Knockdown de FAM83A para verificar seu papel no crescimento de células de câncer cervical e sensibilidade à cisplatina

Resumo

Aqui, mostramos os procedimentos para knockdown do FAM83A ; os ensaios para detectar seus efeitos sobre a proliferação, migração e invasão de células de câncer cervical; e a sensibilização dessas células à cisplatina. Este estudo fornece um gene alvo promissor para o câncer cervical e uma referência para futuras pesquisas de drogas.

Resumo

A exploração de genes-alvo tumorais é de suma importância para a prevenção e tratamento do câncer cervical. Neste estudo, descrevemos as etapas envolvidas na identificação de um gene alvo tumoral FAM83A no câncer cervical. Primeiro, o conjunto de dados do Atlas do Genoma do Câncer foi empregado para validar a expressão e o significado prognóstico de FAM83A em mulheres. Um pequeno RNA de interferência (siRNA) foi usado para knockdown do gene FAM83A em células HeLa e C33a . Em seguida, a coloração de 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU) foi conduzida para determinar os efeitos sobre a capacidade de proliferação das células tumorais. Ensaios de cicatrização de feridas e inserção de membrana porosa foram realizados para avaliar a capacidade de migração e invasão de células tumorais.

Western blotting foi usado para quantificar os níveis de proteína relacionada à apoptose. A coloração JC-1 foi empregada para avaliar alterações da função mitocondrial. Além disso, a intervenção com cisplatina (diaminedicloroplatina, DDP) foi utilizada para avaliar o potencial terapêutico do gene alvo. Citometria de fluxo e ensaios de formação de colônias foram conduzidos para validar ainda mais as características anticâncer do gene. Como resultado, o knockdown de FAM83A mostrou inibir a proliferação, migração e invasão de células de câncer cervical e sensibilizar essas células à cisplatina. Essas metodologias abrangentes validam coletivamente o FAM83A como um gene-alvo associado ao tumor, sendo promissor como um alvo terapêutico potencial na prevenção e tratamento do câncer cervical.

Introdução

O câncer do colo do útero é uma preocupação mundial, pois é um dos principais tipos de neoplasia ginecológica no mundo e é a principal causa de mortalidade relacionada ao câncer em^mulheres1. A cirurgia radical e a quimiorradioterapia estão associadas a altas taxas de cura no estágio primário. No entanto, os resultados do tratamento para pacientes em estágio avançado de câncer de colo uterino que desenvolvem doença metastática são muito desfavoráveis². Portanto, é crucial compreender melhor os mecanismos biológicos subjacentes à migração e invasão de células cancerosas do colo do útero e identificar potenciais alvos terapêuticos para a prevenção e tratamento desta doença.

Identificar genes-alvo envolvidos na progressão do câncer e encontrar maneiras de inibir sua expressão ou ação apresentam opções promissoras de tratamento. Neste estudo, identificamos FAM83 como um gene causador de câncer e investigamos seus efeitos inibitórios em células C33a e HeLa. Os oncogenes da família FAM83 (FAM83A-H) são amplamente relatados em cânceres humanos ^3,4. Recentemente, foi relatado que o FAM83A é upregulated em cânceres de pulmão⁵, mama⁶, ovário⁷ e pâncreas⁸, indicando que o FAM83A desempenha um papel importante na progressão do câncer por meio da promoção da proliferação, invasão, características semelhantes a células-tronco e resistência a drogas nas células tumorais. É importante ressaltar que o FAM83A foi identificado como um dos novos genes candidatos associados à progressão da lesão cervical e carcinogênese⁹. Apesar da confirmação da expressão elevada de FAM83A em células humanas de câncer cervical, o impacto específico e os mecanismos subjacentes de FAM83A no câncer cervical permanecem obscuros.

Neste estudo, delineamos os protocolos envolvidos na identificação de FAM83A como um gene alvo tumoral em câncer cervical e usamos um pequeno RNA de interferência (siRNA) para o knockdown do gene FAM83A em células HeLa e C33a . A coloração com 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU) foi realizada para determinar os efeitos sobre a proliferação de células tumorais, enquanto os ensaios de cicatrização de feridas e inserção de membrana porosa ajudaram a avaliar a migração e a capacidade de invasão de células tumorais.

Western blotting foi realizado para determinar os níveis de proteínas relacionadas à apoptose, e a coloração JC-1 foi empregada para avaliar alterações da função mitocondrial. Assim, relatamos que o FAM83A desempenha um papel crítico na proliferação celular, metástase e invasão no câncer cervical. Através da disfunção mitocondrial e apoptose associadas à via PI3K/AKT, o knockdown FAM83A sensibilizou células de câncer cervical à cisplatina (diaminedicloroplatina, DDP). Este estudo fornece um novo alvo para o câncer do colo do útero e possivelmente outros cânceres e uma referência para o desenvolvimento de estratégias para superar a resistência das células cancerosas a certas drogas quimioterápicas.

Protocolo

O estudo estava completamente de acordo com as diretrizes de publicação fornecidas pelo TCGA (https://cancergenome.nih.gov/publications/publicationguidelines). Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, reagentes e instrumentos usados neste protocolo.

1. Fonte de dados e análise bioinformática

1. Obter dados de sequenciamento de RNA do banco de dados (https://cancergenome.nih.gov) do Atlas do Genoma do Câncer (TCGA) para análise de agrupamento. Use o GEPIA (http://gepia.cancer-pku.cn/), uma ferramenta baseada na web para recalcular dados brutos de RNA-Seq de amostras de projetos TCGA, para rastrear alvos de drogas candidatas ao câncer com um pipeline de processamento padrão.
   NOTA: O site do GEPIA está disponível gratuitamente para todos os usuários.
2. Acesse a página inicial do site do GEPIA e clique em Análise de Tipo de Câncer, selecione a opção Análise Diferencial de genes e defina os seguintes parâmetros: Nome do câncer = CESE (definido como carcinoma de células escamosas do colo do útero e adenocarcinoma endocervical nesta página), |Log2FC| Ponto de corte = 1, valor de q Cutoff = 0,01, Métodos Diferenciais = ANOVA e Distribuição Cromossômica = ambos. Em seguida, clique em Lista para obter uma lista de genes que mostre expressão diferencial entre grupos tumorais e normais.
   NOTA: Requer uma extensa revisão da literatura para identificar genes candidatos diferencialmente expressos. Neste estudo, considerando o histórico da literatura disponível, enfocamos o gene tumoral de interesse, FAM83A.
3. Em seguida, examine a expressão de FAM83A no câncer cervical e tecidos normais usando GEPIA prosseguindo para a opção Expressão DIY no site e selecione Boxplot como o tipo de gráfico. Insira FAM83A no campo de parâmetro do gene e defina os seguintes parâmetros: |Log2FC| Valor de corte = 1; valor de q Ponto de corte = 0,01. Selecione CESE como o nome do câncer e Corresponder dados normais do TCGA para o campo de dados Normal Correspondente , deixando todas as outras configurações como padrão. Clique em Plotar e permitir que o site gere um boxplot representando a expressão diferencial do gene FAM83A ; Salve o boxplot para referência e análise futuras.
4. Finalmente, analisar a sobrevida global de pacientes portadoras de tumores com diferentes níveis de expressão de FAM83A no câncer cervical. Navegue até a opção Gráficos de sobrevivência no site, defina o Gene como FAM83A e selecione Sobrevivência global como o tipo de análise. Adicione o nome do tumor CESE, escolha Meses para as Unidades do Eixo e deixe todos os outros parâmetros em suas configurações padrão. Clique em Plotar e deixe o site gerar um gráfico de curva de sobrevivência; Salve este gráfico para referência e análise futuras.
5. Levar em consideração tanto a expressão diferencial de FAM83A em tumores quanto sua correlação com a análise de sobrevida de pacientes para identificar FAM83A como um potencial gene alvo terapêutico no câncer cervical.

2. Experimentos baseados em células

1. Cultura celular
   1. Cultura de linhagens tumorais humanas em meio modificado a 37 °C em atmosfera umidificada de 5% de CO₂ .
      NOTA: Consulte a Tabela de materiais para obter informações sobre a linha celular e os componentes do meio de cultura.
2. Transfecção celular
   1. Use siRNA para derrubar a expressão de FAM83A nas células.
      NOTA: Consulte a Tabela 1 para a sequência específica de siRNA.
   2. Células de sementes em placas de 6 poços e incubar com a mistura de 50 nM si-FAM83A ou siRNA-NC e 8 μL de agente de transfecção ou apenas 8 μL de agente de transfecção por 4-6 h após atingir 50%-70% de confluência. Adicionar apenas DMEM sem soro ao controle negativo.
   3. Após a incubação, substituir o meio contendo o agente transfeccionista por DMEM + 10% de soro fetal bovino. Além disso, 48 h após a transfecção, tratar com cisplatina 5 μM (DDP) por 24 h como pretendido e colher todas as células para extração de RNA total e análise de qRT-PCR.

3. Detecção de EdU para ensaio de proliferação celular

NOTA: Use o Kit de Proliferação Celular EdU para avaliar a proliferação celular in vitro de acordo com as instruções do fabricante.

1. Semeando as células em placas de 6 poços e incubando-as com solução de EdU 10 μM por 2 h. Fixar as células com paraformaldeído a 4% por 15 min à temperatura ambiente (TR) e permeabilizar com Triton X-100 a 0,3% em PBS por 10 min em TR.
2. Remova o tampão de permeabilização e adicione 500 μL de solução de reação 1x. Em seguida, incubar por 30 min no RT no escuro para coloração nuclear.
3. Corar células com 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) e visualizá-las em microscópio de fluorescência com aumento de 200x. Manchar os núcleos das células em proliferação com EdU e examiná-los para fluorescência vermelha.
4. Finalmente, utilizar um software para quantificar os resultados contando pelo menos 10 campos aleatórios e calcular as taxas de proliferação usando a razão entre as células fluorescentes-positivas e o total de células.

4. Ensaio de cicatrização de feridas

1. Células de sementes em placas de 6 poços a uma densidade de 2 × 10⁵ células por poço.
2. Quando as células atingirem 90% de confluência, use uma ponta de micropipeta estéril de 10 μL para criar suavemente um risco linear na monocamada celular. Enxágue suavemente os poços com PBS estéril para remover quaisquer células destacadas e detritos causados por arranhões.
3. Além disso, incubar as células em meio contendo 1% de SFB. Em seguida, observar e tirar imagens com o microscópio invertido para a cicatrização da região ferida em 12, 24 e 48 h.

5. Ensaio de inserção de membrana porosa

1. Preparar uma suspensão celular em meio de cultura celular na concentração celular desejada (contendo 4 × 10⁴ células), incluindo células C33a transfectadas ou controle e HeLa. Adicione a suspensão celular à câmara superior das inserções de membrana, garantindo uma distribuição uniforme. Adicione o meio completo à câmara inferior.
2. Após incubação por 24 h, utilizar álcool metílico e violeta de cristal 0,1% para fixação e coloração das células migratórias para as câmaras inferiores, respectivamente.
3. Use um microscópio invertido para tirar imagens e, em seguida, analisar o número de células migratórias contando pelo menos 10 campos aleatórios com ImageJ.
   1. Para a análise numérica com o ImageJ, abra a imagem no software ImageJ, vá para a guia Imagem no menu da ferramenta, selecione Ajustar e clique em Limite. Ajuste as configurações de limite, se necessário, até que apenas as células fiquem visíveis em um plano de fundo branco.
   2. Clique em Aplicar na janela Limite para aplicar essas configurações à imagem. Agora, selecione a ferramenta Varinha (rastreamento) na barra de ferramentas (localizada na parte superior da janela).
   3. Clique na área da imagem onde as células estão localizadas para selecionar todas as células na imagem limitada. Depois que as células estiverem realçadas, vá para Analisar no menu Ferramenta e, em seguida, clique em Analisar partículas. Na janela Analisar partículas, insira o tamanho desejado (por exemplo, 0 - infinito) e os valores de circularidade (por exemplo, 0,00 - 1,00) de acordo com os requisitos experimentais para incluir todas as células na contagem.
   4. Clique em OK e aguarde até que o software conte as células e que uma nova janela apareça com os resultados da análise.

6. Ensaio de formação de colônias

1. A semente 2 × 10⁵ células por poço dos grupos Si-NC e Si-FAM83A em uma placa de 6 poços com ou sem tratamento com cisplatina (DDP) 5 μM por 24 h.
2. Após um período de 24 horas de tratamento medicamentoso, separar as células usando tripsina a 0,25% e ressuspendê-las em meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) contendo 10% de SFB. Semeando as células ressuspensas em uma placa de 6 poços a uma densidade de 1 × 10³ células por poço e, em seguida, incubar em uma incubadora de 5% de CO₂ a uma temperatura de 37 °C.
3. Após a incubação por ~7-10 dias quando as colônias estiverem visíveis, fixar as células com Polioximetileno a 4% e corá-las com solução corante de Giemsa por 20 min.
4. Lave levemente as células e deixe as placas secarem ao ar. Tire imagens dos aglomerados de colônias ao microscópio e conte o número de colônias que contêm mais de 50 células.

7. Análise da despolarização da membrana mitocondrial (MMP) utilizando o corante JC-1

1. Sementes 1,2 ×^{10 6} células tumorais dos grupos Si-NC e Si-FAM83A em placa de seis poços e cultura por 24 h com ou sem tratamento com cisplatina (DDP) 5 μM.
2. Incubar com 1x solução corante JC-1 durante 15-20 minutos a 5% de CO₂ a 37 °C utilizando um kit de ensaio de potencial de membrana mitocondrial de acordo com as instruções do fabricante.
3. Lave as células e examine-as em microscópio fluorescente com aumento de 200x usando comprimentos de onda de excitação e emissão para JC-1 a ~490 nm e 590 nm, respectivamente. Para visualizar a fluorescência JC-1, use filtros apropriados, como um filtro de excitação azul (450-490 nm) e um filtro de emissão vermelho (passa-longa > 590 nm) para capturar seletivamente o sinal de fluorescência emitido.

8. Análise por citometria de fluxo do PTPm

1. Sementes 1,2 ×^{10 6} células tumorais dos grupos Si-NC e Si-FAM83A em placa de seis poços e cultura por 24 h com ou sem tratamento com cisplatina (DDP) 5 μM.
2. Remova o meio de cultura das células, ressuspenda as células em PBS e adicione 300 μL cada (1x volume) de solução corante Calcein AM e solução de trabalho de resfriamento de fluorescência para cobrir as células uniformemente. Incubar as células a 37 °C em um ambiente protegido à luz por 30-45 min e substituir o meio por meio de cultura fresco pré-aquecido a 37 °C. Incubar as células a 37 °C em um ambiente protegido contra a luz por mais 30 min para garantir a hidrólise completa da Calceína AM por esterases intracelulares, resultando na geração de Calceína verde-fluorescente intracelular.
3. Retire o meio de cultura, lave as células 2-3x com PBS e adicione o tampão de detecção. Detectar mPTP celular usando citometria de fluxo e um comprimento de onda de excitação de 488 nm.

9. Citometria de fluxo

1. Sementes 1,2 ×^{10 6} células tumorais dos grupos Si-NC e Si-FAM83A em placa de seis poços e cultura por 24 h com ou sem tratamento com cisplatina (DDP) 5 μM.
2. Após 24 h de tratamento medicamentoso, ressuspenda as células em 200 μL de solução tampão de ligação e misture suavemente 10 μL de Anexina V-FITC e 5 μL de iodeto de propídio (PI) na suspensão celular. Incubar a mistura durante 15 minutos, evitando a luz, e adicionar 300 μL de solução tampão de ligação às células. Detectar apoptose celular usando citometria de fluxo em um comprimento de onda de excitação de 488 nm.

10. Análise RT-PCR

1. Sementes 1,2 ×^{10 6} células tumorais dos grupos Si-NC e Si-FAM83A em placa de seis poços e cultura por 24 h com ou sem tratamento com cisplatina (DDP) 5 μM.
2. Extrair o RNA total das células tumorais usando o reagente de extração de RNA e converter o RNA extraído em DNA complementar (cDNA) com o cDNA Synthesis Mix, incubando a 42 °C por 45 min e depois a 95 °C por 5 min.
3. Preparar a mistura de reação de PCR contendo DNA polimerase, nucleotídeos, tampão e os primers gene-específicos projetados. Adicionar o molde de cDNA à mistura de reação para a reação de PCR em tempo real e realizar a PCR no instrumento de PCR quantitativo em tempo real com as seguintes condições de termociclagem: desnaturação a 95 °C por 30 s, seguida por 40 ciclos de 95 °C para 5 s e 60 °C para 30 s, e o estágio da curva de fusão a 95 °C por 15 s, 60 °C por 1 min e 95 °C por 15 s. Quantificar os níveis de RNAm usando o método 2^−ΔΔCq usando GAPDH como controle interno.
   OBS: O sistema de reação RT-PCR é mostrado na Tabela 1, e as sequências de primers são mostradas na Tabela 1.
   1. Para calcular o valor de 2^−ΔΔCq , meça os valores de Cq para o gene alvo e o gene de referência (GAPDH) nas amostras. Calcular o ΔCq subtraindo o valor de Cq do gene de referência do valor de Cq do gene alvo para cada amostra. Calcular o ΔΔCq subtraindo o ΔCq de uma amostra controle do ΔCq de cada amostra experimental. Finalmente, calcule o valor de 2^−ΔΔCq elevando 2 para a potência do valor de ΔΔCq.
      Observação : O valor Cq representa o número do ciclo no qual o sinal de fluorescência atinge o limite definido.

11. Análise de Western blot

1. Sementes 1,2 ×^{10 6} células tumorais dos grupos Si-NC e Si-FAM83A em placa de seis poços e cultura por 24 h com ou sem tratamento com cisplatina (DDP) 5 μM.
2. Coletar as células cultivadas e lavá-las com solução salina tamponada com fosfato gelado (PBS) para remover qualquer meio de crescimento residual ou soro. Lisar as células usando RIPA Lysis Buffer contendo fluoreto de fenilmetil sulfonila (PMSF) para liberar as proteínas celulares. Incubar as células no gelo por alguns minutos para garantir a lise completa e centrifugar a 4 °C, 12.000 × g por 15 min. Coletar o sobrenadante para determinar sua concentração de proteínas.
3. Determine a concentração de proteína no lisado celular usando um Kit de Ensaio de Proteína BCA de acordo com as instruções do fabricante. Misture o lisado celular com um tampão de carga e aqueça a mistura a 95-100 °C por 5-10 min para desnaturar as proteínas e garantir uma separação uniforme no gel.
4. De cada amostra, carregar 30 μg de proteína total em um gel SDS-PAGE e executar o SDS-PAGE sob uma tensão constante de 80 V. Pare a eletroforese quando o azul de bromofenol atingir o fundo do gel de separação.
5. Transfira as proteínas separadas do gel para uma membrana de polivinildifluoreto usando um sistema de transferência úmido em um banho de gelo com uma corrente de 200 mA por 1,5 h.
6. Bloquear a membrana com leite desnatado a 5% em solução salina tamponada com Tween-20 a 0,05% (TBST) por 1 h no TR e incubar durante a noite a 4 °C com os respectivos anticorpos administrados na Tabela de Materiais.
7. Lavar a membrana várias vezes com TBST e incubar com os anticorpos secundários (Tabela de Materiais) por 1 h no TR, seguido de lavagem com TBST. Visualize as bandas de proteínas usando um kit de detecção de quimioluminescência aprimorado e um sistema de imagem.

12. Análise estatística

1. Como todos os pontos de dados experimentais serão independentes, apresente os dados como média ± DP.
2. Utilizar análise de variância (ANOVA) one-way para comparações múltiplas e teste de Dunnett para comparar cada grupo com o grupo controle. Utilizar o teste t de Student (bicaudal não pareado) para comparar dois grupos; consideram P < 0,05 significativo.

Resultados

Análise do banco de dados TCGA e validação do PCR

A partir da análise do banco de dados TCGA, realizamos uma análise comparativa dos níveis de expressão de RNAm em 306 amostras de células de câncer cervical e 13 amostras de células normais para investigar a expressão diferencial de FAM83A. O FAM83A foi regulado para cima no câncer cervical, enquanto sua expressão no tecido cervical...

Discussão

A investigação de genes-alvo tumorais é de extrema importância tanto para a prevenção quanto para o tratamento do câncer cervical. A compreensão dos genes específicos que desempenham um papel significativo no desenvolvimento e progressão do câncer cervical fornece informações valiosas sobre os mecanismos moleculares subjacentes da doença. Além disso, a identificação desses genes-alvo pode levar ao desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas e terapias-alvo. Neste estudo, descrevemos o uso da aná...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cells and Medium Formulation
C33a	American Type Culture Collection
Hela	American Type Culture Collection
Modified medium			10% fetal bovine serum and + antibiotics (100 U/mL penicillin and 100 U/mL streptomycin)
Antibody Information
AKT	4691, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
Bcl2	26593-1-AP, Proteintech Group, Inc		‘1:1,000
Caspase 3	19677-1-AP, Proteintech Group, Inc		‘1:2,000
cleaved-caspase3	abs132005; Absin Bioscience Inc.		‘1:1,000
Cytc	10993-1-AP; Proteintech Group		‘1:1,000
GAPDH	10494-1-AP, Proteintech Group, Inc.		‘1:8,000
mTOR	2983, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
PI3K	4292, Cell Signaling Technology Inc		‘1:1,000
p-AKT	4060, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
p-mTOR (Ser2448)	#5536, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
p-PI3K p85 subunit	17366, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
Secondary antibodies	GB23303, Servicebio		‘1:2,000
Materials
6-well plate	Corning, NPY
Alexa Fluor 555	Beyotime
BCA Protein assay kit	Beyotime, China		P0011
ChemiDoc XRS Imager System	BioRad
Enhanced chemiluminescence detection kit	Servicebio, Inc.,China		cat. no. G2014
Fluorescence microscope	Olympus Corporation, Tokyo, Japan
Hifair II 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix	11123ES60, Yeasen Biotech o., Ltd., China
Inverted microscope	Olympus, Tokyo, Japan;
Millicell transwell inserts	Millipore,Bedford, MA, USA
Mitochondrial membrane potential assay kit	Beyotime, China
PMSF	ST506, Beyotime Biotech, Jiangsu, China		#ST506
Real-time quantitative PCR instrument	Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. China.
RIPA Lysis Buffer	Beyotime Biotech, Jiangsu, China
TRIzol reagent	Invitrogen		15596026
TRIzol reagent	Takara Bio Inc., Otsu, Japan
Software
Image-Pro	plus 6.0