Modelagem de cirurgia de catarata em camundongos

Resumo

Este método modela a cirurgia de catarata in vivo , removendo as células da fibra do cristalino de camundongos adultos e deixando para trás a bolsa capsular com células epiteliais do cristalino (LECs) anexadas. A resposta à lesão é então avaliada em vários momentos após a cirurgia usando critérios moleculares e morfológicos.

Resumo

A cirurgia de catarata (CS) é um tratamento eficaz para a catarata, uma das principais causas de deficiência visual em todo o mundo. No entanto, a SC leva à inflamação ocular e, a longo prazo, pode resultar em opacificação capsular posterior (PCO) e/ou luxação do cristalino impulsionada pelo crescimento excessivo pós-cirúrgico de células epiteliais do cristalino (LECs) e sua conversão em miofibroblastos e/ou células de fibra aberrantes. No entanto, os mecanismos moleculares pelos quais a CS resulta em inflamação e PCO ainda são obscuros porque a maioria dos modelos in vitro não recapitula a resposta de cicatrização de feridas de LECs vistos in vivo, enquanto modelos animais tradicionais de cirurgia de catarata, como coelhos, não permitem a manipulação genética da expressão gênica para testar mecanismos. Recentemente, nosso laboratório e outros usaram com sucesso camundongos geneticamente modificados para estudar os mecanismos moleculares que impulsionam a indução de sinalização pró-inflamatória e transição epitelial para mesenquimal do LEC, levando a uma nova visão sobre a patogênese da PCO. Aqui, relatamos o protocolo estabelecido para modelagem de cirurgia de catarata em camundongos, que permite um perfil transcricional robusto da resposta de LECs à remoção de células de fibra de cristalino via RNAseq, a avaliação da expressão de proteínas por imunofluorescência semiquantitativa e o uso de ferramentas genéticas modernas de camundongos para testar a função de genes que supostamente participam da patogênese de sequelas agudas como inflamação, bem como a conversão posterior de LECs em miofibroblastos e/ou células de fibra de lente aberrantes.

Introdução

A lente é um tecido transparente e altamente organizado que refrata a luz para produzir uma imagem claramente focada na retina ^1,2,3. Este órgão especializado é cercado por uma membrana basal ininterrupta (a cápsula), que isola o cristalino de outras partes do olho. A superfície anterior interna da cápsula ancora uma monocamada de células epiteliais do cristalino (LECs), que então se diferenciam no equador do cristalino em células de fibra do cristalino, que compreendem a grande maioria do cristalino³. A catarata ocorre quando o cristalino perde sua transparência devido a fatores como envelhecimento, mutação genética, radiação UV, estresse oxidativo e trauma ocular⁴. A catarata é uma das principais causas de cegueira em todo o mundo, particularmente em países com cuidados médicos precários⁵. No entanto, essa condição agora é prontamente tratada pela remoção cirúrgica de células opacas do cristalino por facoemulsificação, na qual a cápsula central do cristalino e o epitélio do cristalino anexados são removidos, seguido pelo uso de uma sonda vibratória para quebrar a massa celular do cristalino em fragmentos menores que podem ser aspirados; deixando para trás uma bolsa capsular com alguns LECs equatoriais anexados¹. A visão é então mais comumente restaurada pelo implante pós-cirúrgico de uma lente intraocular artificial (LIO).

Embora a cirurgia de catarata (CS) seja um tratamento altamente eficaz e minimamente invasivo para a catarata, a recuperação pós-cirúrgica de um paciente pode ser prejudicada pelo desenvolvimento de inflamação ocular ^5,6,8. Essa inflamação pode causar dor pós-cirúrgica, edema retiniano levando ao descolamento de retina, bem como exacerbação de outras condições inflamatórias e fibróticas, como uveíte e glaucoma 4,7,8,9. A inflamação ocular pós-SC (PCS) é geralmente tratada com colírios anti-inflamatórios, que são atormentados pela má adesão do paciente ou cirurgia de catarata sem gotas que pode levar a um aumento da prevalência de moscas volantes ^8,10,11. A longo prazo, os resultados da SC podem ser comprometidos pelo desenvolvimento de opacificação capsular posterior (PCO)¹². A PCO ocorre quando os LECs residuais deixados para trás após a cirurgia sofrem uma resposta de cicatrização de feridas, proliferam e migram para a cápsula posterior do cristalino em meses a anos PCS contribuindo para a obstrução visual secundária^13,14.

Compreender os mecanismos moleculares pelos quais a SC resulta em tais respostas agudas e crônicas representa um grande desafio na área, pois grande parte da literatura que investiga a PCO depende da indução da conversão do LEC em miofibroblastos em cultura por meio do tratamento com fator de crescimento transformador ativo beta (TGFβ)^12,15. Os modelos de bolsas capsulares humanas criados a partir de lentes de cadáveres cultivadas in vitro refletem melhor a biologia do PCS do cristalino, pois os LECs são cultivados em sua membrana basal nativa, mas são difíceis de manipular mecanicamente, não recapitulam o ambiente intraocular e são inerentemente variáveis devido à variabilidade lente a lente (ou doador para doador)^{16 , 17}. Modelos in vivo de cirurgia de catarata em coelhos ^1,18 e primatas não humanos^19,20 superam alguns desses problemas, mas ainda não são fáceis de manipular para estudos mecanicistas. Notavelmente, um estudo anterior de regeneração do cristalino de mamíferos encontrou regeneração significativa do cristalino dentro de quatro semanas após as células da fibra do cristalino serem removidas de camundongos, deixando as células epiteliais e a cápsula do cristalino para trás, enquanto nenhum crescimento do cristalino ocorreu quando todo o cristalino foi removido^21,22. Posteriormente, simplificamos esse procedimento e o otimizamos para o estudo da resposta aguda dos LECs à remoção das células das fibras do cristalino e sua subsequente conversão em uma população mista de células com propriedades de miofibroblastos e células de fibra. 

Usando este modelo de camundongo de cirurgia de catarata, mostramos que as células epiteliais do cristalino remodelam drasticamente seu transcriptoma em 6 horas PCS para produzir numerosas citocinas pró-inflamatórias²³, enquanto começam a expressar marcadores fibróticos já em 24 h PCS ^12,23, antes do início da sinalização canônica de TGFβ. Experimentos mecanísticos em camundongos knockout usando este modelo revelaram que a expressão celular de fibronectina por LECs é necessária para uma resposta fibrótica sustentada PCS, provavelmente devido ao seu papel na montagem da ECM fibrótica e na sinalização celular¹². Outros estudos mostraram que a αVβ8-integrina é necessária para a transição de LECs para miofibroblastos devido à sua função na ativação do TGFβ, e o potencial dessa abordagem para identificar eletrodos terapêuticos anti-PCO foi confirmado como um antagonista da integrina αVβ8 também bloqueou o LEC EMT¹⁵.

Aqui, fornecemos um protocolo detalhado descrevendo como remover as células de fibra do cristalino de camundongos vivos (Figura 1e Figura 4), deixando para trás a cápsula do cristalino e os LECs para modelar a resposta do LEC à cirurgia de catarata.

Protocolo

O protocolo a seguir foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Delaware sob o protocolo #1039-2021-1. Em conformidade com a Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research²⁴, todas as cirurgias de sobrevivência ocular só podem ser realizadas em um olho. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre reagentes e instrumentos usados neste protocolo. Abordagens alternativas para extração das fibras do cristalino e sutura são mostradas na Figura 2 e na Figura 3.

1. Animais

1. Use qualquer cepa de camundongo de laboratório do tipo selvagem ou geneticamente modificada que tenha olhos com lentes intactas para este procedimento.
   1. Use camundongos C57BL / 6 como ponto de partida, pois suas respostas são altamente reprodutíveis nos níveis morfológico e molecular^25,26.
      NOTA: C57BL / 6 ou qualquer cepa de mouse pode ser usada. No protocolo de vídeo, o mouse FVB é usado para melhor demonstração visual.
   2. Realize estudos da resposta de mutantes em outras cepas de camundongos com controles pareados por cepas.
      NOTA: Com a prática, este procedimento pode ser realizado em camundongos cujas lentes tenham catarata, desde que a cápsula da lente esteja intacta e a lente não tenha sofrido liquefação significativa. Veja o estudo de camundongos com deleção condicional do cristalino do fator de transcrição Sip1²⁷.
2. Realize esta cirurgia em camundongos de ambos os sexos de 8 semanas a 24 meses^25,26.
   1. Realize esta cirurgia em camundongos ainda mais jovens (após a abertura das pálpebras) com a prática, embora seja mais difícil, pois esses olhos serão significativamente menores.
   2. Tome cuidado especial com cirurgias em camundongos idosos devido à sua menor tolerância à anestesia^25,26.
      NOTA: As diferenças sexuais nas respostas à cirurgia são mais prevalentes em camundongos idosos²⁶.

2. Preparação de soluções e ferramentas cirúrgicas

1. Obtenha agentes anestésicos e analgésicos, gotas de dilatação, bisturi descartável estéril, pinça Dumont #5, pinça de sutura 2-110, agulhas (ponta dispensadora dobrada 26 G 1/2 e 27 G 45° 1"), seringas e solução salina balanceada (BSS).
2. Esterilize os instrumentos cirúrgicos em autoclave.

3. Antes da anestesia

1. Antes da anestesia, dê ao camundongo uma gota de atropina a 1% e fenilefrina a 2,5% para dilatar a pupila (ver Figura 1A) do olho submetido à cirurgia. Aplique pomada oftálmica no olho não operado para evitar que a superfície seque.
   NOTA: A declaração ARVO sobre o uso de animais em pesquisas oftalmológicas²⁴ permite que um único olho seja submetido a uma cirurgia de sobrevivência, deixando o outro olho intocado para que o animal mantenha a visão. Assim, as cirurgias de sobrevivência são sempre unilaterais; no entanto, o olho contralateral não operado pode ser operado pouco antes do sacrifício para criar controles de 'tempo zero' compatíveis com os animais.
2. Certifique-se de que o colírio não escorra pelo rosto do rato e entre no nariz, pois isso pode obstruir sua respiração.
3. Prepare uma seringa com BSS estéril usando uma agulha estéril de 26 G 1/2. Encaixe a seringa com uma ponta de distribuição sem corte dobrada estéril de 27 G 45° de 1 polegada (referida como ponta de distribuição abaixo).

4. Anestesia

1. Após o colírio, anestesiar o camundongo com uma injeção intraperitoneal de solução de xilazina / cetamina / acepromazina (35 mg / kg, 80 mg / kg e 0,5 mg / kg) (Figura 1B).
   NOTA: A anestesia inalatória pode não ser possível, a menos que um cone nasal especializado possa ser utilizado para permitir o acesso ao olho necessário para a cirurgia.

5. Fazendo a incisão

1. Uma vez que o camundongo esteja completamente sob anestesia, conforme medido pela falta de reflexo de pinça do dedo do pé, e sua pupila tenha dilatado completamente (2 mm) (Figura 4A), o camundongo está pronto para a cirurgia.
   1. Mova o mouse anestesiado para o estágio de um microscópio óptico de dissecação composto. Use uma almofada de aquecimento para garantir que o mouse tenha regulação térmica adequada e use cortinas estéreis.
   2. View o olho com ampliação de 10x-20x usando um microscópio de dissecação (consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes).
2. Faça uma incisão de 1-1,5 mm no centro da córnea usando um bisturi cirúrgico estéril. Certifique-se de que a incisão se estende através da córnea e incisa na cápsula anterior do cristalino (Figura 1C e Figura 4B).

6. Separando as fibras da lente da bolsa capsular

1. Segure a seringa com uma ponta dispensadora contendo BSS estéril e expulse suavemente 1 gota de BSS acima da córnea para molhar a superfície para posterior manipulação.
2. Separe a massa de fibra da lente da cápsula da lente.
   1. Insira a ponta dispensadora através da incisão central da córnea na incisão da cápsula da lente e, em seguida, mova suavemente a agulha em movimentos circulares enquanto libera lentamente o BSS para separar as conexões apical-apicais entre as células epiteliais e de fibra da lente (hidrodissecção), expelindo a massa de fibra da lente (Figura 1D).
   2. Na maioria dos casos, a massa da fibra acabará aderindo à ponta dispensadora durante este procedimento (Figura 2A). Se isso acontecer, remova cuidadosamente a ponta de distribuição do olho interno; e limpe com uma toalha estéril para remover esse tecido. Repita até que todas as células de fibra da lente sejam removidas.
   3. Alternativamente, use microfórceps (número 5 Dumont) para extrair o núcleo do cristalino (Figura 2B). Se estiver usando este método, tome cuidado para que a incisão original da córnea exceda o diâmetro do núcleo para garantir uma fácil remoção.
3. Enxágue a cápsula da lente com BSS estéril para remover quaisquer fibras restantes.
4. Confirme se a cápsula da lente foi deixada dentro do olho (Figura 1E e Figura 4C) visualizando sua aparência translúcida/vítrea através do microscópio.

7. Inflar a câmara anterior e suturar a incisão da córnea

1. Infle a câmara anterior até sua profundidade normal injetando BSS através da incisão na câmara anterior.
   1. Adicione inibidores ou ativadores de vias de sinalização de interesse ao BSS para testar seus papéis na resposta à lesão do cristalino^12,15.
      NOTA: Os animais também podem ser tratados sistemicamente com inibidores da via, que podem ser necessários dependendo da farmacocinética da renovação do medicamento, pois o equilíbrio do humor aquoso é restabelecido após a cirurgia¹⁵.
2. Suturar a incisão da córnea com nós quadrados usando fio de náilon 10-0 com uma agulha cônica e curva de 5,3 mm 1/2c (Figura 1F e Figura 4D-F).
   1. Coloque um ponto de nó quadrado na parte central da incisão ou dois pontos de nó quadrado nas metades superior e inferior da incisão original (veja a Figura 3). O número de pontos depende do comprimento da incisão da córnea.
   2. Não perfure os dois retalhos da córnea ao mesmo tempo. Em vez disso, segure um retalho de córnea usando uma pinça na mão não dominante e empurre a agulha/náilon. Depois que um lado da córnea for perfurado, empurre a agulha/náilon pelo próximo retalho da córnea. Feche as abas da córnea usando pontos de nó quadrado.

8. Cuidados pós-cirúrgicos

NOTA: A pomada antibiótica tópica é aplicada no olho e agentes analgésicos são administrados. Os camundongos geralmente não mostram sinais de angústia após a cirurgia inicial. Se necessário, a versão de liberação lenta da buprenorfina pode ser usada.

1. Imediatamente após esta cirurgia, execute as seguintes subetapas.
   1. Aplique uma gota de pomada oftálmica com eritromicina a 0,5% diretamente acima da sutura. Certifique-se de que toda a incisão esteja coberta de pomada.
   2. Administre uma injeção intraperitoneal de buprenorfina (0,1 mg / kg).
2. Permita que o mouse se recupere da anestesia em uma gaiola colocada em uma almofada de aquecimento para otimizar o suporte térmico.
   NOTA: Monitore o animal em busca de sinais de trauma, angústia ou desconforto. Alguns sinais incluem infecção/coceira no local da cirurgia, sutura deslocada, perda de pelos, etc.

9. Acompanhamento da recuperação dos animais

1. Monitore a recuperação do animal após a cirurgia até que ele acorde da anestesia.
2. Verifique os ratos todos os dias durante os primeiros 3 dias após a cirurgia.
   NOTA: Geralmente não é necessário remover os pontos porque os ratos são sacrificados antes da cicatrização completa (2 semanas PCS) ou os pontos caem espontaneamente.
3. Administre buprenorfina por via oral, conforme necessário para o controle da dor após 4-8 h após a cirurgia, na dose de 0,5 mg / kg (em gelatina) ou na dose de 0,1 mg / kg para quem não come. Como alternativa, administre buprenorfina de liberação prolongada imediatamente antes da cirurgia.
   NOTA: Quando possível, analgésicos preemptivos devem ser utilizados, mas isso pode exigir ajustes no protocolo analgésico que requerem revisão e aprovação do comitê institucional de cuidados e uso de animais.

10. Eutanásia

1. Eutanásia do camundongo no momento desejado após a cirurgia
   1. Removido o olho operado usando o olho não operado como tecido controle; ou reanestesiar o animal, realizar a cirurgia de remoção de células de fibra do cristalino no olho contralateral não operado anteriormente e, em seguida, sacrificar imediatamente o animal (sem permitir que ele acorde da anestesia) para fornecer um controle operado no tempo zero.
   2. Garanta uma dissecção rápida e colheita de tecido.
      NOTA: Os LECs sofrem alterações transcriptômicas minutos após a cirurgia, portanto, a coleta rápida de tecido e a fixação/congelamento são necessários ao estudar as respostas precoces do LEC à cirurgia.

11. Realização de análises adicionais em tecidos de lentes colhidos

1. Use o tecido obtido para imunocoloração, sequenciamento de RNA, cultura de células ou análise ocidental 12,15,23,25,26,28. A citometria de fluxo também é teoricamente possível¹², embora o pequeno número de LECs na lente do camundongo (~ 40.000) ²⁹ e a presença de detritos celulares associados à cápsula após a cirurgia tornem isso um desafio.
2. Imunocoloração
   1. Eutanasiar o camundongo em uma câmara por inalação de CO₂ (4 L/min) de um cilindro de gás. Aumente a taxa de fluxo para 8-10 L / min quando o mouse estiver inconsciente e continue essa exposição até a cessação completa da respiração mais 1 min.
      NOTA: O camundongo pode ser sacrificado usando um método apropriado de acordo com as Diretrizes da AVMA para a Eutanásia de Animais ou de acordo com as diretrizes ou políticas aprovadas pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais.
   2. Garanta o sacrifício adequado empregando um método secundário de eutanásia, por exemplo, luxação cervical.
      NOTA: O laboratório Duncan investigou pontos de tempo que variam de minutos a meses PCS 12,15,23.
   3. Depois que o camundongo tiver sido sacrificado humanamente, isole o olho operado para análise.
      1. Segure a micropinça na mão não dominante para segurar o olho operado enquanto segura a microtesoura na mão dominante.
      2. Corte suavemente o nervo óptico e os músculos que ancoram o olho.
         NOTA: Tenha um cuidado especial ao manusear os olhos que foram operados recentemente versus aqueles que tiveram mais tempo para cicatrizar a PCS. Os olhos operados recentemente são mais frágeis estruturalmente.
   4. Incorporar o olho dissecado em meio OCT para posterior criosecção, imunomarcação e microscopia confocal semiquantitativa^28,30.
3. Isolamento da bolsa capsular com células associadas para sequenciamento de RNA, cultura de células ou análise de western blot
   1. Eutanasiar o camundongo em uma câmara por inalação de CO₂ (4 L/min) de um cilindro de gás. Aumente a taxa de fluxo para 8-10 L / min quando o mouse estiver inconsciente e continue essa exposição até a cessação completa da respiração mais 1 min.
   2. Garanta o sacrifício adequado empregando um método secundário de eutanásia, por exemplo, luxação cervical.
   3. Se for necessário um PCS de ponto de tempo inicial (dentro de 1-2 dias), remova os pontos antes da extração do tecido ou faça outra incisão na córnea para extrair a cápsula do cristalino.
      NOTA: Em momentos posteriores do PCS, os pontos provavelmente terão caído, portanto, uma nova incisão será necessária.
4. Localize a cápsula da lente translúcida.
   1. Insira suavemente a micropinça através da abertura da córnea, segure a cápsula e remova-a da câmara anterior.
   2. Coloque a cápsula em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL ou em uma placa de cultura para análise posterior.

Resultados

Com base nos resultados deste método cirúrgico, o Duncan Lab usou este modelo de camundongo de cirurgia de catarata para construir um curso de tempo de resposta à lesão das células epiteliais do cristalino pós-cirurgia (Figura 5). Às 6 h após a cirurgia, 5% do transcriptoma epitelial do cristalino é diferencialmente expresso (Figura 6A), incluindo a regulação positiva de vários genes de resposta precoce imediata e ci...

Discussão

Esta técnica cirúrgica requer manuseio avançado de camundongos e habilidades microcirúrgicas que exigem prática para se desenvolver. O mais difícil de dominar é a colocação de suturas finas na córnea para fechar a ferida. Suponha que o experimentador seja um novato total em sutura. Nesse caso, recomenda-se primeiro praticar o uso de barbante e pano e, em seguida, passar a praticar o uso de suturas de grande diâmetro em frutas pequenas para dominar os movimentos manuais necess?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% Erythryomycin opthalmic ointment USP	Baush Lomb	24208-910-55
1% Atropine sulfate ophthalmic solution	Amneal	60219-1748-2
1% Tropicamide opthalmic solution USP	Akorn	17478-102-12
10-0 Nylon suture	Ethicon	7707G
2.5% Phenylephrine hydrochloride ophtahlmic solution USP	Akorn	17478-200-12
26 G 1/2 Needles - straight	BD PrecisionGlide	5111
27 G 45° bent dispensing tip 1"	Harfington
Balanced saline solution	Phoenix	57319-555-06
Bupranorphine (0.1 mg/kg)	APP Pharmaceticals	401730D
Chlorhexidine solution
Needle holder 2-110	Duckworth & Kent	2-110-3E
Noyes scissors, straight	Fine Science Tools	12060-02
SMZ800 Nikon model microscope	Nikon
Sterile disposable scalpel No.11	Feather	2975#11
Tweezers #5 Dumont	Electron Microscopy Sciences	72700-D
Xylazine/Ketamine/Acepromazine (35 mg/kg, 80 mg/kg, 0.5 mg/kg) solution	APP Pharmaceticals	401730D