Extração de DNA de Diatomáceas de Amostras de Água e Tecidos

Resumo

Este artigo descreve um protocolo para extração de DNA de diatomáceas usando um kit de extração de DNA comum modificado.

Resumo

O teste de diatomáceas é um meio auxiliar essencial na prática forense para determinar se o cadáver se afogou na água e inferir o local do afogamento. O teste de diatomáceas também é um importante conteúdo de pesquisa no campo do meio ambiente e do plâncton. A tecnologia de teste de biologia molecular de diatomáceas, que se concentra no DNA de diatomáceas como objeto de pesquisa primário, é um novo método de teste de diatomáceas. A extração de DNA de diatomáceas é a base do teste molecular de diatomáceas. Atualmente, os kits comumente usados para extração de DNA de diatomáceas são caros, o que aumenta o custo de realização de pesquisas relacionadas. Nosso laboratório melhorou o kit geral de extração rápida de DNA genômico de sangue total e obteve um efeito satisfatório de extração de DNA de diatomáceas, fornecendo assim uma solução alternativa econômica e acessível de extração de DNA baseada em esferas de vidro para pesquisas relacionadas. O DNA da diatomácea extraído usando este protocolo poderia satisfazer muitas aplicações a jusante, tais como PCR e sequenciamento.

Introdução

Na prática forense, determinar se um cadáver encontrado na água se afogou ou foi jogado na água após a morte é essencial para a resolução adequada do caso¹. É também uma das questões difíceis que precisam ser resolvidas urgentemente na prática forense². Diatomáceas são abundantes no ambiente natural (especialmente na água)^3,4. No processo de afogamento, devido à hipóxia e resposta ao estresse, as pessoas terão movimentos respiratórios intensos e inalarão uma grande quantidade de líquido de afogamento. Assim, as diatomáceas presentes na água entram no pulmão com o líquido de afogamento, e algumas diatomáceas podem entrar na circulação sanguínea pela barreira alvéolo-capilar e se espalhar para órgãos internos com o fluxo sanguíneo ^5,6. A detecção de diatomáceas em tecidos internos e órgãos como pulmão, fígado e medula óssea é uma forte evidência de afogamento antes da morte ^7,8. Atualmente, o teste forense de diatomáceas baseia-se principalmente em métodos de testes morfológicos. Após uma série de pré-digestão do tecido, as estimativas qualitativas e quantitativas morfológicas das diatomáceas não digeridas são realizadas ao microscópio. Durante este período, é necessário utilizar reagentes perigosos e prejudiciais ao ambiente, como o ácido nítrico. Esse processo é demorado e exige dos pesquisadores sólidos conhecimentos taxonômicos e ampla experiência. Tudo isso traz alguns desafios para a equipe forense⁹. A tecnologia de teste de DNA de diatomáceas é uma nova tecnologia para testes de diatomáceas desenvolvida nos últimos anos 10,11,12. Esta tecnologia realiza a identificação de espécies de diatomáceas através da análise da composição de sequências específicas de DNA de diatomáceas^13,14. A tecnologia de PCR e a tecnologia de sequenciamento são métodos técnicos comumente usados, mas sua base é a extração bem-sucedida de DNA de diatomáceas. No entanto, as diatomáceas têm uma estrutura especial diferente de outros organismos, tornando suas técnicas de extração de DNA também diferentes.

A parede celular das diatomáceas apresenta alto grau de silicificação, e seu principal componente é o dióxido de silício 15,16,17. A parede celular siliciosa é muito dura, e deve ser destruída antes de extrair o DNA. Kits comuns de extração de DNA são muitas vezes difíceis de usar diretamente para a extração de DNA de diatomáceas, porque não podem destruir a casca siliciosa das diatomáceas¹⁸. Portanto, destruir a casca siliciosa das diatomáceas é um dos principais problemas técnicos a serem resolvidos na extração do DNA das diatomáceas.

Ao mesmo tempo, como o número de diatomáceas contidas em amostras de pesquisa forense, sejam amostras de água ou órgãos e tecidos de corpos afogados, é muitas vezes limitado, é necessário enriquecer diatomáceas. A essência do enriquecimento é a separação das substâncias. Ao tentar reunir diatomáceas, minimize o conteúdo de outros componentes do material (componentes interferentes). Em trabalhos forenses, os laboratórios frequentemente usam métodos de centrifugação ou enriquecimento por filtração de membrana para separar as células das diatomáceas¹⁹. No entanto, como o equipamento de bombeamento a vácuo não é amplamente utilizado, o método de enriquecimento de membrana não é frequentemente usado em laboratórios forenses primários comuns. Assim, o método de centrifugação ainda é comumente enriquecido por diatomáceas em laboratórios^{forenses 20}.

A extração de DNA de diatomáceas é atualmente usada principalmente na prática forense, e há limitações significativas para sua aplicação. Atualmente, existem poucos kits de extração de DNA de diatomáceas utilizados em ciências forenses no mercado e geralmente são caros²¹. Este artigo fornece um método melhorado de extração de DNA de diatomáceas, tornando a extração de DNA de diatomáceas simples, conveniente e econômica. Isso aumenta a aplicação de testes subsequentes de biologia molecular de diatomáceas e pode resolver melhor problemas relacionados ao afogamento em medicina legal por meio de testes de diatomáceas. Este método quebra as paredes celulares siliciosas das diatomáceas adicionando contas de vidro e definindo um momento apropriado para o vórtice. Desta forma, a proteinase K e a solução de ligação lisam rapidamente as células e inativam várias enzimas nas células. O DNA genômico é absorvido na membrana da matriz na coluna de adsorção e finalmente eluído pelo tampão de eluição. Esse kit de extração de genes de sangue total melhorado melhora o efeito de extração de DNA de diatomáceas do kit de sangue em materiais de exame forense, reduz o custo da extração de DNA de diatomáceas na prática forense e pode ser melhor aplicado à pesquisa forense de base.

Protocolo

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Hainan Medical University. As amostras de tecido utilizadas neste estudo não são consideradas estudos envolvendo seres humanos. Esses espécimes foram obtidos para fins de diagnóstico patológico forense, e o restante foi usado para a extração de DNA de diatomáceas neste experimento. Os pesquisadores não podem identificar prontamente os indivíduos para obter o consentimento informado das partes interessadas relevantes.

OBS: Para garantir a aplicabilidade geral do método de pesquisa relatado neste experimento, este experimento seguiu basicamente as instruções de operação do kit utilizado, sendo que apenas algumas etapas foram modificadas. As amostras de água utilizadas neste experimento foram retiradas aleatoriamente de lagoas próximas ao laboratório (Figura 1A Suplementar). Neste experimento, o tecido pulmonar do corpo afogado foi confirmado como tecido de pesquisa para demonstrar o protocolo de extração (Figura 1B Suplementar). Na prática forense, às vezes também é necessário usar outros órgãos e tecidos de corpos afogados (como fígado, baço, rim, medula óssea, etc.) para extrair o DNA das diatomáceas, o que requer pequenas melhorias correspondentes a este método experimental, que serão explicadas na seção correspondente do experimento. As amostras de tecido pulmonar utilizadas neste experimento foram provenientes de cadáveres claramente afogados em casos forenses. Testes morfológicos têm sido realizados para comprovar que o tecido pulmonar contém diatomáceas (Figura 2 Suplementar).

1. Pré-tratamento das amostras

1. Pré-tratamento de amostras de água
   1. Levar 10 mL de amostra de água para o tubo da centrífuga e centrifugar a 13.400 x g por 5 min. Descarte cuidadosamente 9,8 mL de sobrenadante com uma pistola de pipeta e transfira cerca de 200 μL de amostra de água de diatomácea enriquecida restante no fundo para um tubo de centrífuga de 2 mL.
      NOTA: O pré-experimento pode ser realizado primeiro, e a quantidade inicial pode ser aumentada se uma amostra de água de 10 mL não for suficiente para o enriquecimento.
2. Pré-tratamento de amostras de tecido
   1. Tome 0,5 g do tecido da margem pulmonar do corpo afogado, pique totalmente ou triture o tecido pulmonar até que fique lamacento. Prevenir a contaminação de diatomáceas exógenas é o cerne desta etapa. Corte o tecido em pedaços repetidamente usando uma tesoura.

2. Extração de DNA

NOTA: Todas as etapas de centrifugação são concluídas à temperatura ambiente. Usando uma centrífuga de mesa com uma força centrífuga de 14.500 x g; um banho-maria (ou banho metálico) pré-aquecido a 70 °C precisa ser preparado antes do início do experimento. Todas as etapas devem seguir rigorosamente os princípios de operação asséptica.

1. Montagem de amostras de água e tecidos
   NOTA: A amostra de água e o método de extração de DNA de diatomáceas de tecido são os mesmos.
   1. Adicionar esferas de vidro a um tubo de centrifugação de 2 mL contendo a amostra de água pré-tratada. Inverta 10x-15x para misturar bem. As contas de vidro adicionadas são compostas de contas de vidro grandes e pequenas misturadas em uma proporção de massa de 1:1. O diâmetro das contas de vidro grandes é de 1,5-2,0 mm e das contas de vidro pequenas é de 0,4-0,6 mm.
   2. Tome 0,5 g de tecido finamente picado, adicione contas de vidro a um tubo de centrífuga de 2 mL contendo o tecido, conforme descrito acima. Inverta 10x-15x para misturar.
2. Adicionar 40 μL de proteinase K (20 mg/mL) aos tubos. Coloque em temperatura ambiente por 15 min, durante esse período, inverta e misture 10x a cada 3 min.
   NOTA: Se o tecido não for totalmente digerido, a quantidade de proteinase K pode ser adequadamente aumentada até que a solução se torne clara.
3. Adicionar 200 μL de tampão de ligação aos tubos da centrífuga, imediatamente vórtice, e misturar durante 4 min (frequência de mistura de oscilação: 3000 rpm).
   NOTA: Nesta etapa, a intensidade e o tempo de agitação devem ser rigorosamente controlados para garantir intensidade e tempo de mistura suficientes.
4. Coloque os tubos de centrifugação em banho-maria a 70 °C por 10 minutos e a solução fica límpida.
5. Adicionar 100 μL de isopropanol aos tubos da centrífuga, vórtice e misturar por 15 s, precipitação floculenta pode aparecer neste momento.
   NOTA: É muito importante misturar bem com a força adequada nas etapas de operação acima, mas o tremor vigoroso deve ser evitado para evitar o cisalhamento do DNA.
6. Colocar a solução obtida na etapa anterior juntamente com o precipitado floculante na coluna de adsorção (a coluna de adsorção é colocada no tubo de coleta). O comprimento da coluna de adsorção é de 3,0 cm, o diâmetro é de 1,0 cm e a matriz de adsorção é a membrana da matriz de silício.
7. Centrifugar a 8.000 x g por 30 s, descartar o líquido residual no tubo de coleta e colocar a coluna de adsorção de volta no tubo de coleta.
8. Adicionar 500 μL de tampão de remoção do inibidor à coluna de adsorção. Centrifugar a 13.400 x g por 30 s e descartar o líquido residual no tubo de coleta.
9. Adicionar 700 μL de tampão de lavagem à coluna de adsorção. Centrifugar a 13.400 x g por 30 s e descartar o líquido residual no tubo de coleta.
   NOTA: Adicione a quantidade especificada de etanol absoluto ao frasco tampão de lavagem antes da primeira utilização.
10. Adicionar 500 μL de tampão de lavagem à coluna de adsorção. Centrifugar a 13.400 x g por 30 s e descartar o líquido residual no tubo de coleta.
11. Coloque a coluna de adsorção de volta no tubo de coleta vazio. Centrifugar a 14.500 x g por 2 min e remover o tampão de lavagem o máximo possível, para evitar que o etanol residual no tampão de lavagem iniba as reações a jusante.
12. Retire a coluna de adsorção e coloque-a em um tubo de centrífuga limpo. Adicionar 100 μL de tampão de eluição à parte média da membrana de adsorção.
13. Colocar a coluna de adsorção à temperatura ambiente durante 3-5 minutos e centrifugar a 13.400 x g durante 1 minuto.
14. Adicionar novamente a solução obtida na etapa anterior à coluna de adsorção centrífuga. Colocar a coluna de adsorção centrífuga à temperatura ambiente durante 2 minutos e centrifugar a 13.400 x g durante 1 min.
    NOTA: O tampão de eluição deve ser pré-aquecido em banho-maria a 70 °C durante cerca de 10 minutos. O volume de eluição não deve ser inferior a 50 μL; caso contrário, o rendimento de DNA será reduzido.
15. Armazenar o DNA da diatomácea extraído a 2-8 °C para uso futuro. Se a solução de ADN for conservada durante muito tempo, armazene-a a -20 °C.

3. Teste PCR

NOTA: Como o conteúdo de diatomáceas em amostras forenses é frequentemente baixo, os extratos de amostras de tecido dos corpos afogados também podem conter diferentes graus de tecido e órgãos (como os pulmões neste experimento) com seu próprio DNA. Portanto, a detecção direta de DNA total em extratos de DNA não reflete a situação da extração de DNA de diatomáceas. Neste experimento, primers diatomáceas específicos foram selecionados, e produtos de PCR foram usados para avaliar a extração de DNA de diatomáceas no extrato. Os produtos podem ser observados e analisados por eletroforese em gel de agarose e também podem ser analisados por curva quantitativa de fusão por PCR fluorescente em tempo real, que apresenta maior sensibilidade.

1. Adicione 2 μL do DNA extraído de amostras de água e tecidos como modelo. Escolha um dos dois métodos a seguir para inspeção.
2. Teste PCR convencional
   1. Use primers²² que podem amplificar especificamente fragmentos de rDNA da diatomácea 18S. Para obter detalhes, consulte a Tabela 1.
   2. Estabelecer o sistema de reação de PCR e as condições de amplificação de acordo com as características dos primers. Para obter detalhes, consulte a Tabela 2.
   3. Executar os produtos de amplificação de PCR em gel de agarose a 2%. Observe e analise as imagens com um imageador em gel.
3. Teste de PCR quantitativo fluorescente
   1. Use os primers acima que podem amplificar especificamente fragmentos de rDNA de diatomácea 18S para preparar um sistema de reação quantitativa de PCR fluorescente em tempo real. Para obter detalhes, consulte a Tabela 3.
   2. Realizar a amplificação por PCR e analisar a curva de amplificação obtida e os valores de Ct. Ao mesmo tempo, defina um programa, derreta as fitas duplas dos produtos amplificados em fitas simples gradualmente através da tecnologia de curva de fusão quantitativa fluorescente por PCR e, em seguida, analise as curvas de fusão obtidas.

Resultados

Uma vez que a solução de DNA extraída pelo método de extração de DNA atualmente utilizado contém todos os componentes de DNA de diferentes fontes na amostra, o DNA obtido por este protocolo não foi exceção. Assim, a solução de DNA não era apenas uma solução de DNA genômico de diatomáceas. Os primers capazes de amplificar especificamente fragmentos de rDNA da diatomácea 18S foram selecionados por meio de consulta à literatura22,23,24....

Discussão

As células das diatomáceas são protegidas por paredes celulares siliciosas duras¹⁷, e essa estrutura deve ser destruída para extrair o DNA das diatomáceas. Os kits comuns não destroem facilmente a casca siliciosa das diatomáceas; portanto, é difícil extrair com sucesso o DNA das diatomáceas²¹. Nosso laboratório aprimorou o kit de extração de DNA sanguíneo mais comumente usado, adicionando esferas de vidro de diferentes diâmetros e diferentes proporções de m...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Binding Buffer	BioTeke	B010006022	rapidly lysing cells
ChemoHS qPCR Mix	Monad	00007547-120506	qPCR Mix
D2000 DNA ladder	Real-Times(Beijing) Biotechnology	RTM415	Measure the position of electrophoretic bands
D512	Taihe Biotechnology	TW21109196	forword primer
D978	Taihe Biotechnology	TW21109197	reverse primer
Elution buffer	BioTeke	B010006022	A low-salt elution buffer washes off the DNA
Glass bead	Yingxu Chemical Machinery(Shanghai)	70181000	Special glass beads for dispersing and grinding
Import adsorption column	BioTeke	B2008006022	Adsorption column with silica matrix membrane
Inhibitor Removal Buffer	BioTeke	B010006022	Removal of Inhibitors in DNA Extraction
Isopropanol	BioTeke	B010006022	Precipitate or isolate DNA
MIX-30S Mini Mixer	Miulab	MUC881206	oscillatory action
Proteinase K	BioTeke	B010006022	Inactivation of intracellular nucleases and other proteins
Rotor-Gene Q 5plex HRM	Qiagen	R1116175	real-time fluorescence quantification PCR
Speed Micro-Centrifuge	Scilogex	9013001121	centrifuge
Tanon 3500R Gel Imager	Tanon	16T5553R-455	gel imaging
Taq Mix Pro	Monad	00007808-140534	PCR Mix
Thermo Cycler	Zhuhai Hema	VRB020A	ordinary PCR
Wash Buffer	BioTeke	B010006022	Remove impurities such as cell metabolites