Desenvolvimento e caracterização de hidrogéis de matriz extracelular pulmonar decelularizada

Resumo

O protocolo elucida duas metodologias distintas de decelularização aplicadas a tecidos pulmonares bovinos nativos, fornecendo um relato abrangente de suas respectivas caracterizações.

Resumo

O uso de hidrogéis derivados da matriz extracelular (MEC) na engenharia de tecidos tem se tornado cada vez mais popular, pois podem mimetizar o ambiente natural das células in vitro. No entanto, manter o conteúdo bioquímico nativo da MEC, alcançar estabilidade mecânica e compreender o impacto do processo de decelularização nas propriedades mecânicas dos hidrogéis da MEC são um desafio. Neste trabalho, foi descrito um pipeline para a descelularização do tecido pulmonar bovino utilizando dois protocolos diferentes, caracterização a jusante da eficácia da descelularização, fabricação de hidrogéis de MEC pulmonar decelularizada reconstituídos e avaliação de suas propriedades mecânicas e citocompatibilidade. A descelularização do pulmão bovino foi realizada por método físico (ciclos de congelamento-descongelamento) ou químico (à base de detergente). A coloração de hematoxilina e eosina foi realizada para validar a decelularização e retenção dos principais componentes da MEC. Para a avaliação do conteúdo residual de colágeno e glicosaminoglicano sulfatado (sGAG) nas amostras decelularizadas, foram empregadas as técnicas de coloração Sirius red e Alcian blue, respectivamente. As propriedades mecânicas dos hidrogéis de MEC pulmonar decelularizado foram caracterizadas por reologia oscilatória. Os resultados sugerem que hidrogéis de pulmão bovino decelularizados podem fornecer uma alternativa organotípica confiável aos produtos comerciais de MEC por reter a maioria dos componentes nativos da MEC. Além disso, esses achados revelam que o método de descelularização de escolha afeta significativamente a cinética de gelificação, bem como a rigidez e as propriedades viscoelásticas dos hidrogéis resultantes.

Introdução

As condições convencionais de cultivo de monocamadas não oferecem uma representação fiel dos microambientes de tecidos nativos e carecem da capacidade de fornecer um arcabouço tridimensional (3D) com ligantes instrutivos que possibilitem interações célula-matriz e célula-célula¹. A composição da matriz extracelular (MEC) e as propriedades mecânicas são altamente tecido-específicas, tempo-dependentes e sofrem alterações em condições patológicas. Portanto, há necessidade de modelos teciduais 3D biomiméticos que permitam a sintonia de tais características, a modulação do comportamento celular e o alcance da funcionalidade tecidual desejada. Biomateriais nativos derivados da MEC chamam muita atenção na engenharia tecidual com a capacidade de usar diretamente a MEC tecido-específica 1,2,3,4,5. Os portadores baseados em MEC têm sido usados em muitas aplicações, desde a regeneração tecidual até o desenvolvimento de modelos de doenças. São utilizados como arcabouços de biomateriais injetáveis ou implantáveis ^4,5, em aplicações de triagem de fármacos ^6,7, no desenvolvimento de materiais indutores de crescimento celular ^8,9,10, como biotintas 11,12,13, em microfluídica¹⁴ e em modelos de tecidos cancerígenos 15,16,17^,18,19.

A descelularização de tecidos e órgãos é uma abordagem popular para gerar arcabouços que mimetizam a MEC tecido-específica. A reconstituição de tecidos e órgãos decelularizados em hidrogéis permite a incorporação de células em modelos de tecidos 3D biomiméticos20. As técnicas de descelularização concentram-se principalmente na eliminação de componentes celulares, mantendo a composição da MEC. Métodos físicos como ciclos de congelamento-descongelamento ou processos químicos como o tratamento com Triton-X-100 são comumente aplicados para descelularizar tecidos. Além disso, o tratamento com DNase é preferido para remover o DNA residual para minimizar as respostas imunológicas na inclusão celular. É fundamental obter a máxima remoção celular e o mínimo comprometimento da MEC para otimizar os procedimentos de descelularização²¹. Além desses aspectos, a caracterização das propriedades bioquímicas e mecânicas dos scaffolds reconstituídos, incluindo viscoelasticidade e rigidez, é crucial para o aprimoramento de modelos teciduais 3D projetados derivados de matrizes nativas²⁰.

A MEC órgão-específica na engenharia do tecido pulmonar permite mimetizar o microambiente pulmonar para modelar processos de desenvolvimento, homeostáticos ou patológicos in vitro e testar terapêuticas em um ambiente fisiomimético 20,22,23. Estudos prévios demonstraram a decelularização do tecido pulmonar de várias espécies, como ratos, suínos e humanos, mas esses métodos ainda não foram adaptados para espécies menos utilizadas, como os bovinos. Uma melhor compreensão dos parâmetros do processo de descelularização e como eles afetam os arcabouços resultantes da MEC reconstituída em relação à composição bioquímica e propriedades mecânicas permitirá uma melhor sintonia desses aspectos e abrirá caminho para modelos teciduais mais confiáveis em saúde e doença. Neste estudo, a decelularização pulmonar bovina com dois métodos distintos, ciclos de congelamento-descongelamento e tratamento com Triton-X-100, é explicitamente descrita e seguida por análises bioquímicas e mecânicas de hidrogéis de MEC pulmonar decelularizada (dECM). Os resultados revelam que ambos os métodos produzem efetiva descelularização e retenção dos ligantes da MEC. Notavelmente, a escolha do método altera significativamente a rigidez e viscoelasticidade resultantes dos hidrogéis reconstituídos. Hidrogéis derivados da dECM bovina demonstram notáveis analogias bioquímicas com a matriz extracelular do pulmão humano e exibem características confiáveis de gelificação térmica²⁰. Como descrito anteriormente, ambos os métodos são adequados para a cultura 3D de células de câncer de pulmão, células epiteliais brônquicas saudáveis e organoides pulmonares derivados do paciente²⁰.

Protocolo

Pulmões nativos frescos de doadores bovinos jovens (1-2 anos de idade) foram obtidos de um abatedouro local e transportados em um recipiente plástico selado sobre gelo para o laboratório. O sacrifício dos animais é realizado para consumo geral de carne (pulmões descartados como resíduos) e não tem relação ou é devido ao estudo. Confirmamos que o matadouro cumpre as leis e regulamentos nacionais de sacrifício de animais. Além disso, confirmamos que utilizamos apenas resíduos e que o projeto de pesquisa não teve efeito sobre o número de animais sacrificados.

1. Colheita de órgãos e preparação de tecidos

1. Conservar os tecidos pulmonares bovinos recém-obtidos a -80 °C até à experiência.
2. No dia do experimento, aguarde o descongelamento dos tecidos pulmonares congelados à temperatura ambiente.
3. Dissecar os tecidos com bisturis estéreis e tesouras para remover a traqueia e as vias aéreas cartilaginosas e picar em pequenos pedaços (5 mm³).
4. Lavar bem com água ultrapura contendo penicilina/estreptomicina a 2% (P/S) pelo menos 3x.

2. Descelularização dos tecidos

NOTA: Tecidos pulmonares bovinos nativos foram decelularizados usando dois protocolos distintos.

1. Método de congelamento-descongelamento
   1. Preparar amostras de tecido de acordo com o passo 1. Imergir os tecidos picados em solução de iodo a 2% em água destilada estéril (dH₂O) por 1 min. Realizar duas lavagens consecutivas em dH₂O estéril.
   2. Transfira pedaços de tecido picados para um tubo de 50 mL até o nível de 15 mL e implemente cinco ciclos manuais de congelamento-descongelamento usando um recipiente portátil de nitrogênio líquido. Encha os tubos até o topo com dH₂O estéril e congele os tubos por 2 min em nitrogênio líquido. Após 2 min, transfira-os imediatamente para banho-maria a 37 °C por 10 min. Isso constitui 1 ciclo de congelamento-descongelamento.
   3. Incubar as amostras com 30 ml de solução de DNase (10 U/ml) em tampão MgCl₂ 10 mM (pH 7,5) durante 1 h a 37 °C sob agitação constante a 100 rpm.
   4. Continue com uma lavagem extensa com dH₂O estéril por 3 dias sob agitação constante a 100 rpm, com reposição da solução a cada 24 h.
   5. Realizar liofilização e criomoagem da seguinte forma²⁰: Congelar as amostras de dECM úmidas a -80 °C por 24 h. Transfira as amostras congeladas para um liofilizador e opere em modo de secagem sob vácuo por 3 a 4 dias até secar completamente. Após a conclusão da liofilização, realizar a moagem das amostras em forma de pó fino usando um aparelho de moagem e gelo seco.
      NOTA: Este estado de pó fino é considerado necessário devido às suas propriedades de solubilidade melhoradas durante as fases subsequentes do processo de digestão.
2. Método Triton-X-100
   1. Preparar amostras de tecido de acordo com o passo 1. Tratar os tecidos pulmonares com Triton-X-100 a 1% durante 3 dias sob rotação suave a 4 °C. Solução de troca a cada 24 h.
   2. Incubar as amostras com solução de DNase (10U/mL) em tampão MgCl₂ 10 mM (pH 7,5) por 1 h a 37 °C sob agitação constante.
   3. Continue com uma lavagem extensa com dH₂O estéril por 3 dias sob rotação suave, com reposição da solução a cada 24 h.
   4. Realizar liofilização seguida de criomoagem conforme descrito no passo 2.1.

3. Digestão de pepsina

1. Digest amostras de dECM em pó na concentração de 15 mg/mL (p/v) em solução de pepsina (1 mg/mL de pepsina em HCl 0,01 M, pH 2). Realizar o processo de digestão da amostra à temperatura ambiente sob agitação constante durante 48 h e manter o pH da solução frequentemente para uma digestão eficaz.
2. Transfira os digestores para um tubo e centrifuja a 5000 x g por 10 min.
3. Coletar o sobrenadante e neutralizá-los e tamponá-los às condições fisiológicas (pH 7, 1x tampão fosfato salino (PBS)) através da adição de NaOH 5M e PBS 10x.
   OBS: Sugere-se o uso de soluções alcalinas concentradas para ajuste do pH do digesto ácido, pois esta abordagem evita a expansão volêmica indesejada que poderia impactar negativamente a gelificação nas etapas subsequentes.
4. Conservar os digestores pré-gel a -20 °C para estudos adicionais.

4. Coloração histológica

1. Fixar uma pequena porção (5 mm³) de amostra de tecido decelularizado em 1 ml de solução de formaldeído a 3,7% a 4 °C durante a noite.
2. Incubar os tecidos em tubos contendo 1 ml de solução de sacarose a 30% em PBS durante 12 h a 4 °C sobre uma rocha estável.
3. Para incorporar tecidos no composto de temperatura de corte ideal (OCT), despeje 1 mL de OCT em um criomold, coloque o tecido no meio do criomolde e, em seguida, despeje 2 mL de OCT sobre o tecido.
4. Coloque criomoldes contendo tecidos sobre gelo seco e congele rapidamente usando nitrogênio líquido. As amostras ficam prontas quando a OCT fica toda branca, o que geralmente leva 3 min. Conservar os tecidos embebidos em OCT a -20 °C até à utilização.
5. Obter secções de 10 μm no criostato a -25 °C numa lâmina de vidro revestida com poli-L-lisina e transferir a lâmina para a temperatura ambiente para permitir que a secção de tecido derreta na lâmina. Conservar as lâminas a -20 °C até à utilização.
6. Para confirmar a ausência de núcleos após a descelularização, realizar a coloração de Hematoxilina e Eosina (H&E) conforme descrito a seguir.
   1. Incubar lâminas à temperatura ambiente durante 10 min. Imergir as lâminas em PBS e corá-las com 50 mL de solução de hematoxilina pronta para uso em um frasco de coloração por 3 min, seguido de uma lavagem de 3 min com água da torneira.
   2. Imergir as lâminas em etanol 95% e corar com 50 mL de solução alcoólica de Eosina a 0,5% em um frasco corante por 45 s.
7. Realizar coloração vermelho Sirius para mostrar a retenção do conteúdo de colágeno após a descelularização.
   1. Hidratar as lâminas com PBS e imergir em 50 mL de Sirius red 0,1% em solução aquosa saturada de ácido pícrico em um frasco corante por 1 h.
   2. Enxaguar as lâminas em solução de ácido acético a 0,5% por 5 s e desidratar todas as lâminas mergulhando-as sequencialmente em etanol 70%, 95% e 100% por 1 min cada.
8. Para analisar o conteúdo de sGAG em amostras de tecido, realize a coloração Alcian blue conforme descrito abaixo.
   1. Imergir as lâminas em 50 mL de azul de Alcian a 1% em solução de ácido acético a 3% (pH 2,5) em um frasco de coloração por 30 min. Lave as lâminas com água corrente da torneira por 2 min.
   2. Desidrate todas as lâminas mergulhando-as em etanol 70%, 95% e 100% sequencialmente por 1 min cada.
9. Adicionar 0,1 mL de meio de montagem sobre as amostras e visualizar usando microscopia de luz usando aumento de 10x.

5. Caracterização mecânica

1. Implementar medidas de reologia oscilatória usando um reômetro com geometria de placa paralela.
2. Deite 250 μL de solução de pré-gel mantida em gelo sobre uma placa inferior pré-resfriada (4 °C) para evitar a gelificação rápida.
3. Abaixe a placa paralela de 20 mm até que a solução pré-gel forme um disco com uma largura de intervalo de 1 mm entre as duas placas.
4. Inicie a medição imediatamente. Meça os módulos de armazenamento e perda ao longo do tempo com uma frequência fixa e deformação enquanto aquece a placa inferior a 37 °C por 30 minutos para observar a cinética de gelificação. Use uma frequência fixa de 0,5 Hz e 0,1% de tensão.
5. Execute um teste de recuperação de fluência depois que o valor do módulo de armazenamento parar de aumentar e atingir um platô.
6. Aplicar tensão de cisalhamento de 1 Pa no hidrogel por 15 min, medir a deformação, descarregar a amostra da tensão e registrar a mudança no valor da deformação por 15 min.
7. Desenhe um gráfico tensão versus tempo para mostrar o comportamento de relaxamento do estresse. Repita as medições para três digestores dECM diferentes como réplicas.

Resultados

Descelularização
A descelularização do tecido pulmonar bovino para produzir hidrogéis de dECM que recapitulariam o microambiente pulmonar nativo foi obtida por métodos físicos (congelamento-descongelamento) e químicos (Triton-X-100). Após dissecção, pedaços de tecido foram lavados em antibióticos contendo dH₂O para remover patógenos que podem afetar posteriormente a esterilidade dos hidrogéis de dECM. Um total de cinco ciclos alternados entre nitrogênio líquido a 37 °C em ...

Discussão

Os hidrogéis derivados de órgãos tornaram-se modelos promissores que recapitulam a MEC tecidual nativa e mimetizam a função celular organotípica. Embora a MEC pulmonar decelularizada tenha sido frequentemente usada em engenharia de tecidos, uma caracterização completa da composição do biomaterial e das propriedades mecânicas beneficiará uma melhor compreensão de como as interações célula-MEC podem ser moduladas para modelar processos biológicos durante a homeostase ou doença. Particularmente, a avaliaç...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absolute ethanol	ISOLAB	64-17-5
Acetic acid	ISOLAB	64-19-7
Alcian blue solution	Sigma-Aldrich	B8438
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	DN25
Discovery HR-2 rheometer	TA Instruments
Entellan mounting medium	Merck	107960
Eosin solution	Bright-slide	2.BS01-105-1000
Formaldehyde	Electron Microscopy Sciences	50-980-485
Hydrochloric acid	Merck	100317
Iodine	Sigma-Aldrich	3002
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	7786-30-3
Mayer's haematoxylin staining solution	Merck	2.BS01-103-1000
O.C.T compound	Tissue-Tek	4583
Penicillin/Streptomycin	Biowest	L0018-100
Pepsin from porcine gastric mucosa	Sigma-Aldrich	P6887
Picric acid	Polysciences	88-89-1
Sirius Red	Polysciences	09400-25
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Triton-X-100	Merck	112298