Modelo de Lesão Traumática Leve de Cabeça Fechada em Rato e sua Validação

Resumo

Aqui, apresentamos um modelo de traumatismo cranioencefálico (TCEm) de cabeça fechada em ratos e sua validação exibindo notável semelhança com o TCEm humano em relação às manifestações comportamentais durante as fases aguda e subaguda.

Resumo

Os modelos animais são cruciais para avançar nossa compreensão do traumatismo cranioencefálico leve (TCEm) e orientar a pesquisa clínica. Para obter insights significativos, o desenvolvimento de um modelo animal estável e reprodutível é essencial. Neste estudo, relatamos uma descrição detalhada de um modelo de TCEm de cabeça fechada e um método de validação representativo usando ratos Sprague-Dawley para verificar o efeito da modelagem. O modelo envolve a queda de um peso de massa de 550 g de uma altura de 100 cm diretamente na cabeça de um rato em uma superfície destrutível, seguido por um giro de 180 graus. Para avaliar a lesão, os ratos foram submetidos a uma série de avaliações neurocomportamentais 10 min após a lesão, incluindo tempo de perda de consciência, tempo de comportamento de primeira busca, habilidade de escape e teste de habilidade de equilíbrio do feixe. Durante os estágios agudo e subagudo após a lesão, foram realizados testes comportamentais para avaliar a capacidade de coordenação motora (tarefa Beam), ansiedade (teste de Campo Aberto) e habilidades de aprendizagem e memória (teste Morris Water Maze). O modelo de TCEm de cabeça fechada produziu uma resposta consistente à lesão com mortalidade mínima e situações replicadas da vida real. O método de validação verificou efetivamente o desenvolvimento do modelo e garantiu a estabilidade e consistência do modelo.

Introdução

O traumatismo cranioencefálico leve (TCEm), ou concussão, é o tipo de lesão mais prevalente e pode levar a vários sintomas crônicos e de curta duração¹. Esses sintomas podem incluir tontura, cefaleia, depressão, anedonia, entre outros, levando a sofrimento significativo para os indivíduos acometidos pelo TCEm². Como a maioria dos TCEm é causada por trauma contuso³, torna-se imperativo desenvolver modelos animais que mimetizem com precisão tais lesões. Esses modelos são essenciais para uma melhor compreensão da lesão e de seus mecanismos subjacentes, oferecendo um ambiente controlado com variabilidade e heterogeneidade reduzidas em relação aos estudos em humanos.

Numerosos modelos bem estabelecidos de roedores foram desenvolvidos para traumatismo cranioencefálico (TCE), incluindo lesão por percussão líquida (IFP)⁴, impacto cortical controlado (CCI)⁵, lesão por queda de^peso6, traumatismo cranioencefálico blásteo7, entre outros. No entanto, esses modelos se concentram principalmente na replicação de cenários de TCE moderado a grave. Em contraste, os modelos experimentais especificamente desenhados para simular o TCEm têm recebido relativamente menos atenção e permanecem pouco explorados⁸. Portanto, há uma necessidade crítica de estabelecer um modelo animal estável e reprodutível que represente com precisão o TCEm. Tal modelo melhoraria significativamente nossa compreensão das consequências neurobiológicas e comportamentais associadas ao TCEm.

Não é possível distinguir os déficits funcionais em ratos com TCEm em comparação com ratos normais por meio de observação casual após o término dos efeitos da anestesia. Portanto, é necessário aplicar testes específicos. Em humanos, uma ampla gama de avaliações clínicas é utilizada para avaliar os pacientes ^9,10,11. Da mesma forma, o estabelecimento de um modelo bem-sucedido no modelo de ratos também requer o uso de instrumentos de avaliação rápida para determinar sua validade.

Neste estudo, apresentamos um modelo de TCEm de cabeça fechada em ratos, permitindo a investigação de TCEm de uma maneira que se assemelha muito à condição humana. A descrição detalhada do modelo e seu procedimento de validação fornecem uma compreensão abrangente da abordagem experimental utilizada no estudo do TCEm.

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Protocolo

Os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Central Sul. Todos os estudos foram conduzidos de acordo com os princípios éticos e de bem-estar dos animais de laboratório.

1. Procedimento de alimentação e anestesia dos animais

1. O grupo abriga 280-320 g de ratos machos Sprague-Dawley e os mantém em um ciclo claro/escuro de 12 h/12 h com acesso a comida e água ad libitum. Realizar o estudo após os ratos se aclimatarem por 6 dias.
2. Anestesiar o rato com isoflurano a 3% a 0,6 L/min de fluxo de ar em caixa de indução até que este não responda ao pinçamento da pata ou cauda. Manter a vazão por 30 s.
   OBS: Não foram utilizadas medicações para dor, pois interfeririam na resposta do rato nas avaliações neurocomportamentais.

2. Configuração pré-operatória

1. Posicione uma esponja com um valor de dureza de 35D (peso de 35 kg/m3 de esponja), com comprimento e largura idênticos, mas uma espessura de 12 cm, dentro de uma caixa de acrílico (15 cm x 22 cm x 43 cm) sem tampa superior.
2. Cortar uma folha de estanho (uma espessura de 20 μm) e fixá-la na caixa de acrílico usando fita adesiva para formar uma superfície destrutível capaz de suportar o peso de um rato. Além disso, marque uma linha de corte medindo aproximadamente 10 cm para ser o local designado para o posicionamento da cabeça do rato.
3. Com o auxílio de um suporte de ferro, fixe firmemente o tubo de PVC no lugar. Prepare um peso perfurado, pesando 550 gramas com um diâmetro de 18 milímetros. Fixe o peso a uma linha de pesca a uma altura de 1 metro dentro de um tubo de policloreto de vinila ou PVC. e ajuste a posição do tubo guia 3 centímetros acima da folha de estanho.
4. Prepare um capacete e um travesseiro. Faça um capacete usando um disco de aço inoxidável medindo 10 mm de diâmetro e 3 mm de espessura. Prepare um travesseiro de esponja em forma de cunha para colocar sob a cabeça do rato, garantindo que ele esteja perpendicular à direção da gravidade.
   NOTA: Um diagrama esquemático do aparelho de impacto é apresentado na Figura 1. O capacete serve para identificar o local do impacto e melhorar a distribuição da força externa. O travesseiro é utilizado para garantir danos uniformes e estáveis.

3. Indução de mTBI

1. Coloque rapidamente o rato anestesiado em seu peito sobre o papel alumínio.
   NOTA: Dois operadores são necessários para a indução do mTBI - um para a preparação e o outro para a verificação.
2. Modo de preparo: Coloque o travesseiro embaixo do rato, garantindo que sua cabeça fique paralela ao papel alumínio. Alinhe o capacete com as orelhas do rato e fixe-o no lugar.
3. Verificação: Verifique se o tubo de PVC está posicionado diretamente acima do capacete. Depois que ambos os operadores confirmarem a configuração correta, vá para a próxima etapa.
4. Indução da rotação da cabeça: Solte o peso, permitindo que ele caia e atinja a cabeça do rato, induzindo uma queda sobre a esponja e uma rotação de 180°.
5. Coloque o rato de costas em uma gaiola limpa.

4. Indução simulada

1. Trate o rato da mesma forma que a descrição anterior da indução do mTBI, mas não o submeta ao impacto da cabeça.

5. Procedimento de validação: avaliações neurocomportamentais agudas

OBS: As seguintes avaliações foram modificadas com base^{nos Escores} de Severidade Neurológica9 e no protocolo de Flierl et al.10. Todas essas avaliações foram realizadas 10 min após o rato recuperar o reflexo de retificação.

1. Tempo de perda de consciência: Registre a duração desde quando o rato está anestesiado até quando ele recupera o reflexo de endireitamento.
   NOTA: O reflexo de retificação é o processo no qual o rato vira quando colocado de costas. A perda do reflexo de retificação deve ser considerada como um desfecho humano, e o animal deve ser sacrificado de acordo com as diretrizes institucionais.
2. Primeiro tempo de comportamento de busca: Registre a duração desde quando o rato é anestesiado até quando ele mostra o comportamento de busca pela primeira vez.
   OBS: Buscar comportamento é um sinal de interesse pelo ambiente, uma resposta fisiológica.
3. Capacidade de escapar
   1. Coloque o rato no meio de um aparelho circular (0,5 m de diâmetro e 0,3 m de altura) com uma saída (12,5 cm de comprimento e 9 cm de largura).
   2. Registre o tempo que o rato leva para sair do círculo.
      NOTA: Se o rato não sair do círculo dentro de 180 s, registre o tempo como 180 s.
4. Teste de habilidade de equilíbrio de feixe
   1. Coloque o rato em uma viga de 3 cm, 2 cm e 1,5 cm de largura por 1 min de acordo.
   2. Se o rato mantiver um equilíbrio com uma postura firme na trave, marque-o como 0.
   3. Se o rato agarrar o lado da trave, dê uma pontuação de 1. Se o rato abraçar a trave e um membro cair dela, marque-a como 2.
   4. Se o rato abraçar a trave e os dois membros caírem dela ou girarem sobre ela (>60 s), marque-a como 3.
   5. Se o rato tentar se equilibrar na trave, mas cair (> 40 s), marque-o como 4.
   6. Se o rato tentar se equilibrar na trave, mas cair (>20 s), marque-o como 5.
   7. Se o rato não tentar se equilibrar ou se pendurar na trave e cair dentro de 20 s, marque-o como 6.
      NOTA: O ensaio de balanceamento de feixe não requer um pré-ensaio.

6. Procedimento de validação: Avaliação do neurocomportamento

NOTA: Antes dos experimentos comportamentais, os ratos foram manuseados por 2 min diariamente por 3 dias consecutivos para minimizar o estresse e a interrupção da novidade. Todos os experimentos comportamentais foram realizados colocando-se os animais no ambiente de teste por 60 min antes do início do experimento.

1. Capacidade de coordenação motora (tarefa de feixe)
   1. Arranjo experimental
      1. Coloque os ratos em uma das extremidades da viga de equilíbrio (1,5 m de comprimento e 75 cm acima do chão). Coloque uma caixa de escape (uma gaiola de cama inclinada) na outra extremidade.
      2. Posicione um acolchoamento de espuma abaixo da viga para mitigar o risco potencial de lesões em ratos em caso de quedas durante o teste.
      3. Ligue a câmera de vídeo.
      4. Agende dias de teste em momentos específicos pós-lesão ou pós-tratamento simulado (por exemplo, dia 1, dia 3 e dia 7).
   2. Fase de treinamento (2 dias)
      1. Treine os ratos para cruzar a viga de 4 cm de largura 3 vezes consecutivas, seguida de duas tentativas na viga de 2 cm de largura.
      2. Durante o treinamento, guie suavemente os ratos através da viga até que eles possam atravessá-los facilmente sem interferência.
   3. Experimento de viga de equilíbrio
      1. Coloque os ratos sobre a viga de 2 cm de largura por 5 tentativas consecutivas.
      2. Registre o início e o fim de cada tentativa quando o nariz do rato cruzar as linhas de partida e chegada, respectivamente.
      3. Retorne os ratos para suas gaiolas no final do experimento.
   4. Teste basal
      1. Realizar o experimento do feixe de equilíbrio antes da lesão ou tratamento.
      2. Calcule os valores médios destes 5 ensaios consecutivos para estabelecer a linha de base para cada rato.
   5. Análise de dados
      1. Analise o tempo para atravessar a viga e o número total de deslizamentos do retropé usando análise de vídeo por pesquisadores cegos para as condições experimentais.
2. Ansiedade (teste de campo aberto)
   1. Arranjo experimental
      1. Prepare a arena de campo aberto, certificando-se de que está limpa e livre de quaisquer sinais de odor anteriores. Divida a arena em três zonas: uma zona interna central (33 cm x 33 cm), uma zona do meio (66 cm x 66 cm) e uma zona externa.
   2. Fase de testes
      1. Coloque um rato no centro da arena de campo aberto e inicie o cronômetro. Permita que o rato explore a arena por 5 minutos livremente. Após 5 min, retorne o rato com cuidado e delicadeza à sua gaiola doméstica.
   3. Recolha de dados
      1. Meça a distância total percorrida pelo rato durante o período de exploração de 5 minutos. Determine o tempo que o rato passa nas zonas interna, média e externa central.
   4. Análise de dados
      1. Use a distância total percorrida como uma medida do comportamento exploratório global e da habilidade locomotora. Calcule o tempo gasto na zona interna central como um indicador de respostas semelhantes à ansiedade.
3. Habilidades de aprendizagem e memória (teste do labirinto aquático de Morris)
   1. Certifique-se de que o aparelho do labirinto aquático está em condições adequadas. Tinga a água de preto e coloque pistas nas quatro direções cardeais. Posicione a plataforma 2,5 cm abaixo da superfície da água.
   2. Montar um sistema de monitoramento para registrar e observar o comportamento dos ratos.
   3. Dia da trilha
      1. Coloque rapidamente o rato no labirinto aquático. Se o rato não conseguir alcançar a plataforma dentro de 2 min, guie-o suavemente usando o bastão de madeira.
      2. Permita que o rato se familiarize com o ambiente do labirinto enquanto estiver na plataforma por 20 s e, em seguida, remova-o. Uma vez que o rato está na plataforma, deixe-o ficar por 20 s e, em seguida, remova-o.
   4. Repetição diária
      1. Repita o procedimento do dia de treino, colocando o rato na água de diferentes quadrantes. Repita a etapa 6.3.3. Continue o treinamento por 5 dias consecutivos.
   5. Dia do teste da sonda: No^6º dia, remova a plataforma e coloque o rato no mesmo quadrante por 2 min.
   6. Observação e registro: Utilizar o sistema de monitoramento para monitorar o comportamento do rato nos dias de teste e teste de sonda.
   7. Limpeza: Depois de remover o rato do labirinto aquático, use uma toalha para secá-lo completamente.

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Resultados

O aparelho utilizado neste trabalho foi uma versão modificada do modelo de Kane e do modelo pediátrico de Richelle Mychasiuk11,12. Neste estudo, ratos SD foram alocados em grupos sham e mTBI. Para demonstrar a reprodutibilidade desse modelo, realizamos três réplicas independentes desse modelo juntamente com a avaliação neurocomportamental aguda, com cada experimento envolvendo 8-12 ratos. Neste estudo, foram utilizados mais ...

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Discussão

Este modelo simula com sucesso um TCEm de cabeça fechada sem a necessidade de incisão do couro cabeludo ou abertura do crânio, fornecendo uma representação mais precisa do cenário de impacto observado em casos humanos. Evitar a incisão do couro cabeludo ajuda a prevenir respostas inflamatórias que podem não se alinhar com a situação real. Em comparação com o modelo pediátrico de Richelle Mychasiuk12, o modelo usado neste estudo é especificamente adaptado para ratos adultos pesando entre 280-320 g, permitin...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylic box	In-house	N/A	15 cm x 22 cm x 43 cm
Anesthesia Machine	RWD Life Science Co.	R540 Mice & Rat Animal Anesthesia Machine
Helmet	In-house	N/A	Stainless-steel disk measuring 10 mm in diameter and 3 mm in thickness
Morris water maze	RWD Life Science Co.		Diameter 150 cm, height 50 cm,platform diameter 35 cm
Open field	RWD Life Science Co.	63007	Width100 cm, height 40 cm
Panlab SMART V3.0	RWD Life Science Co.	SMART v3.0
Perforated weight	In-house	N/A	Weight of 550 g and diameter of 18 mm
Pillow	In-house	N/A	Wedge-shaped sponge to place beneath the rat's head