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Resumo

Apresenta-se um protocolo de triagem de drogas de alto rendimento para melhorar o sono por meio do monitoramento do comportamento do sono de moscas-das-frutas em um modelo idoso de Drosophila .

Resumo

O sono, um componente essencial da saúde e do bem-estar geral, frequentemente apresenta desafios para indivíduos mais velhos que frequentemente experimentam distúrbios do sono caracterizados por duração do sono encurtada e padrões fragmentados. Essas interrupções do sono também se correlacionam com um aumento do risco de várias doenças em idosos, incluindo diabetes, doenças cardiovasculares e distúrbios psicológicos. Infelizmente, as drogas existentes para distúrbios do sono estão associadas a efeitos colaterais significativos, como comprometimento cognitivo e dependência. Consequentemente, o desenvolvimento de medicamentos novos, mais seguros e mais eficazes para distúrbios do sono é urgentemente necessário. No entanto, o alto custo e a longa duração experimental dos métodos atuais de triagem de drogas permanecem como fatores limitantes.

Este protocolo descreve um método de triagem custo-efetivo e de alto rendimento que utiliza Drosophila melanogaster, uma espécie com um mecanismo de regulação do sono altamente conservado em comparação com mamíferos, tornando-se um modelo ideal para o estudo de distúrbios do sono em idosos. Ao administrar vários pequenos compostos a moscas envelhecidas, podemos avaliar seus efeitos sobre os distúrbios do sono. Os comportamentos de sono dessas moscas são registrados usando um dispositivo de monitoramento infravermelho e analisados com o pacote de dados de código aberto Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program 2020 (SCAMP2020). Esse protocolo oferece uma abordagem de rastreamento eficiente e de baixo custo, reprodutível e eficiente para a regulação do sono. As moscas-das-frutas, devido ao seu curto ciclo de vida, baixo custo de criação e facilidade de manuseio, servem como excelentes objetos para este método. A título de ilustração, a Reserpina, uma das drogas testadas, demonstrou a capacidade de promover a duração do sono em moscas idosas, destacando a eficácia desse protocolo.

Introdução

O sono, um dos comportamentos essenciais necessários para a sobrevivência humana, é caracterizado por dois estados principais: sono de movimento rápido dos olhos (REM) e sono NREM (non-rapid eye movement)1. O sono NREM é composto por três estágios: N1 (transição entre vigília e sono), N2 (sono leve) e N3 (sono profundo, sono de ondas lentas), representando a progressão da vigília para o sono profundo1. O sono desempenha um papel crucial na saúde física e mental2. No entanto, o envelhecimento reduz a duração total do sono, a eficiência do sono, a porcentagem de sono de ondas lentas e a porcentagem de sono REM em adultos3. Indivíduos mais velhos tendem a passar mais tempo em sono leve em comparação com o sono de ondas lentas, tornando-os mais sensíveis a despertares noturnos. À medida que o número de despertares aumenta, o tempo médio de sono diminui, resultando em um padrão de sono fragmentado nos idosos, o que pode estar associado à excitação excessiva dos neurônios Hcrt em camundongos4. Além disso, declínios nos mecanismos circadianos relacionados à idade contribuem para uma mudança mais precoce na duração do sono 5,6. Esses fatores, associados a doenças físicas, estresse psicológico, fatores ambientais e uso de medicamentos, tornam os idosos mais suscetíveis a distúrbios do sono, como insônia, distúrbio comportamental do sono REM, narcolepsia, movimentos periódicos das pernas, síndrome das pernas inquietas e distúrbios respiratórios do sono 7,8.

Estudos epidemiológicos têm demonstrado que os distúrbios do sono estão intimamente ligados a doenças crônicas em idosos9, incluindo depressão 10, doenças cardiovasculares11 e demência12. A abordagem dos distúrbios do sono desempenha um papel crucial na melhoria e tratamento de doenças crônicas e na melhoria da qualidade de vida dos idosos. Atualmente, os pacientes dependem principalmente de drogas como benzodiazepínicos, não-benzodiazepínicos e agonistas dos receptores de melatonina para melhorar a qualidade do sono13. No entanto, os benzodiazepínicos podem levar à diminuição dos receptores e dependência após o uso prolongado, causando sintomas graves de abstinência após a descontinuação14,15. Drogas não benzodiazepínicas também apresentam riscos, incluindo demência16, fraturas17 e câncer18. O agonista comumente usado do receptor de melatonina, o ramelteon, reduz a latência do sono, mas não aumenta a duração do sono e tem preocupações relacionadas à função hepática devido à extensa eliminação de primeira passagem19. A agomelatina, um agonista do receptor de melatonina e antagonista do receptor de serotonina, melhora a insônia relacionada à depressão, mas também representa um risco de dano hepático20. Consequentemente, há uma necessidade urgente de medicamentos mais seguros para tratar ou aliviar distúrbios do sono. No entanto, as estratégias atuais de triagem de fármacos, baseadas em experimentos moleculares e celulares combinados com sistemas automatizados e análises computacionais, são caras e demoradas21. Estratégias de planejamento de fármacos baseadas na estrutura, baseadas na estrutura e propriedades do receptor, requerem uma compreensão clara da estrutura tridimensional do receptor e carecem de capacidade preditiva para os efeitos do fármaco22.

Em 2000, com base nos critérios de sono propostos por Campbell e Tobler em 198423, pesquisadores estabeleceram modelos animais simples para estudar o sono 24, incluindo Drosophila melanogaster, que exibia estados semelhantes aos do sono25,26. Apesar das diferenças anatômicas entre Drosophila e humanos, muitos componentes neuroquímicos e vias de sinalização que regulam o sono em Drosophila são conservados no sono de mamíferos, facilitando o estudo de doenças neurológicas humanas27,28. Drosophila também é extensivamente utilizada em estudos do ritmo circadiano, apesar das diferenças nos osciladores centrais entre moscas e mamíferos 29,30,31. Portanto, Drosophila serve como um organismo modelo valioso para estudar o comportamento do sono e conduzir a triagem de drogas relacionadas ao sono.

Este estudo propõe uma abordagem baseada em fenótipo simples e custo-efetiva para a triagem de drogas de pequenas moléculas para tratar distúrbios do sono usando moscas envelhecidas. A regulação do sono em Drosophila é altamente conservada25, e o declínio do sono observado com a idade pode ser reversível através da administração de medicamentos. Assim, esse método de rastreamento baseado no fenótipo do sono pode refletir intuitivamente a eficácia da droga. Alimentamos as moscas com uma mistura do fármaco investigado com a alimentação, monitoramos e registramos o comportamento do sono usando o Drosophila Activity Monitor (DAM)32 e analisamos os dados adquiridos usando o pacote de dados de SCAMP2020 de código aberto no MATLAB (Figura 1). A análise estatística é realizada por meio de softwares estatísticos e gráficos (ver Tabela de Materiais). Como exemplo, demonstramos a efetividade desse protocolo apresentando dados experimentais sobre a Reserpina, uma pequena molécula inibidora do transportador vesicular de monoamina que aumenta o sono33. Este protocolo fornece uma abordagem valiosa para identificar medicamentos para o tratamento de problemas de sono relacionados à idade.

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Protocolo

Este protocolo usa as moscas w1118 de 30 dias do Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC_3605, ver Tabela de Materiais).

1. Preparação das moscas-das-frutas envelhecidas

  1. Preparo de alimentos
    1. Prepare o meio de cultura padrão de amido de milho misturando 50 g/L de flocos de milho, 110 g/L de açúcar, 5 g/L de ágar e 25 g/L de levedura. Aqueça os flocos de milho e o fermento com água para gelatinizar e, em seguida, dissolva totalmente todas as substâncias.
    2. Quando o meio arrefecer a 50-60 °C, adicionar 6 mL/L de ácido propiônico e embalá-los imediatamente em frascos de cultura.
  2. Criação de moscas e preparação de moscas envelhecidas
    1. Criar a mosca cepa w1118em frascos contendo um meio de cultura padrão de amido de milho e colocar os frascos em uma incubadora de temperatura constante a 25° C, 68% de umidade relativa, condições de iluminação de 500-1000 lux e um ciclo claro: escuro de 12 h:12 h.
    2. Transfira as moscas para um novo frasco a cada 7 dias de acordo com o ciclo de crescimento das moscas, mantendo a idade dos indivíduos no mesmo frasco consistente.
    3. Recolha o novo lote de moscas que eclodem da garrafa original 3 dias depois de transferi-las e coloque-as em uma nova garrafa. Seguindo o princípio de trocar o frasco a cada 7 dias, eles serão cultivados até por volta dos 30 dias de idade.

2. Preparação de alimentos medicinais e tubos de vidro para monitorização

OBS: O procedimento de confecção do tubo de vidro segue o trabalho de Jin et al., com modificações34.

  1. Limpeza e secagem de tubos de vidro
    1. Coloque o tubo de vidro (5 mm de diâmetro x 65 mm de comprimento, ver Tabela de Materiais) em um copo grande, mergulhe-o e ferva-o com água destilada dupla por 20 min. Repita 3 vezes.
    2. Retire e embrulhe o tubo de vidro, lave o interior com água bidestilada 3-5 vezes e coloque-o em um forno para secagem.
  2. Preparo de meio de cultura simples (100 mL)
    1. Dissolva 1,5 g de ágar e 5 g de sacarose em água bidestilada, aqueça e concentre até 100 mL.
    2. Adicionar 600 μL de ácido propiónico quando o meio arrefecer a cerca de 70 °C, evitando que se solidifique em banho-maria a temperatura constante.
    3. Adicionar aproximadamente 4 mL de meio simples e Reserpina (ver Tabela de Materiais) em um copo pequeno de 10 mL até que o medicamento atinja 20 μM ou 50 μM. Adicionar dimetilsulfóxido (DMSO) à concentração de 0,2% no grupo controle negativo.
  3. Preparação dos tubos de vidro contendo medicamento
    1. Para facilitar o fluxo do meio, insira cuidadosamente um comprimento adequado de tubo de vidro em um copo pequeno. O meio entrará naturalmente no tubo de vidro devido à pressão atmosférica.
    2. Puxe o tubo de vidro quando o meio de cultura estiver completamente solidificado e limpe a parede externa para obter um tubo de vidro de monitoramento com um meio de cultura contendo drogas em uma extremidade.
    3. Aqueça a parafina sólida em um copo até derreter a 70 °C, coloque a extremidade do tubo de vidro perto do alimento no líquido de parafina por cerca de 5 mm e remova-o rapidamente. Espere a parafina solidificar para selar a extremidade alimentar do tubo de vidro.

3. Planejamento experimental e tratamento de moscas

  1. Planejar o experimento para o tratamento com moscas segue a Tabela 1.

4. Montagem de Drosophila e monitoramento do sono

OBS: O procedimento para montagem de Drosophila segue o trabalho de Jin et al.34 com modificações.

  1. Anestesiar as moscas com gás CO2 , colocá-las em tubos de vidro selados em parafina (um por tubo) e bloquear a extremidade não alimentar com uma bola de algodão absorvente para evitar que as moscas escapem e garantir a circulação de ar.
  2. Carregue tubos no monitor infravermelho para monitorá-los.
    1. Monte os tubos de vidro contendo moscas em um monitor infravermelho na mesma direção e registre o número do monitor e o número do orifício correspondente a cada droga.
    2. Ajuste o alinhamento de cada tubo e faça com que os raios infravermelhos passem verticalmente pelo centro da faixa de atividade da mosca.
    3. Coloque o monitor dentro de uma incubadora de 25 °C localizada na câmara escura de sono de mosca, seguindo as configurações especificadas: temperatura de 25 °C, Zeitgeber 12 (ZT12) (equivalente à hora local 08:00) e ZT24 (equivalente à hora local 08:00). Essa configuração garante que as moscas experimentem períodos alternados de 12 h de luz e escuridão.
      NOTA: Tente não abrir a porta até que a coleta de dados de monitoramento esteja concluída para manter um ambiente estável na incubadora durante o monitoramento.
    4. Inicie o monitoramento usando o sistema DAM2 (consulte a Tabela de Materiais).
    5. Uma vez concluído o monitoramento, baixe os dados coletados em formato .txt do sistema.

5. Processamento de dados

NOTA: O processamento dos dados utilizando o sistema DAM, DAMFileScan107 e SCAMP foi realizado de acordo com as instruções em seus sites oficiais (ver Tabela de Materiais).

  1. Importe o arquivo txt acima para o software DAMFileScan107 para digitalização e divida conforme necessário para obter dados de suspensão.
    1. Defina a hora de início dos dados de segmentação para 8:01 (1 min de segmentação) ou 8:00 (30 min de segmentação) na terceira manhã após o início dos monitores, e a hora de término é de 8:00 a.m. três dias após a hora de início (Figura 2A1).
      NOTA: As moscas devem adaptar-se ao ambiente de monitorização durante, pelo menos, um dia. Assim, pode-se definir a hora de início dos dados divididos para 8h no terceiro dia após o início do monitor.
    2. Divida os dados em intervalos de 1 min e 30 min. Altere a opção "Bin Length" para 1 minuto, altere a opção "Output File Type" para Channel files, renomear e saída. O método de segmentação de dados de 30 min é o mesmo acima (Figura 2A2-5).
      Observação : ao executar a segmentação de dados em intervalos de 1 min e 30 min, a renomeação final dos dois arquivos deve ser consistente; caso contrário, ele pode ser ilegível durante o processamento subsequente do Matlab. Se necessário, o nome do arquivo pode ser alterado após a saída para facilitar a diferenciação.
  2. Processamento de dados usando SCAMP2020
    1. Abra o SCAMP2020 do pacote do programa no Matlab e clique duas vezes em Vecsey Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program (SCAMP) (Figura 2B).
    2. Adicione sua subpasta "Vecsey SCAMP Scripts" ao caminho, localize o arquivo "scamp.m" nessa pasta e execute-o. Na janela pop-up a seguir, selecione as pastas de processo de 1 min e 30 min em sequência (Figura 2C,D).
    3. Selecione um monitor, clique em Load individual See Plots to preview (Figura 3A1) e verifique a imagem exibida. Desmarque o canal correspondente de moscas mortas (Figura 3A2, Figura 3B).
    4. Repita as etapas acima para verificar todos os monitores.
    5. Renomeie cada canal em cada monitor com base no medicamento correspondente a ser testado (Figura 3A3), selecione todos os monitores e clique em ANALISAR Dados Selecionados para análise (Figura 3A4).
    6. Padrão para a opção selecionada, clique em Analisar para Lixeira Escolhida, marque Exportar Dados e, finalmente, clique em GRÁFICO 30 min Tipos de Dados para Todos os Dias para Grupos Selecionados e EXPORTAR Todos os Dados para gerar os resultados (Figura 3C).
  3. Selecione o arquivo chamado s30 no arquivo CSV, localize o valor médio correspondente e os dados de erro padrão para cada monitor, faça backup no Excel para modificação e ajuste e cole-o no GraphPad Prism (consulte Tabela de Materiais) para desenhar um diagrama de status de suspensão (Figura 4A,B).
  4. Encontre o arquivo chamado "stdur" e calcule os valores médios de sono diurno, noturno e total para cada mosca dentro de três dias (Figura 4A,C). Cole os dados no software Prism para concluir o teste de diferença e desenhe um gráfico.

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Resultados

A reserpina é um inibidor de pequenas moléculas do transportador vesicular de monoamina (VMAT), que inibe a recaptação de monoaminas em vesículas pré-sinápticas, levando ao aumento do sono33. Os efeitos promotores do sono da Reserpina foram examinados em moscas com 30 dias de idade, com o grupo controle sendo alimentado apenas com o solvente dimetilsulfóxido (DMSO). No grupo Reserpina, as moscas mais velhas exibiram um sono significativamente aumentado durante o dia e a noite em comparaç?...

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Discussão

O método descrito é adequado para rastrear rapidamente medicamentos para dormir de pequeno e médio porte. Atualmente, a maioria dos principais métodos de triagem de drogas de alto rendimento são baseados em níveis bioquímicos e celulares. Por exemplo, a estrutura e as propriedades do receptor são examinadas em busca de ligantes específicos que possam se ligar a ele22. Outra abordagem envolve a análise do modo de ligação e da força de fragmentos moleculares de fármacos selecionados ut...

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Divulgações

Os autores declaram não haver interesses concorrentes.

Agradecimentos

Agradecemos aos membros do laboratório do Prof. Junhai Han por suas discussões e comentários. Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China 32170970 a Y.T e pelo "Cyanine Blue Project" da Província de Jiangsu a Z.C.Z.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
AgerBIOFROXX8211KG001
Artificial Climate BoxPRANDTPRX-1000Aofficial website:https://www.nbplt17.com/PLTXBS-Products-20643427/
DAM2 Drosophila Activity MonitorTriKineicsDAM2official website:https://www.trikinetics.com/
DAM2systemTriKineicsversion:v3.03official website:https://www.trikinetics.com/
DAMFileScanTriKineicsversion:1.0.7.0official website:https://www.trikinetics.com/
Dimethyl SulfoxideSIGMA276855
Drosophila Activity Monitoring IncubatorTritech ResearchDT2-CIRC-TKofficial website:https://www.tritechresearch.com/DT2-CIRC-TK.html
Drosophila BottlesBiologix51-17720official website:http://biologixgroup.com/goods.php?id=48
Drosophila: w1118Bloomington Drosophila Stock Center BDSC_3605
ExcelMicrosoftversion:Excel 2016official website:https://www.microsoftstore.com.cn/software/office/excel
Glass tubesTriKineticsPPT5x65official website:https://www.trikinetics.com/
MATLABR2022bMathWorksversion:9.13.0.2049777official website:https://ww2.mathworks.cn/products/matlab.html
PrismGraphPadVersion:Prism 8.0.1official website:https://www.graphpad.com/features
ReserpineMACKLINR817202-1g
SaccharoseSIGMA1245GR500
SCAMPVecsey LabN/Aofficial website:https://academics.skidmore.edu/blogs/cvecsey/

Referências

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