estas amostras podem ser armazenadas a -80 °C até estarem prontas para a criossecção.
   CUIDADO: Equipamentos de proteção individual (EPIs), como luvas protetoras a frio, avental protetor contra frio e protetor facial fornecido no Kit de Segurança Criogênica (consulte Tabela de Materiais) devem ser usados ao manusear nitrogênio líquido.
5. Criosecção das amostras congeladas de OCT a -22 °C e anexar cortes de 10 μm de espessura a lâminas de microscópio de vidro carregadas positivamente. Prepare três lâminas de microscópio com pelo menos 3-5 criosecções por lâmina para cada amostra de hidrogel 3D.
   NOTA: As lâminas do microscópio podem ser armazenadas neste ponto a -80 °C, se necessário, como ponto de parada.
6. Fixe as criosecções em acetona gelada por 15 min para ajudar as criosecções a aderirem às lâminas. Enxágue suavemente as criossecções com água RT para remover qualquer OCT restante. Deixe essas amostras secarem e contorne as criossecções com uma caneta hidrofóbica (consulte a Tabela de Materiais).
7. Permeabilizar as amostras à temperatura ambiente com Triton X-100 0,2% v/v em PBS por 10 min e, em seguida, bloquear os cortes com 5% BSA p/v em PBS por 1 h em TR.
8. Adicione o anticorpo primário anti-actina de músculo liso alfa humano (αSMA) de rato (diluição de 1:250) (ver Tabela de Materiais) à solução FI. Armazenar estas amostras seccionadas com o anticorpo primário sobre elas durante a noite a 4 °C. Enxaguar as amostras 3x com solução FI.
9. Incubar as secções em solução de IF contendo o anticorpo secundário de cabra anti-rato Alexa Fluor 555 (diluição de 1:250) e duas gotas de ActinGreen 488 ReadyProbe (ver Tabela de Materiais) por mililitro de solução de FI. Cubra as amostras para todas as etapas subsequentes com papel alumínio para protegê-las da luz e deixe a solução de anticorpos secundários permanecer nas amostras por 1 h no RT.
10. Enxaguar as secções 3x com solução IF. Incubá-los em 300 nM 4',6-diamidino-2-filindolo (DAPI) em água DI por 15 min em RT. Realizar um enxágue final das seções 3x com água DI.
11. Usando 10 μL de um reagente antifade disponível comercialmente (ver Tabela de Materiais), cubra as seções usando métodos padrão.
    NOTA: As lâminas montadas podem ser armazenadas protegidas da luz em um freezer de -80 °C até que seja necessário para a obtenção de imagens.
12. Imagem das criossecções em microscópio de fluorescência (Figura 3C e Figura 5B). Imagine três seções aleatórias por slide usando uma objetiva de 10x.
    NOTA: As imagens devem ser obtidas nos canais DAPI, FITC e TRITC.
13. Carregue as imagens no ImageJ (NIH). Quantificar a porcentagem de células positivas para αSMA como medida da ativação fibroblástica (Figura 5A) dividindo o número total de células positivas para αSMA pelo número total de núcleos celulares para cada campo de visão.

Figura 5: Ativação fibroblástica em modelos bioimpressos 3D de adventícia arterial pulmonar . (A) Ativação fibrótica em hidrogéis 3D moles e enrijecidos medidos pela expressão de αSMA. HPAAFs em construções enrijecidas foram significativamente mais positivas para αSMA do que células em construções moles. As colunas representam a média ± EPM, n = 3. *, p < 0,05, teste U de Mann-Whitney. (B) Imagens confocais representativas de imunomarcação para αSMA, actina e DAPI em hidrogéis 3D moles e enrijecidos. HPAAFs em construções enrijecidas mostraram imunofluorescência αSMA mais prevalente do que células em construções moles. Barra de escala = 250 μm. (C) Proliferação fibroblástica em construções bioimpressas 3D macias e enrijecidas medidas pela positividade de EdU. HPAAFs em construções enrijecidas foram significativamente mais positivas para EdU do que células em construções moles. As colunas representam a média ± EPM, n = 3. *, p < 0,05, teste U de Mann-Whitney. (D) Imagens confocais representativas de imunomarcação para EdU e corante Hoechst em hidrogéis 3D moles e enrijecidos. HPAAFs em construções enrijecidas mostraram imunofluorescência EdU mais prevalente do que células em construções moles. Barra de escala = 300 μm. Reproduzido com permissão de Davis-Hall et ^al.5. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

10. Avaliação da proliferação fibroblástica

1. Vinte e quatro horas antes de um ponto de tempo de proliferação desejado, remova o meio de cultura celular de cada poço e substitua por meios de soro baixo suplementados com solução de EdU de 10 μM do kit de proliferação celular disponível comercialmente (ver Tabela de Materiais). Retorne as amostras à incubadora para incubação durante a noite.
2. No ponto de tempo de proliferação desejado, fixar as amostras incubadas com EdU usando PFA 4% a 37 °C por 30 min em um balancim. Substitua a solução de PFA a 4% por glicina 100 mM em PBS e incube as amostras a 37 °C durante, pelo menos, 15 minutos. Adicione o Hoechst numa concentração adequada durante 30 min e, em seguida, lave as construções 2x com PBS.
   NOTA: As amostras podem ser armazenadas protegidas da luz a 4 °C até à obtenção de imagens.
3. Imagens de todas as amostras de EdU fixadas e armazenadas usando um microscópio de fluorescência e as configurações e filtros sugeridos pelo fabricante do kit de proliferação celular (Figura 3C e Figura 5D). Adquira três imagens z-stack diferentes de 100 μm por amostra e crie projeções máximas de cada uma dessas z-stacks. Meça a proliferação de HPAAF contando o número de células EdU-positivas e dividindo-se pelo número total de células identificadas pela contracoloração Hoechst dentro das imagens de projeção máxima (Figura 5C).

Resultados

Este protocolo descreve como bioimprimir hidrogéis fototáveis em 3D dentro de um banho de suporte para criar construções capazes de enrijecimento dinâmico e temporal para estudar a ativação de fibroblastos em geometrias que mimetizam tecidos humanos. Primeiro, o protocolo explicou como sintetizar PEGαMA, a espinha dorsal desse sistema polimérico fotosintonizável. Medidas de espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) mostraram sucesso na funcionalização do PEGαMA em 96,5% (Fi...

Discussão

Reações de polimerização em duplo estágio em resposta à exposição controlada à luz podem enrijecer biomateriais com controle espacial e temporal. Vários estudos têm utilizado essa técnica para avaliar interações célula-matriz em diversas plataformas5,8,9,10,11,21,22,23.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
AccuMax Radiometer/Photometer Kit	Spectronics Corporation	XPR-3000	To measure light intensity, used for photostiffening
Acetic Acid	Fisher Scientific	BP2401-500	Used during PEGaMA synthesis
Acetone	Fisher Scientific	A184	Used with the cryosections
ActinGreen 488 ReadyProbes	Fisher Scientific	R37110	Used for staining
Aluminum Foil	Reynolds	F28028
Anhydrous Tetrahydrofuran (THF)	Sigma-Aldrich	401757-1L	Used during PEGaMA synthesis
Argon Compressed Gas	Airgas	AR R300	Used during PEGaMA synthesis
8 Arm Poly(ethylene glycol)-hydroxyl (PEG-OH)	JenKem Technology	8ARM-PEG-10K	Used during PEGaMA synthesis
365 nm Bandpass Filter	Edmund Optics	65-191	Used for photostiffening
Bovine Serum Albumin (BSA)	Fisher Scientific	BP9700-100	Used during staining process
Buchner Funnel	Quark Glass	QFN-8-14	Used during PEGaMA synthesis
Calcein AM	Invitrogen	65-0853-39	Used during staining process
Celite 545 (Filtration Aid)	EMD Millipore	CX0574-1	Used during PEGaMA synthesis
Charged Microscope Slides	Globe Scientific	1358W
Chloroform-d	Sigma-Aldrich	151823-10X0.75ML	Used to characterize PEGaMA
Click-iT Plus EdU Cell Proliferation Kit	Invitrogen	C10637	Used for staining
50 mL Conical Tubes	CELLTREAT	667050B
Cryogenic Safety Kit	Cole-Parmer	EW-25000-85
Cryostat	Leica	CM 1850-3-1
Dialysis Tubing	Repligen	132105
4’,6-Diamidino-2-Phylindole (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542-1MG	Used for staining
Diethyl Ether	Fisher Scientific	E1384	Used during PEGaMA synthesis
1,4-Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	10197777001	Bioink component
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Cytiva	SH30271.FS
Filter Paper	Whatman	1001-090	Used during PEGaMA synthesis
Freezone 2.5L Freeze Dry System	Labconco	LA-2.5LR	Lyophilizer
Fusion 360	Autodesk	N/A	Software download
2.5 mL Gastight Syringe	Hamilton	81420	Used for bioprinting
15 Gauge 1.5" IT Series Tip	Jensen Global	JG15-1.5X	Used for bioprinting
30 Gauge 0.5" HP Series Tip	Jensen Global	JG30-0.5HPX	Used for bioprinting
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 555 Antibody	Fisher Scientific	A21422	Used for staining
Glycine	Fisher Scientific	C2H5NO2	Used during staining process
Hemocytometer	Fisher Scientific	1461
Hoechst	Thermo Scientific	62249	Used during staining process
Human Pulmonary Artery Adventitial Fibroblasts (HPAAFs)	AcceGen	ABC-TC3773	From a 2-year-old male patient
Hydrochloric Acid (HCl)	Fisher Scientific	A144-500	Used to pH adjust solutions
ImageJ	National Institutes of Health (NIH)	N/A	Free software download
ImmEdge® Pen	Vector Laboratories	H-4000	Used during staining process
Incubator	VWR	VWR51014991
LifeSupport Gelatin Microparticle Slurry (Gelatin Slurry)	Advanced Biomatrix	5244-10GM	Used for bioprinting
Light Microscope	Olympus	CKX53	Inverted light microscope
Lithium Phenyl-2,4,6-Trimethylbenzoylphosphinate (LAP)	Sigma-Aldrich	900889-5G	Photoinitiator used for photostiffening
Liquid Nitrogen	N/A	N/A
LulzBot Mini 2	LulzBot	N/A	Bioprinter adapted
Methacryloxyethyl Thiocarbamoyl Rhodamine B	Polysciences Inc.	669775-30-8
2-Methylbutane	Sigma-Aldrich	M32631-4L
Microman Capillary Pistons CP1000	VWR	76178-166	Positive displacement pipette tips
MMP2 Degradable Crosslinker (KCGGPQGIWGQGCK)	GL Biochem	N/A	Bioink component
Mouse Anti-Human αSMA Monoclonal Antibody	Fisher Scientific	MA5-11547	Used for staining
OmniCure Series 2000	Lumen Dynamics	S2000-XLA	UV light source used for photostiffening
Paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy Sciences	15710	Used to fix samples
pH Meter	Mettler Toledo	FP20
pH Strips	Cytiva	10362010
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Hyclone Laboratories, Inc.	Cytiva SH30256.FS
Pipette Set	Fisher Scientific	14-388-100
10 µL Pipette Tips	USA Scientific	1120-3710
20 µL Pipette Tips	USA Scientific	1183-1510
200 µL Pipette Tips	USA Scientific	1111-0700
1000 µL Pipette Tips	USA Scientific	1111-2721
Poly(Ethylene Glycol)-Alpha Methacrylate (PEGαMA)	N/A	N/A	Refer to manuscript for synthesis steps
Poly(Ethylene Oxide) (PEO)	Sigma-Aldrich	372773-250G	Bioink component
Positive Displacement Pipette	Fisher Scientific	FD10004G	100-1000 µL
Potassium Hydroxide (KOH)	Sigma-Aldrich	221473-500G	Used to pH adjust solutions
ProLong Gold Antifade Reagent	Invitrogen	P36930	Used during staining process
Pronterface	All3DP	N/A	Software download
Propidium Iodide	Sigma-Aldrich	P4864-10ML	Used for staining
RGD Peptide (CGRGDS)	GL Biochem	N/A	Bioink component
Rocker	VWR	10127-876
Rotary Evaporator	Thomas Scientific	11100V2022	Used during PEGaMA synthesis
Rubber Band	Staples	808659
Schlenk Flask	Kemtech America	F902450	Used during PEGaMA synthesis
Slic3r	Slic3r	N/A	Software download
Smooth Muscle Cell Growth Medium-2 (SmGM-2) BulletKit	Lonza	CC-3182	Kit contains CC-3181 and CC-4149 components
Sodium Hydride	Sigma-Aldrich	223441-50G	Used during PEGaMA synthesis
Sorvall ST 40R Centrifuge	Fisher Scientific	75-004-525
Stir Bar	VWR	58948-091
Syringe Filter	VWR	28145-483	Used to sterile filter solutions
T-75 Tissue-Cultured Treated Flask	VWR	82050-856	Used for cell culture work
Tissue-Tek Cyromold	Sakura	4557
Tissue-Tek O.C.T Compound (OCT)	Sakura	4583
Tris(2-Carboxyethyl) Phosphine (TCEP)	Sigma-Aldrich	C4706-2G
Triton X-100	Fisher Bioreagents	C34H622O11	Used during staining process
Trypan Blue	Sigma-Aldrich	T8154-20ML	Used for cell culture work
0.05% Trypsin-EDTA	Gibco	25-300-062	Used for cell culture work
Tween 20	Fisher Bioreagents	C58H114O26	Used during staining process
Upright Microscope	Olympus	BX63F	Fluorescent microscope capabilities
Water Bath	PolyScience	WBE20A11B
24-Well Tissue Culture Plates	Corning	3527