Geração de Organoides Renais em Suspensão a partir de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas

Resumo

Este protocolo apresenta um método abrangente e eficiente para a produção de organoides renais a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) utilizando condições de cultura em suspensão. A ênfase primária deste estudo reside na determinação da densidade celular inicial e da concentração do agonista WNT, beneficiando assim os investigadores interessados na pesquisa de organoides renais.

Resumo

Os organoides renais podem ser gerados a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) através de várias abordagens. Esses organoides são uma grande promessa para modelagem de doenças, triagem de drogas e potenciais aplicações terapêuticas. Este artigo apresenta um procedimento passo a passo para a criação de organoides renais a partir de iPSCs, partindo da estria primitiva posterior (SP) até o mesoderma intermediário (IM). A abordagem baseia-se no meio APEL 2, que é um meio definido e livre de componentes animais. É suplementado com uma alta concentração de agonista WNT (CHIR99021) por uma duração de 4 dias, seguido por fator de crescimento de fibroblastos 9 (FGF9)/heparina e uma baixa concentração de CHIR99021 por mais 3 dias. Durante esse processo, ênfase é dada à seleção da densidade celular e da concentração CHIR99021 ideais no início das iPSCs, pois esses fatores são críticos para o sucesso da geração de organoides renais. Um aspecto importante desse protocolo é a cultura da suspensão em placa de baixa aderência, permitindo que o MI evolua gradualmente para estruturas néfrons, englobando estruturas glomerulares, tubulares proximais e tubulares distais, todas apresentadas em um formato visualmente compreensível. Em geral, este protocolo detalhado oferece uma técnica eficiente e específica para produzir organoides renais a partir de diversas iPSCs, garantindo resultados bem-sucedidos e consistentes.

Introdução

O rim desempenha um papel crítico na manutenção da homeostase fisiológica, dependendo de sua unidade funcional. Néfrons, que excretam produtos residuais, podem regular a composição dos fluidos corporais. A doença renal crônica (DRC), causada por mutações hereditárias ou outros fatores de alto risco, eventualmente evoluirá para doença renal terminal (DRCT)^1,2. A DRCT é aparentemente devida à limitada capacidade de regeneração dos néfrons. Assim, a terapia renal substitutiva é necessária. A diferenciação dirigida de iPSCs humanas permite a geração in vitro de organoides renais 3D específicos para o paci....

Protocolo

As iPSCs utilizadas no presente estudo foram obtidas de fonte comercial. As células foram mantidas com meio mTeSR em placas revestidas com matriz de membrana basal comercialmente disponíveis (ver Tabela de Materiais). A Tabela 1 contém todas as composições dos meios utilizados no estudo.

1. Plating iPSCs para diferenciação e indução de estria primitiva posterior (PS)

1. Lave as iPSCs na placa de 6 poços revestida com matriz de membrana com 2 mL de DPBS. Aspirar o DPBS usando uma pipeta.
2. Adicionar 1 ml da solução de descolamento celular comercialmente disponível (ver

Discussão

Um protocolo detalhado foi descrito para a geração de organoides renais a partir de iPSCs, envolvendo pequenas modificações no meio basal, densidade celular inicial e concentração de CHIR99021. Em vários experimentos, os fatores críticos para o sucesso da geração de organoides renais foram a diferenciação inicial do mesoderma intermediário (IM) e o estado celular no Dia 7. Além disso, diferentes linhagens de iPSC exibiram variações na proliferação celular e potencial de diferenciação, resultando em de.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well Cell Culture Plate, Flat-Bottom	NEST	Cat #701003
Accutase	STEMCELL Technologies	Cat #o7920
Antibodies
Benzyl alcohol	Sigma-Aldrich	Cat #100-51-6
Benzyl benzoate	Sigma-Aldrich	Cat #120-51-4
Biological Safety Cabinet	Haier	Cat #HR40  A2
Biotin anti-human LTL (1:300)	Vector Laboratories	Cat #B-1325
Blood mononuclear cells hiPS-B1 (iPSc, female)	N/A	N/A
Carbon dioxide level shaker	HAMANY	Cat #C0-06UC6
Chemicals, peptides, and recombinant proteins
CHIR99021 (Wnt pathway activator)	STEMCELL Technologies	Cat #72054
Costar Multiple 6 Well Cell Culture Plate	Corning	Cat #3516
Costar Ultra-Low Attachment 6 Well Plate	Corning	Cat #3471
CryoStor CS10	STEMCELL Technologies	Cat #07930
DAPI stain Solution	Coolaber	Cat #SL7102
Dextran, Alexa Fluor 647	Thermo SCIENTIFIC	Cat #D22914
DMEM/F-12 HEPES-free	Servicebio	Cat #G4610
Donkey Anti-Sheep IgG H&L (Alexa Fluor 647)	Abcam	Cat #ab150179
Donkey serum stoste	Meilunbio	Cat #MB4516-1
D-PBS (without calcium, magnesium, phenol red)	Solarbio Life Science	Cat #D1040
Dry Bath Incubator	Shanghai Jingxin	Cat #JX-10
Dylight 488-Goat Anti-Mouse IgG (1:400)	Earthox	Cat #E032210
Dylight 488-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400)	Earthox	Cat #E032220
Dylight 549-Goat Anti-Mouse IgG (1:400)	Earthox	Cat #E032310
Dylight 549-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400)	Earthox	Cat #E032320
Dylight 649-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400)	Earthox	Cat #E032620
Experimental models: Cell Lines
Forma Steri-Cycle CO2 Incubator	Thermo SCIENTIFIC	Cat #370
Geltre LDEV-Free	Gibco	Cat #A1413202
Glass Bottom Culture Dishes	NEST	Cat #801002
Goat anti-human CUBN (1:300)	Santa Cruz Biotechnology	Cat #sc-20607
Heparin Solution (Cell culture supplement)	STEMCELL Technologies	Cat #07980
Human Recombinant FGF-9	STEMCELL Technologies	Cat #78161
Inverted Microscope	OLYMPUS	Cat #CKX53
Laser Scanning Confocal Microscope	OLYMPUS	Cat #FV3000
Methyl cellulose	Sigma-Aldrich	Cat #M7027
Micro Centrifuge	HENGNUO	Cat #2-4B
Mouse anti-human CD31 (1:300)	BD Biosciences	Cat #555444
Mouse anti-human ECAD (1:300)	BD Biosciences	Cat #610182
Mouse anti-human Integrin beta 1 (1:300)	Abcam	Cat #ab30394
Mouse anti-human MEIS 1/2/3 (1:300)	Thermo SCIENTIFIC	Cat #39795
Mowiol 4-88 (Polyvinylalcohol 4-88)	Sigma-Aldrich	Cat #81381
mTeSR1 5X Supplement	STEMCELL Technologies	Cat #85852
mTeSR1 Basal Medium	STEMCELL Technologies	Cat #85851
Nunc CryoTube Vials	Thermo SCIENTIFIC	Cat #377267
Others
Rabbit anti-human GATA3 (1:300)	Cell Signaling Technology	Cat #5852S
Rabbit anti-human LRP2 (1:300)	Sapphire Bioscience	Cat #NBP2-39033
Rabbit anti-human Synaptopodin (1:300)	Abcam	Cat #ab224491
Rabbit anti-human WT1 (1:300)	Abcam	Cat #ab89901
Rabbit anti-mouse PDGFR (1:300)	Abcam	Cat #ab32570
Recombinant Human Serum Albumin (rHSA)	YEASEN	Cat #20901ES03
Sheep anti-human NPHS1 (1:300)	R&D Systems	Cat #AF4269
STEMdiff APEL 2 Medium	STEMCELL Technologies	Cat #05275
Streptavidin Cy3 (1:400)	Gene Tex	Cat #GTX85902
Versene (1X)	Gibco	Cat #15040066
Y-27632 (Dihydrochloride)	STEMCELL Technologies	Cat #72304