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Resumo

Descrevemos um protocolo para estabelecer um modelo de cultura de interface ar-líquido (ALI) utilizando células epiteliais das vias aéreas traqueais neonatais (nTAEC) e realizar exposição à hiperóxia fisiologicamente relevante para estudar o efeito do estresse oxidativo induzido pela atmosfera em células derivadas do epitélio da superfície das vias aéreas neonatais em desenvolvimento.

Resumo

O epitélio das vias aéreas neonatais pré-termo está constantemente exposto a estressores ambientais. Um desses estressores em neonatos com doença pulmonar inclui a tensão de oxigênio (O2) maior do que a atmosfera ambiente - denominada hiperóxia (>21% O2). O efeito da hiperóxia nas vias aéreas depende de vários fatores, incluindo o estágio de desenvolvimento das vias aéreas, o grau de hiperóxia e a duração da exposição, com exposições variáveis potencialmente levando a fenótipos únicos. Embora tenha havido uma extensa pesquisa sobre o efeito da hiperóxia na alveolarização pulmonar neonatal e na hiper-reatividade das vias aéreas, pouco se sabe sobre o efeito subjacente de curto e longo prazo da hiperóxia nas células epiteliais das vias aéreas neonatais humanas. Uma das principais razões para isso é a escassez de um modelo in vitro eficaz para estudar o desenvolvimento e a função epitelial das vias aéreas neonatais humanas. Aqui, descrevemos um método para isolar e expandir células epiteliais das vias aéreas traqueais neonatais humanas (nTAECs) utilizando aspirados traqueais neonatais humanos e cultura dessas células em cultura de interface ar-líquido (ALI). Demonstramos que as nTAECs formam uma monocamada celular polarizada madura em cultura de LPA e sofrem diferenciação mucociliar. Também apresentamos um método para exposição moderada à hiperóxia da monocamada celular em cultura de LPA usando uma incubadora especializada. Além disso, descrevemos um ensaio para medir o estresse oxidativo celular após a exposição à hiperóxia em cultura de LPA usando quantificação fluorescente, que confirma que a exposição moderada à hiperóxia induz estresse oxidativo celular, mas não causa danos significativos à membrana celular ou apoptose. Este modelo pode potencialmente ser usado para simular a exposição à hiperóxia clinicamente relevante encontrada pelas vias aéreas neonatais na Unidade de Terapia Intensiva Neonatal (UTIN) e usado para estudar os efeitos de curto e longo prazo do O2 na programação epitelial das vias aéreas neonatais. Estudos usando esse modelo podem ser utilizados para explorar maneiras de mitigar a lesão oxidativa no início da vida nas vias aéreas em desenvolvimento, que está implicada no desenvolvimento de doenças das vias aéreas de longo prazo em ex-bebês prematuros.

Introdução

O oxigênio terapêutico (O2) é uma das terapias mais utilizadas na unidade de terapia intensiva neonatal (UTIN)1. Consequentemente, a exposição à hiperóxia (>21% O2) é um estressor atmosférico comum encontrado por neonatos com e sem doença pulmonar significativa. As respostas pulmonares à hiperóxia podem variar dependendo da intensidade e/ou duração da exposição e da localização anatômica, tipo de célula e estágio de desenvolvimento pulmonar 2,3,4,5,6. A maior parte das pesquisas sobre lesão pulmonar por hiperóxia neonatal tem se concentrado no efeito da exposição à hiperóxia no contexto da alveolarização pós-natal para modelar a displasia broncopulmonar (DBP) - a doença pulmonar crônica mais comum que afeta bebês prematuros 6,7,8,9,10,11. A gravidade da DBP é classificada pela quantidade de suporte respiratório e O2 necessário em 36 semanas após a idade menstrual9. A maioria dos bebês com DBP melhora clinicamente ao longo do tempo, à medida que os pulmões continuam a crescer, com a maioria desmamando o suporte respiratório antes do primeiro aniversário12,13. Independentemente da gravidade da DBP após o nascimento, morbidades significativas que afetam ex-bebês prematuros incluem um risco 5 vezes maior de sibilância pré-escolar, asma, infecções respiratórias recorrentes ao longo da infância e doença pulmonar obstrutiva crônica de início precoce 12,14,15,16,17,18,19. O efeito da hiperóxia na doença das vias aéreas de longa duração e infecções pulmonares em bebês prematuros foi investigado usando modelos animais in vitro e in vivo 20,21,22,23,24. No entanto, a maioria desses modelos enfocou o papel do tecido mesenquimal, do epitélio alveolar e da musculatura lisa das vias aéreas 25,26,27,28.

O epitélio da superfície das vias aéreas reveste todo o trajeto do sistema respiratório, estendendo-se da traqueia até o bronquíolo terminal, terminando pouco antes do nível dos alvéolos29. As células basais das vias aéreas são as células-tronco primárias do epitélio das vias aéreas, com capacidade de se diferenciar em todo o repertório de linhagens epiteliais maduras das vias aéreas, que incluem células ciliadas e secretoras (células clube: não produtoras de muco e células caliciformes: produtoras de muco)29,30,31,32. Estudos de cultura celular no contexto de lesão pulmonar hiperóxica neonatal têm usado principalmente linhagens celulares de câncer humano ou de camundongo adulto33,34. Além disso, a maioria dos experimentos in vitro utilizou sistemas de cultura submersos, que não permitem a diferenciação das células em um epitélio mucociliar das vias aéreas semelhante ao epitélio das vias aéreas in vivo em humanos35. Consequentemente, há uma lacuna no conhecimento sobre os efeitos da lesão pulmonar induzida por hiperóxia no desenvolvimento de células epiteliais das vias aéreas de neonatos humanos. Uma razão é a escassez de modelos translacionais para estudar os efeitos da exposição atmosférica no epitélio das vias aéreas neonatais humanas. A lesão pulmonar hiperóxica no início da vida pode levar a doenças das vias aéreas a longo prazo e aumento do risco de infecção, resultando em consequências que alteram a vida em ex-prematuros 14,36,37. Em lactentes não sobreviventes com DBP grave, o epitélio da superfície das vias aéreas apresenta anormalidades distintas, incluindo hiperplasia de células caliciformes e desenvolvimento ciliar desordenado, denotando depuração mucociliar anormal e aumento da altura epitelial comprometendo o calibre das vias aéreas38. Na última década, tem havido um interesse crescente na cultura de células epiteliais primárias das vias aéreas na interface ar-líquido (LPA) para estudar o desenvolvimento epitelial pós-natal das vias aéreas 39,40,41,42. No entanto, os modelos ALI de células epiteliais das vias aéreas neonatais não foram usados no contexto de modelos de perturbação redox atmosférica, como a exposição à hiperóxia.

Usando um método publicado anteriormente39, utilizamos amostras de aspirado traqueal neonatal obtidas de neonatos intubados na UTIN e células epiteliais primárias das vias aéreas traqueais neonatais (nTAECs) isoladas e expandidas com sucesso. Utilizamos inibidores de Rho, Smad, glicogênio sintase quinase (GSK3) e sinalização de alvo de rapamicina em mamíferos (mTOR) para aumentar a capacidade de expansão e retardar a senescência nessas células, conforme descrito anteriormente39,42, o que permite a passagem eficiente e posterior de nTAECs. O protocolo descreve métodos para estabelecer culturas 3D ALI usando nTAECs e realizar exposição à hiperóxia nas monocamadas de nTAEC. A inibição de Rho e Smad é usada nos primeiros 7 dias de cultura de LPA (dias de LPA 0 a 7), após os quais esses inibidores são removidos do meio de diferenciação pelo resto da duração da cultura de LPA. A superfície apical da monocamada de células epiteliais das vias aéreas cultivadas com LPA permanece exposta ao ambiente43, o que permite estudos de perturbação atmosférica e se assemelha muito à patobiologia de uma via aérea neonatal em desenvolvimento exposta à hiperóxia in vivo. A concentração deO2 utilizada em estudos prévios de cultura celular (independentemente de células imortalizadas ou primárias) de lesão pulmonar hiperóxica neonatal varia significativamente (variando de 40% a 95%), assim como o tempo de exposição (variando de 15 min a 10 dias)36,44,45,46,47. Para este estudo, a monocamada de células ALI foi exposta a 60% de O2 por 7 dias do dia 7 ao 14 da LPA (após a remoção dos inibidores de Rho / Smad do meio de diferenciação). A exposição à hiperóxia foi realizada durante a fase inicial-intermediária da diferenciação mucociliar (dia 7 a 14 da LPA) em oposição ao epitélio maduro totalmente diferenciado e, portanto, simula o desenvolvimento in vivo do epitélio das vias aéreas em bebês prematuros. Essa estratégia de exposição minimiza o risco de toxicidade aguda de O2 (que é esperada com concentrações mais altas de O2) enquanto ainda exerce estresse oxidativo dentro de uma faixa fisiologicamente relevante e se assemelha à janela crítica de transição do ambiente intrauterino relativamente hipóxico para um ambiente externo hiperóxico em recém-nascidos humanos prematuros.

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Protocolo

As amostras de aspirado traqueal neonatal foram coletadas somente após o consentimento informado dos pais, e o protocolo utilizado para coleta, transporte e armazenamento foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional (IRB) do Centro de Ciências da Saúde da Universidade de Oklahoma (IRB 14377).

1. Preparação para isolamento, passagem e cultura ALI de nTAEC

  1. Preparação de mídia
    1. Meio de via aérea epitelial brônquica (BLEAM) com inibidores (BLEAM-I): Prepare 500 mL (1 frasco, armazenado a 4 ° C) de BLEAM adicionando 1,25 mL de suplemento HLL (500 μg / mL de albumina sérica humana, 0,6 μM de ácido linoleico, 0,6 μg / mL de lecitina), 15 mL de L-glutamina (6 mM), 2 mL de extrato P (0,4%, extrato de hipófise bovina), 5 mL de TM1 (1 μM de epinefrina, 5 μg / mL de transferrina, 10 nM de triiodotironina, 0,1 μg / mL de hidrocortisona, 5 ng / mL de fator de crescimento epidérmico (EGF), 5 ng / mL de insulina), 1 mL de solução antibiótica (Normocina, 0,1 mg / mL). Para evitar a senescência das células primárias e melhorar a eficiência da expansão, adicione os seguintes inibidores do fator de crescimento conforme descrito anteriormente39: Y-27632 (proteína quinase associada a Rho ou inibidor de ROCK) com uma concentração final de 5 μM, A83-01 (inibe a sinalização Smad) com uma concentração final de 1 μM, CHIR 99021 (glicogênio sintase quinase-3 ou inibidor de GSK3) com uma concentração final de 0,4 μM e rapamicina (inibidor do alvo molecular da rapamicina ou mTOR) com uma concentração final concentração de 5 nM. Filtre a mídia através de um filtro de tamanho de poro de 0,22 μm. Consulte a Tabela 1 para obter uma lista de componentes de mídia.
    2. Meio ALI de células epiteliais brônquicas/traqueais humanas (HBTEC): Faça 500 mL de meio HBTEC descongelando o frasco a 37 °C e adicionando 1 mL de solução antibiótica (Normocin, 0,1 mg/mL). Depois de adicionado, filtre a mídia através de um filtro de tamanho de poro de 0,22 μm.
    3. Mídia HBTEC com inibidores (HBTEC-I): Prepare a mídia HBTEC como acima. Antes de filtrar, adicione os seguintes inibidores: Y-27632 com uma concentração final de 5 μM e A83-01 com uma concentração final de 0,5 μM. Filtre o meio através de um filtro de tamanho de poro de 0,22 μm.
      NOTA: Armazene os meios BLEAM-I, HBTEC e HBTEC-I a 4 °C, datados e rotulados, no escuro (embrulhados em papel alumínio) e aqueça apenas alíquotas do necessário (o prazo de validade é de 30 dias).
    4. HEPES/FBS: Adicione 500 mL de solução salina tamponada com HEPES e 88 mL de FBS (concentração final de 15%). Uma vez adicionada, filtrar a solução através de um filtro de poros de 0,22 μm e conservá-la a 4 °C, datada e rotulada.
      NOTA: Alíquota e aqueça BLEAM, HEPES-FBS e Tripsina-EDTA a 37 ° C (pelo menos 30 min) antes do uso.
  2. Frascos de cultura de revestimento e insertos de cultura de células ALI com um meio condicionado por 804G
    1. Prepare o meio condicionado à matriz da célula 804G (linha de células epiteliais da bexiga de rato) conforme descrito anteriormente39.
    2. Revestir o balão de cultura de células e as bulas de cultura de células com meios condicionados a 804G durante, pelo menos, 4 h na incubadora a 37 °C, CO2 a 5%. Consulte a Tabela 2 para as quantidades de meios necessárias para revestir diferentes frascos de cultura e inserções de cultura de células.

2. Isolamento e expansão de nTAECs e preparação para cultura subsequente de ALI

  1. Adquira aspirado traqueal fresco (aproximadamente 1 mL) durante a sucção de rotina do tubo endotraqueal de neonatos intubados e colete o aspirado em um coletor de muco. Se o volume aspirado for insuficiente para alcançar o coletor de muco, lave o cateter de sucção com 1-3 mL de solução salina estéril.
  2. Rotule a amostra e guarde-a em um saco de risco biológico no gelo.
    NOTA: As amostras podem ser armazenadas em gelo a 4 °C durante um máximo de 24 h. No entanto, o rendimento é maior com amostras frescas.
  3. Transporte a amostra da UTIN para o laboratório. Cubra um balão T25 com meio condicionado 804G e prepare para a inoculação da amostra no momento do transporte do aspirado traqueal para o laboratório.
  4. Remova a armadilha de muco do saco de risco biológico e limpe bem as superfícies externas com etanol 70% para evitar qualquer contaminação. Abra cuidadosamente a tampa do coletor de muco sob uma capa de cultura de células estéril.
  5. Diluir a amostra de aspirado traqueal com PBS estéril para 5 ml (para diluir o muco) e transferir todo o conteúdo para um tubo cónico de 50 ml.
  6. Centrifugar o tubo a 250 x g, 20 °C-23 °C durante 5 min e rejeitar o sobrenadante (incluindo o muco).
    NOTA: Todas as centrifugações aqui são feitas a 250 x g, 20 °C-23 °C por 5 min, a menos que especificado de outra forma.
  7. Ressuspenda o pellet em 5 mL de BLEAM-I.
  8. Remova o frasco T25 da incubadora e descarte o meio condicionado 804G antes de plaquear a amostra.
  9. Colocar a amostra no balão T25 e colocá-la na incubadora a 37 °C, CO2 a 5% (a seguir designada por passagem 0 ou P0).
  10. Troque a mídia com BLEAM-I 24 h após o revestimento para lavar as células soltas e, posteriormente, a cada 48 h.
    NOTA: Depois de processar a amostra de aspirado traqueal e incubá-la em meio BLEAM-I, as células em forma de cubóide aparecem 7 a 10 dias após o plaqueamento. Por volta de 3 semanas após o plaqueamento, as células estão densamente compactadas e requerem tripsinização para posterior passagem, expansão e armazenamento. As células de passagem precoce (P1 - P2) são colocadas em criotubos (2,5 x 106 células por 500 μL de meio de congelamento por criotubo) e armazenadas em nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo.
  11. Descongelar rapidamente as células congeladas a partir do azoto líquido num banho-maria a 37 °C e transferir a suspensão celular para um tubo estéril de tamanho adequado contendo BLEAM-I.
  12. Conte as células para determinar o número total e vivo de células utilizando uma coloração azul de tripano e um contador de células automatizado ou manual, conforme descrito anteriormente48. Diluir a suspensão celular com um volume adequado de BLEAM-I, de modo que a concentração final seja de 2,1 x 106 células em 15 ml de suspensão celular (para o balão T75).
    NOTA: Para um frasco T25, 0,7 x 106 células em 5 mL de suspensão celular são geralmente usadas para semeadura.
  13. Transferir a suspensão celular de 15 ml para um balão T75 e incubar durante a noite a 37 °C, 5% de CO2.
  14. Na manhã seguinte, troque a mídia com o novo BLEAM-I. Em seguida, troque a mídia por um novo BLEAM-I a cada 2 dias. Uma vez que as células estejam em torno de 80% -90%, elas estão prontas para serem tripsinizadas para cultura de LPA.
  15. Aplique 5 mL de tripsina-EDTA (T75) na monocamada celular.
    NOTA: Lembre-se de usar tripsina fresca. Evite usar tripsina que tenha sido aquecida várias vezes.
  16. Incubar o balão a 37 °C durante 5 minutos na incubadora. Em seguida, toque na lateral do frasco 8x-10x para desalojar as células. Verifique ao microscópio se as células foram desalojadas após a tripsinização. Se >50% das células permanecerem no frasco, lave com PBS 2x e repita a etapa de tripsinização com um tempo de incubação reduzido de 2-3 min.
  17. Pare a reação com 15 mL de HEPES-FBS e pipete para cima e para baixo 4x-5x. Transfira as células para um tubo estéril de tamanho apropriado e centrifugue a 250 x g por 5 min para pellet as células.
  18. Após a centrifugação, aspirar cuidadosamente o sobrenadante. Dissolva o pellet celular em 1 mL de BLEAM-I pipetando suavemente para cima e para baixo 5x-10x.
  19. Conte as células para determinar o número total e o número de células ativas. Diluir a suspensão celular com um volume adequado de BLEAM-I, de modo que a concentração final seja de 1 x 105 células vivas por 100 μl de suspensão celular.

3. Cultura ALI de nTAECs

NOTA: As pastilhas de cultura celular devem ser revestidas com meio condicionado a 804G e incubadas por pelo menos 4 h a 37 °C, 5% de CO2 antes da próxima etapa (consulte a etapa 1.2).

  1. Remova a(s) placa(s) de cultura de células de 24 poços contendo as inserções de cultura de células da incubadora e descarte o meio condicionado com 804G.
  2. Adicione 1 mL de BLEAM-I à câmara basolateral (inferior) de cada poço de LPA. Adicionar 100 μL de suspensão celular (1 x 105 células) à câmara apical das inserções de cultura de células ALI e incubar as células a 37 °C, 5% CO2. Este estágio é definido como ALI dia -2.
  3. No dia seguinte, troque o meio nas câmaras basolateral (1 mL) e apical (100 μL) com BLEAM-I novo. Ao trocar o meio na câmara apical, tome cuidado para não perturbar a monocamada da célula. Este estágio é definido como ALI dia -1.
  4. No dia seguinte, remova a mídia das câmaras basolateral e apical.
    NOTA: Leva 2 dias para que as células na membrana da cultura celular se tornem confluentes em condições submersas. Nesta fase, o ALI pode ser estabelecido.
  5. Adicione 1 mL de meio HBTEC-I à câmara basolateral, mas deixe o meio da câmara apical livre e exposto ao ar. Este estágio é definido como ALI dia 0.
  6. Continue a trocar o meio HBTEC-I (1 mL) na câmara basolateral a cada 48 h do dia 0 a 6 da LPA. Mude para o meio HBTEC regular (sem inibidores) no dia 7 do ALI até o ponto de colheita desejado.
    NOTA: Durante os primeiros 7 dias de cultura de LPA, a mídia da câmara basolateral pode vazar para a câmara apical. Este meio precisa ser aspirado cuidadosamente todos os dias para manter a saúde da camada celular e permitir que eles se diferenciem.
  7. Colher células, inserções de cultura de células e meios basolaterais em diferentes pontos de tempo para técnicas moleculares, ensaios e análises.
    1. Para este protocolo, nos dias 0, 7 e 28 da LPA, colher células para análise da expressão gênica de qPCR (protocolo padrão do fabricante) de marcadores de diferenciação epitelial. Nos dias 0, 7, 14 e 28 da LPA, colher inserções de cultura de células para testar a função de barreira (métodos descritos abaixo).
    2. Nos dias 0 e 28 da LPA, use insertos de cultura de células fixados em formalina para coloração imunofluorescente com marcadores de diferenciação epitelial (utilizando protocolo publicado anteriormente)49. No dia 14 da LPA, colha meio basolateral para liberação de lactato desidrogenase (LDH) (protocolo padrão do fabricante), lisados celulares para qPCR de marcadores de estresse oxidativo e immunoblot com anticorpos caspase-3 e caspase-3 clivada (protocolo padrão do fabricante) e inserções de cultura de células para ensaio de estresse oxidativo (método descrito abaixo).

4. Função de barreira de teste durante a diferenciação ALI

  1. Medição da resistência elétrica transepitelial (TEER)
    NOTA: Meça o TEER usando o medidor epitelial de volt/ohm (EVOM) durante a diferenciação do ALI para avaliar a integridade da camada celular50.
    1. Antes de medir os valores de resistência do filtro de teste, use uma cultura de células revestidas com meio condicionada por 804G (desprovida de células) para medir o valor da resistência de fundo em Ohms (Ω)
    2. Subtraia o valor da resistência de fundo dos valores de resistência do filtro de teste e multiplique a diferença pela área da superfície de crescimento da célula para obter o valor TEER para cada filtro de teste.
      TEER = (ΩT - ΩB) X C
      TEER = Resistência Elétrica Transepitelial (Ω.cm2)
      ΩT = Valor da resistência do filtro de teste (Ω)
      ΩB = Valor da resistência de fundo (Ω)
      C = Área de superfície de crescimento celular (cm2)
      NOTA: As inserções de cultura de células usadas para medições TEER são posteriormente fixadas com formalina tamponada a 10% e usadas imediatamente para coloração imunofluorescente e microscopia fluorescente (método descrito abaixo) ou armazenadas a 4 ° C para coloração posterior.
  2. Ensaio de permeabilidade epitelial de isetionato de fluoresceína dextrano (FITC-dextrano)
    NOTA: O ensaio de permeabilidade epitelial foi realizado utilizando dois pesos moleculares diferentes de FITC-dextrano (10 kD e 20 kD) durante a diferenciação de LPA.
    1. Prepare a solução de trabalho FITC-dextrano (1 mg/mL): meça 5 mg de FITC e misture 1 mL de DMSO (5 mg/mL). Ressuspenda o estoque de 5 mg / mL em meio HBTEC aquecido a 37 ° C a uma concentração de 1 mg / mL. Proteja a solução da luz.
    2. Transfira os filtros de teste (contendo células) para uma nova placa de 12 poços e adicione 1 mL de meio HBTEC no compartimento basolateral.
    3. Aspirar os meios do compartimento apical (se existirem) e substituí-los por 250 μL de solução de trabalho FITC-dextrana. Incubar à temperatura ambiente protegido da luz durante 60 min.
    4. Termine o ensaio FITC-dextrano removendo os filtros de teste (contendo a solução de trabalho FITC-dextrana) da placa de 12 poços.
    5. Colete o meio basolateral da placa de 12 poços em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL e vórtice.
    6. Transfira alíquotas de 100 μL de cada tubo para uma microplaca de poliestireno preto de fundo transparente de 96 poços em triplicatas. Transfira 100 μL de meio HBTEC para poços adicionais na placa de 96 poços como um controle negativo para medir a fluorescência de fundo.
    7. Meça a intensidade de fluorescência usando um espectrofotômetro usando excitação de 490 nm e 520 nm de emissão máxima.
    8. Subtraia o valor médio de fluorescência de fundo dos valores de fluorescência do filtro de ensaio para obter a fluorescência corrigida e expresse os valores em percentagem em relação aos valores de fluorescência corrigidos no dia 0 do ALI para FITC 10 kD e 20 kD.

5. Exposição à hiperóxia usando incubadora TriGas

  1. No dia 7 do ALI, determine o número de inserções de cultura de células a serem colocadas em hiperóxia com base nas necessidades experimentais e de colheita.
  2. Defina o nível de O2 na incubadora TriGas para 60% O2. Geralmente, leva ~ 30-45 min para o nível de O2 atingir 60%.
  3. Assim que o nível de O2 se estabilizar em 60%, coloque a placa de cultura de células de 24 poços com as inserções de cultura de células atribuídas ao grupo de hiperóxia dentro da incubadora e feche a porta da incubadora.
    NOTA: Esta etapa precisa ser executada da forma mais eficiente possível para evitar uma queda significativa no nível de O2 dentro da incubadora.
  4. Troque o meio nas inserções de cultura de células expostas à hiperóxia seguindo o mesmo cronograma dos poços de controle (21% O2 expostos). Verifique as inserções de cultura de células todos os dias quanto a vazamento de mídia e aspire suavemente qualquer vazamento para a câmara de cultura de células.
  5. Continue a exposição à hiperóxia por 7 dias (dias 7 a 14 da LPA). Assim que a exposição à hiperóxia for concluída, colha células ou realize ensaios utilizando inserções de cultura de células no dia 14 da LPA.

6. Ensaio de estresse oxidativo para avaliar os efeitos da hiperóxia

NOTA: Usamos o kit de ensaio CM-H2DCFDA e medimos a intensidade de fluorescência no dia 14 da LPA como um marcador de estresse oxidativo em inserções de cultura de células após a exposição aoO2 . H2DCFDA é uma forma quimicamente reduzida e acetilada de 2 ',7 '-diclorofluoresceína (DCF), que é um indicador permeável de células vivas de espécies reativas de oxigênio (ROS). CM-H2DCFDA é o derivado clorometil reativo ao tiol do H2DCFDA, que promove uma ligação covalente adicional aos componentes intracelulares, permitindo uma retenção mais longa do corante dentro da célula. Essas moléculas não são fluorescentes até que os grupos acetato sejam removidos pela ação de esterases intracelulares, e a oxidação ocorra na célula51. Após a oxidação intracelular, o aumento resultante na fluorescência pode ser medido com um microscópio fluorescente como uma medida substituta do estresse oxidativo celular52. O reagente é leve e sensível ao ar e, portanto, precisa ser protegido da luz e mantido hermético o máximo possível.

  1. Preparação da solução de ensaio CM-H2DCFDA: Cada frasco contém 50 μg de corante reagente em pó. Para fazer uma solução estoque de 1 mM, adicione 80 μL de DMSO estéril ao frasco, misture bem com uma pipeta e vortex suavemente. Para concentração final de 1 μM do corante em insertos de cultura de células, adicione 0,1 μL do estoque de 1 mM por 100 μL de PBS (por exemplo, adicione 0,6 μL de solução estoque a 600 μL de PBS para 6 insertos de cultura de células).
    NOTA: A concentração final do corante pode variar entre 1-5 μM. A dose precisa ser otimizada para cada condição de cultura.
  2. Adicione 100 μL da solução de corante 1 μM em cada cultura de células para o grupo exposto à hiperóxia ou exposto à normóxia. Use pelo menos 1 cultura de células como controle negativo de cada grupo de tratamento (100 μL de PBS sem corante). Incubar a 37 °C durante 30 min, protegido da luz. Lave 1x com PBS.
  3. Preparação da lâmina: Drene o excesso de PBS. Segure cuidadosamente as inserções de cultura de células e use uma lâmina para cortar lentamente a membrana de cultura de células. Despeje 1-2 gotas de líquido mountant no slide. Com pinças de ponta plana, segure cuidadosamente o canto da membrana, coloque-o com o lado da célula voltado para baixo no suporte e cubra-o com uma lamínula. Remova o excesso de líquido do montante e deixe secar ao ar por 15 min em temperatura ambiente protegido da luz. Os slides agora estão prontos para serem fotografados.
    NOTA: A preparação da lâmina e da microscopia fluorescente deve ser realizada o mais rápido possível, pois a intensidade fluorescente diminui significativamente ao longo de 2-3 h.
  4. Microscopia fluorescente: Capture imagens usando um microscópio fluorescente utilizando o canal Cy2 (cianina-2). Capture imagens de três áreas separadas e não sobrepostas por cultura de células.
  5. Detecção fluorescente de estresse oxidativo
    NOTA: Use as imagens da microscopia fluorescente para medir a fluorescência total da célula corrigida (CTCF) utilizando o software ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) e o fluxo de trabalho descrito abaixo. O CTCF serve como um marcador de estresse oxidativo nas inserções da cultura de células após a exposição à hiperóxia e é medido eliminando a fluorescência de fundo com a ajuda do software ImageJ.
    1. Abra a imagem de microscopia no ImageJ e selecione a área de interesse usando a ferramenta retângulo. Salve a área de seleção (α) clicando com o botão direito do mouse e selecione Adicionar ao gerenciador de ROI (região de interesse). Use esta área de seleção nas imagens.
    2. Selecione os parâmetros para medição em Analisar > Definir Medições e selecione Área, Densidade Integrada e Valor Médio de Cinza na guia de configurações.
    3. Para cada imagem, use a mesma área de seleção do gerenciador de ROI e selecione Analisar > Medir. O valor de densidade integrado representa a fluorescência total (Ft) da área selecionada. Anote os valores de medição na janela pop-up.
    4. Para corrigir a fluorescência de fundo (Fb) em cada imagem, selecione uma pequena área de região não fluorescente com a ferramenta retângulo. Selecione Analisar > Medir para esta região. O valor médio da intensidade representa Fb. Anote os valores de medição na janela pop-up.
    5. Calcule o CTCF multiplicando a intensidade média de fluorescência das leituras de fundo pela área total do ROI e subtraindo esse número do valor de densidade integrado do ROI. Repita esse fluxo de trabalho para todas as imagens de ambos os grupos de tratamento (Controle e Hiperóxia).
      CTCF = Ft - (Fb x α)
      CTCF = Fluorescência total de células corrigida (UA)
      Ft = Fluorescência total
      Fb = Fluorescência de fundo
      α = Área de seleção

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Resultados

Para isolar os nTAECs, coletamos aspirados traqueais de neonatos intubados na UTIN e transportamos os aspirados em gelo para o laboratório para processamento posterior (Figura 1A). Após a semeadura das amostras de aspirado traqueal em meio de crescimento epitelial das vias aéreas (BLEAM-I contendo inibidores de Rho/Smad, GSK3 e mTOR), as células cuboidais apareceram dentro de 7 a 10 dias. Aos 14 dias, as células estavam...

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Discussão

O protocolo aqui descrito detalha um método para a coleta e processamento de amostras de aspirado traqueal neonatal de neonatos intubados na UTIN, com posterior isolamento e expansão de nTAECs vivos dessas amostras usando métodos previamente estabelecidos39. Além disso, descrevemos um método para cultivar nTAECs em LPA e caracterizar sua diferenciação em um epitélio mucociliar polarizado das vias aéreas em função do tempo por meio da medição de TEER, ...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar e nenhum conflito de interesse a relatar.

Agradecimentos

Este trabalho é apoiado por financiamento da Presbyterian Health Foundation (PHF) e Oklahoma Shared Clinical and Translational Resources (U54GM104938 com um Prêmio de Desenvolvimento Institucional (IDeA) do NIGMS) para AG. Gostaríamos de agradecer ao Dr. Paul LeRou e ao Dr. Xingbin Ai do Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, por fornecerem células de doadores neonatais usadas em alguns dos experimentos. As figuras foram criadas com Biorender. A análise estatística foi realizada com o GraphPad Prism.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
10% Buffered FormalinFisher Scientific23-426796
1X PBS (Phosphate Buffered Saline) Solution, pH 7.4Gibco10010049
A 83-01Tocris29-391-0
ALI Transwell Inserts, 6.5mmCorning3470
Anti-Acetylated Tubulin antibody, Mouse monoclonalSigmaT7451
Anti-alpha Tubulin antibodyAbcamab7291
Anti-Cytokeratin 5 antibodyAbcamab53121
BronchiaLife Epithelial Airway Medium (BLEAM)LifeLine Cell TechnologyLL-0023
CHIR 99021Tocris44-231-0
Cleaved caspase-3 antibodyCell signaling9664T
SCGB1A1 or Club Cell Protein (CC16) Human, Rabbit Polyclonal AntibodyBioVendor R&DRD181022220-01
CM-H2DCFDA (General Oxidative Stress Indicator)Thermo ScientificC6827
Corning Cell Culture Treated T25 FlasksCorning430639
Corning U-Shaped Cell Culture T75 FlasksCorning430641U
CyQUANT LDH Cytotoxicity AssayThermo ScientificC20300
DAPI Solution (1 mg/mL)Fisher ScientificEN62248
Dimethyl sulfoxide [DMSO] Hybri-MaxSigmaD2650
Distilled waterGibco15230162
EVOM Manual for TEER MeasurementWorld Precision InstrumentEVM-MT-03-01
FBS (Fetal Bovine Serum)Gibco10082147
Fluorescein Isothiocyanate Dextran (average mol wt 10,000)Fisher ScientificF0918100MG
Fluorescein isothiocyanate–dextran (average mol wt 20,00)SigmaFD20-100MG
Goat Anti-Mouse IgG(H+L), Human ads-HRPSouthern Biotech1031-05
Goat anti-Mouse IgG2b Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488InvitrogenA-21141
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546InvitrogenA-11035
Goat Anti-Rabbit IgG(H+L), Mouse/Human ads-HRPSouthern Biotech4050-05
HBTEC Air-Liquid Interface (ALI) Differentiation MediumLifeLine Cell TechnologyLM-0050
HEPESLonzaCC-5024
Heracell VIOS 160i Tri-Gas CO2 Incubator, 165 LThermo Scientific51030411
High-Capacity cDNA Reverse Transcription KitThermo Scientific4368814
HLL supplementLifeLine Cell TechnologyLS-1001
ImageJNIHN/Aimagej.nih.gov/ij/
Invivogen Normocin - Antimicrobial ReagentFisher ScientificNC9273499
L-GlutamineLifeLine Cell TechnologyLS-1013
Normal Goat SerumGibcoPCN5000
NormocinInvivogenant-nr-05
p63 antibodySanta Cruz Biotechnologysc-25268
ProLong Gold Antifade MountantInvitrogenP36930
PureLink RNA Mini KitThermo Scientific12183025
RAPAMYCINThermo ScientificAAJ62473MC
TaqMan Fast Advanced Master MixThermo Scientific4444964
Taqman Gene Exression Assays: 18S rRNAThermo ScientificHs99999901_s1
Taqman Gene Exression Assays: CATThermo ScientificHs00156308_m1
Taqman Gene Exression Assays: FOXJ1Thermo ScientificHs00230964_m1
Taqman Gene Exression Assays: GAPDHThermo ScientificHs02786624_g1
Taqman Gene Exression Assays: GPX1Thermo ScientificHs00829989_gH
Taqman Gene Exression Assays: GPX2Thermo ScientificHs01591589_m1
Taqman Gene Exression Assays: GPX3Thermo ScientificHs01078668_m1
Taqman Gene Exression Assays: KRT5Thermo ScientificHs00361185_m1
Taqman Gene Exression Assays: MUC5ACThermo ScientificHs01365616_m1
Taqman Gene Exression Assays: SCGB1A1Thermo ScientificHs00171092_m1
Taqman Gene Exression Assays: SOD1Thermo ScientificHs00533490_m1
Taqman Gene Exression Assays: SOD2Thermo ScientificHs00167309_m1
Thermo Scientific Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane (0.22 μm pores, 500 ml)Thermo Scientific5660020
TM-1 Combined SupplementLifeLine Cell TechnologyLS-1055
Total caspase-3 antibodyCell signaling14220S
Triton X-100Sigma9036-19-5
Trypsin-EDTA (0.05%), Phenol redGibco25300062
Y-27632 2 HClTocris12-541-0

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