Diagnóstico Rápido Baseado na Reação em Cadeia da Polimerase Quantitativa (qPCR) da Infecção por Helicobacter pylori e Resistência a Antibióticos

Resumo

O protocolo apresenta um método não invasivo para o diagnóstico rápido de infecções estomacais pelo Helicobacter pylori através do teste de cordas e determina sua resistência antibiótica à claritromicina e levofloxacina usando a reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR).

Resumo

O Helicobacter pylori é um importante patógeno humano que infecta aproximadamente metade da população mundial e está se tornando uma séria ameaça à saúde devido à sua crescente resistência aos antibióticos. É o agente causador de gastrite crônica ativa, úlcera péptica e câncer gástrico e foi classificado como carcinógeno do Grupo I pela Agência Internacional de Pesquisa em Câncer. Portanto, o diagnóstico rápido e preciso do H. pylori e a determinação de sua resistência a antibióticos são importantes para a erradicação eficiente desse patógeno bacteriano. Atualmente, os métodos de diagnóstico do H. pylori incluem principalmente o teste respiratório da ureia (UBT), o teste de antígeno, o teste de anticorpos séricos, a gastroscopia, o teste rápido da urease (RUT) e a cultura bacteriana. Dentre eles, os três primeiros métodos de detecção são não invasivos, ou seja, são testes de fácil realização. No entanto, as bactérias não podem ser recuperadas através dessas técnicas; portanto, o teste de resistência a drogas não pode ser realizado. Os três últimos são exames invasivos, mas são caros, exigem alta habilidade e têm o potencial de causar danos aos pacientes. Portanto, um método não invasivo, rápido e simultâneo para detecção de H. pylori e teste de resistência a drogas é muito importante para a erradicação eficiente do H. pylori na prática clínica . Este protocolo tem como objetivo apresentar um procedimento específico envolvendo o teste de cordas em combinação com a reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) para a rápida detecção da infecção por H. pylori e resistência a antibióticos. Ao contrário das culturas bacterianas, este método permite o diagnóstico fácil, rápido e não invasivo do estado de infecção por H. pylori e resistência aos medicamentos. Especificamente, usamos qPCR para detectar rea para infecção por H. pylori e mutações nos genes 23S rRNA e gyrA , que codificam resistência contra claritromicina e levofloxacina, respectivamente. Comparado às técnicas de cultivo rotineiramente utilizadas, este protocolo fornece uma técnica não invasiva, de baixo custo e economia de tempo para detectar a infecção por H. pylori e determinar sua resistência a antibióticos usando qPCR.

Introdução

H. pylori é uma bactéria gram-negativa em forma espiral, altamente móvel, que vive principalmente na região do piloro do estômago¹. É um patógeno comum que infecta cerca de 50% da população mundial². A maioria das pessoas com infecção por H. pylori não tem manifestações clínicas, e a maioria desenvolve diferentes doenças após vários anos de infecção, incluindo gastrite crônica, úlceras pépticas, úlceras gástricas e câncer gástrico³. Em vários estudos baseados em diferentes populações, a eficácia da eliminação do H. pylori na prevenção do câncer de estômago e lesões pré-cancerosas tem sido demonstrada ^4,5. Por isso, a Agência Internacional de Pesquisa em Câncer da Organização Mundial da Saúde (OMS) tem aconselhado a erradicação do H. pylori como medida preventiva⁶.

O uso de métodos não invasivos para identificar a infecção por H. pylori é um componente fundamental do tratamento para a maioria dos indivíduos com dispepsia assintomática. O teste respiratório da ureia (UBT), o teste do antígeno fecal do H. pylori (SAT) e o teste sorológico são técnicas não invasivas populares. Dentre estes, a UBT é o procedimento menos intrusivo e mais preciso disponível. A UBT usa urease, abundantemente presente em H. pylori, para hidrolisar ureia marcada isotopicamente em amônia e dióxido de carbono (13C ou 14C). Em contraste, o ensaio imunocromatográfico (ICA)⁷ é conveniente, simples e não invasivo para amostragem. No entanto, a acurácia do teste é afetada por vários fatores, como a qualidade da amostra de fezes, a temperatura e o intervalo entre a coleta da amostra e o teste. Outro teste baseado na resposta imune é o teste de anticorpos séricos contra H. pylori , que detecta anticorpos no soro do paciente. No entanto, esse teste não é adequado para análise pós-tratamento, uma vez que os anticorpos permanecem por muito tempo após a eliminação da bactéria⁸. Outra grande desvantagem é que esses métodos apenas diagnosticam a infecção por H. pylori e não permitem testes de resistência a drogas para orientar o tratamento baseado na sensibilidade.

Para métodos de teste invasivos, o tecido da biópsia gástrica precisa ser colhido por endoscopia e, em seguida, submetido à histologia, teste rápido da urease e cultura bacteriana. Esses métodos de teste também são muito limitados devido a vários fatores. Atualmente, essas técnicas são limitadas a pacientes idosos, pacientes com alto risco de doença pré-cancerosa ou maligna e pacientes que falharam na terapia de primeira linha para doença do refluxo gastroesofágico ou infecção por H. pylori9. Em segundo lugar, devido às características únicas de crescimento de H. pylori, a taxa de sucesso da cultura bacteriana atinge apenas 50%¹⁰. Assim, os métodos de detecção molecular oferecem uma nova esperança para superar as altas demandas dos métodos de detecção invasivos e orientar o tratamento baseado na sensibilidade. Dentre os métodos de detecção molecular, a PCR quantitativa evoluiu tremendamente nos últimos anos. A qPCR, ao contrário da PCR tradicional, não requer eletroforese em gel e quantifica com precisão o DNA/RNA em amostras adicionando primers e sondas na fase de recozimento. Kits de qPCR para a detecção de infecção por H. pylori e resistência a drogas estão agora disponíveis comercialmente. No entanto, cada método tem suas limitações; Portanto, o diagnóstico clínico e o tratamento de um paciente devem ser considerados em conjunto com seus sintomas, sinais, história, outros exames laboratoriais e resposta ao tratamento.

Atualmente, o principal método de tratamento das infecções por H.pylori é o uso de antibióticos, mas ultimamente, está se tornando cada vez mais difícil tratar essas infecções devido ao aumento da resistência aos antibióticos. Posteriormente, um declínio significativo na eficácia do tratamento do H. pylori foi observado em todo o mundo, tornando a erradicação do H. pylori um importante problema de saúde pública¹¹.

Claritromicina e levofloxacina são os dois antibióticos de amplo espectro usados para tratar infecções causadas por H.pylori, mas vários estudos relataram resistência generalizada contra essas duas drogas em isolados de H.pylori. A2143G, A2142G e A2142C são três das numerosas mutações pontuais encontradas no gene 23S rRNA de 2,9 kb que resultam em resistência à claritromicina, impedindo que o macrolídeo se ligue. Ao mesmo tempo, os loci de mutação do gene de resistência à levofloxacina estão localizados principalmente nos seis sítios de mutação (A260T, C261A, T261G, G271A, G271T, A272G) do gene gyrA ¹². A descoberta desses mecanismos de resistência baseados em mutações genéticas levou a uma mudança gradual na detecção do H. pylori através de estudos de base cultural para testes moleculares.

Em geral, há uma necessidade clínica urgente de um método diagnóstico não invasivo, eficaz e simultâneo para a detecção de infecções por H. pylori e resistência a drogas. Adotamos um teste combinado de cordas e o método qPCR para superar as dificuldades de amostragem e atingir o objetivo de detecção simultânea de infecção por H. pylori e resistência a drogas usando diferentes sondas de primer.

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Protocolo

O presente estudo foi conduzido de acordo com as considerações éticas estabelecidas pelo comitê de ética do Hospital Popular da Província de Guangdong, Southern Medical University, Guangzhou, China (Número de aprovação: KY-Q-2022-384-02). Foram incluídos pacientes na faixa etária de 18 a 60 anos. Pacientes em uso de antibióticos, medicamentos antibacterianos chineses, medicamentos como inibidores da bomba de prótons (IBP) ou antagonistas do receptor H 2, etc., dentro de₂ semanas antes do teste não foram incluídos neste estudo. Os pacientes que receberam tratamento contra H.pylori nos últimos 3 meses também foram excluídos deste estudo. Aqueles com problemas cardíacos, hepáticos, renais, neuropatia grave ou doença mental graves também não foram autorizados a participar deste estudo. Não foram incluídas no estudo gestantes e lactantes. Detalhes dos insumos (reagentes, produtos químicos, equipamentos e softwares) utilizados neste estudo são apresentados na Tabela de Materiais.

1. Teste de cordas para amostragem de líquido gástrico

1. Solicitar ao paciente que faça jejum durante a noite antes da coleta da amostra.
2. No dia seguinte, abra o kit de teste de corda, pegue a cápsula e segure o laço no final da corda.
3. Tape o fio na bochecha do paciente e peça-lhe para colocar a cápsula em sua língua perto da parte de trás da garganta e engoli-lo com um gole de água.
4. Permitir que a cápsula seja dissolvida no estômago do paciente, expondo assim o fio dentro da cápsula para absorver o muco gástrico.
5. Peça a um assistente treinado para puxar a corda cuidadosamente 1 h depois que o paciente engoliu a cápsula.
6. Cortar a extremidade inferior da corda (40 cm) embebida no líquido gástrico, colocá-la na solução de preservação da amostra de EET (Tris/soro fisiológico/EDTA) e, em seguida, enviá-la ao laboratório clínico à temperatura ambiente (RT) para a posterior detecção de H. pylori e determinação dos perfis de resistência aos antibióticos usando qPCR.

2. Extração de DNA

1. Coloque os tubos de coleta que transportam amostras em um rack de tubo de ensaio, devidamente rotulado, e vote-os por 10 s.
2. Vire a placa de 32 poços (kit de extração ou purificação de ácido nucleico) de cabeça para baixo várias vezes para ressuspender as esferas magnéticas. Depois de um vórtice curto por 10 s, remova cuidadosamente a vedação da folha de alumínio da placa.
3. Transferir 200 μL de líquido gástrico de cada amostra e DNA de H. pylori como controle positivo para os poços separados.
4. Coloque a placa de 32 poços no slot de amostra correspondente da máquina extratora de ácido nucleico para extração automática de DNA.
5. Após a extração e confirmação do DNA, iniciar o teste de resistência a antibióticos para claritromicina e levofloxacina através de qPCR nas amostras positivas.
6. Coloque o excesso de líquido gástrico e as amostras de DNA extraídas a -20 °C para armazenamento a longo prazo e uso futuro.
7. Execute todas essas etapas em um gabinete de biossegurança para evitar qualquer contaminação.

3. qPCR para detecção de H. pylori e resistência a antibióticos (claritromicina e levofloxacina)

1. Realizar qPCR para a detecção de H. pylori e as suspeitas de mutações de resistência a antibióticos em seu genoma.
   1. Descongelar a mistura de reação qPCR (kit de detecção de ácido nucleico H. pylori ) no gelo e misturá-la agitando e girando para evitar qualquer perda de reagente.
   2. Para cada amostra em uma placa de 32 poços, misturar 20 μL de mistura de reação de PCR (pré-mistura de reação de genotipagem [contendo a enzima Taq, desoxirribonucleosídeo trifosfato, tampão de reação e cloreto de magnésio], com primers ureA forward e reverse e uma sonda ureA ) e 5 μL do DNA extraído.
   3. Execute a placa qPCR de 32 poços na máquina qPCR. Programar o termociclador: a mistura reacional será primeiramente reagida sequencialmente a 42 °C e 95 °C (ambas para um ciclo) por 2 min cada; em seguida, 40 ciclos a 95 °C, desnaturação por 10 s e recozimento e extensão a 58 °C por 45 s.
   4. Ajuste a aquisição do sinal de fluorescência para FAM (H. pylori) e a aquisição de dados para o período de extensão da amplificação. Depois que a reação for concluída, salve os dados para análise de resultados futuros.
   5. Analise os dados usando um software específico para qPCR, pois o instrumento selecionará automaticamente os limiares basais.
   6. Se o resultado do teste para H. pylori for positivo, a máquina iniciará automaticamente o teste de resistência a medicamentos na amostra. Substitua o kit de reagentes por reagentes de detecção para mutações no gene 23S rRNA e no gene gyrA no kit H. Pylori (qPCR).
      NOTA: O kit de reagentes (reagentes de detecção para o gene 23S rRNA e mutações no gene gyrA no Helicobacter pylori [qPCR]) inclui a mistura de reação de PCR (premix de reação de genotipagem [contendo a enzima Taq, desoxirribonucleosídeo trifosfato, tampão de reação, cloreto de magnésio], primers e sondas). Todos os produtos de controle de qualidade negativo são água purificada e estéril. O produto de controle de qualidade positivo no kit de detecção de ácido nucleico de H. pylori é contas padrão de H. pylori inativadas (ATCC 43504). Os produtos de controle de qualidade positivos fortes e positivos fracos do kit (reagentes de detecção para o gene 23S rRNA e mutações no gene gyrA em H. pylori) são o DNA da cepa inativada de H. pylori contendo o gene alvo e o gene mutante. Da mesma forma, com base na situação real, todos os padrões diagnósticos, incluindo a presença de infecção por H. pylori ou resistência a drogas, são ajustados para TC ≤ 35 e têm uma curva típica em forma de S. A concentração do controle de qualidade fraco é de 1,0 x 10³ cópias/mL, enquanto a concentração do controle de qualidade forte é de 1,0 x 10⁸ cópias/mL.

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Resultados

Detecção de infecção por H. pylori e resistência a antibióticos em fluido gástrico por qPCR
Realizamos qPCR para a detecção da infecção por H. pylori amplificando o gene ureA e determinamos seu perfil de resistência a antibióticos visando mutações pontuais no gene 23S rRNA e no gene gyrA (Tabela 1). Os valores de CT de controle de qualidade nos três grupos de experimentos de qPCR estavam dentro da faixa recomendada, indicando que as ...

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Discussão

A detecção do H. pylori pode ser realizada por métodos invasivos e não invasivos¹³. Técnicas invasivas comumente utilizadas, como histopatologia, teste rápido da urease, reação em cadeia da polimerase (PCR) e cultura bacteriana, requerem endoscopia e biópsia. Dentre os procedimentos não invasivos, recomendam-se testes sorológicos, testes respiratórios de ureia e ensaios imunoenzimáticos (ELISA)¹⁴. Enquanto os métodos não invasivos são fáceis de exe...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
23S rRNA and gyrA gene point mutations detection kit (PCR-Fluorescence Probing)	Hongmed Infagen		Detection of Helicobacter pylori resistance to clarithromycin and levofloxacin
ABI 7500 fluorescence quantitative PCR machine	Thermo Fisher Scientific	SEDA 20163220767	Fluorescent quantitative PCR amplification
ABI 7500 software	Thermo Fisher Scientific		Data Analysis
BSC-1500IIA2-X	BIOBASE	SEDA 20143222263	Biosafety cabinet
DNA extraction kit	Daan Gene
E-Centrifuge	WEALTEC		Centrifuge the residual liquid off the wall of the tube.
H. Pylori DNA detection kit (PCR-Fluorescence Probing)	Hongmed Infagen		Testing for H. pylori infection
Stream SP96 automated nucleic acid extractor	Daan Gene	SEDA 20140104	For DNA extraction
String test kit	Hongmed Infagen		It contains a capsule attached to a string, scissors, cotton swab, and sample preservation tube
Ultra-low temperature freezers (DW-YL450)	MELING	SEDA 20172220091	-20 °C for storing reagents
Vortex-5	Kylin-bell		For mixing reagent