Fabricação e caracterização de organoides de câncer colorretal da linha celular SW1222 em matriz peptídica de automontagem ultracurta

Resumo

Este protocolo tem como objetivo avaliar peptídeos biofuncionais de automontagem quanto à adesão celular, morfologia organoide e expressão gênica por imunocoloração. Usaremos uma linha celular de câncer colorretal para fornecer uma maneira econômica de obter organoides para testes intensivos.

Resumo

Peptídeos de automontagem ultracurtos (SAPs) podem formar espontaneamente nanofibras que se assemelham à matriz extracelular. Essas fibras permitem a formação de hidrogéis biocompatíveis, biodegradáveis e não imunogênicos. Provamos anteriormente que os SAPs, quando biofuncionalizados com motivos derivados de proteínas, podem imitar as características da matriz extracelular que suportam a formação de organoides colorretais. Esses hidrogéis de peptídeos biofuncionais retêm as propriedades mecânicas, a capacidade de ajuste e a capacidade de impressão do peptídeo original original, ao mesmo tempo em que incorporam pistas que permitem que as interações célula-matriz aumentem a adesão celular. Este artigo apresenta os protocolos necessários para avaliar e caracterizar os efeitos de vários hidrogéis peptídicos biofuncionais na adesão celular e na formação do lúmen usando uma linhagem de células cancerígenas de adenocarcinoma capaz de formar organoides de câncer colorretal de forma econômica. Esses protocolos ajudarão a avaliar os efeitos do hidrogel de peptídeo biofuncional na adesão celular e na formação luminal usando imunocoloração e análise de imagem de fluorescência. A linhagem celular utilizada neste estudo foi previamente utilizada para geração de organoides em matrizes derivadas de animais.

Introdução

Nos últimos anos, os peptídeos automontáveis (SAPs) surgiram como biomateriais promissores para aplicações de engenharia de tecidos. Os SAPs possuem propriedades únicas, incluindo formação espontânea de nanofibras, biocompatibilidade, biodegradabilidade e não imunogenicidade, tornando-os candidatos atraentes para o desenvolvimento de andaimes¹. Os SAPs foram usados anteriormente em conjunto com vários tipos de células e, notavelmente, os SAPs ultracurtos relatados facilitaram o encapsulamento de células-tronco, mantendo sua pluripotência por períodos prolongados, abrangendo mais de 30 passagens e com incidência mínima de a....

Protocolo

1. Tampão e preparação da solução

NOTA: Todas as concentrações declaradas são concentrações finais.

1. Adicione soro fetal bovino (FBS) e penicilina-estreptomicina a uma concentração final de 10% e 1%, respectivamente, para preparar o meio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM). Conservar no escuro a 4 °C até 1 mês.
2. Misture MgCl₂ (3 mM), sacarose (300 mM) e Triton X-100 (0,5%) em tampão fosfato salino (PBS) para preparar o tampão de permeabilização. Conservar esta solução a 4 °C durante um período máximo de 2 meses.
3. Combine albumina de soro bovino (BSA, 1%), glicina (0,3 M) e Tween-20 ....

Discussão

O vasto potencial dos SAPs na pesquisa biomédica é ressaltado por sua maleabilidade e adaptabilidade por meio da biofuncionalização. Com uma gama tão extensa de permutações, surge o desafio de testar e determinar com eficiência as configurações mais promissoras para aplicações específicas, especialmente na pesquisa de organoides. Uma solução rápida e econômica é fundamental. A linhagem celular SW1222, derivada do adenocarcinoma colorretal humano, surge como uma candidata fundamental para essa avaliaçã.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Gibco	14190144
6-well plate, tissue culture treated	Corning	07-200-83
10x PBS, no calcium, no magnesium	Gibco	70011044
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free	Thermo Scientific	28906
24-well plate, tissue culture treated	Corning	09-761-146
96-well black plate, tissue culture treated	Corning	07-200-565
alamarBlue Cell Viability Reagent	Invitrogen	DAL1025
Anti-Ezrin antibody, rabbit monoclonal	Abcam	ab40839	Secondary used: anti-rabbit Dylight 633
Anti-pan Cadherin antibody, rabbit polyclonal	Abcam	ab16505	Secondary used: anti-rabbit Alexa 488
Anti-ZO1 tight junction antibody, goat polyclonal	Abcam	ab190085	Secondary used: anti-goat Alexa 488
BSA	Sigma-Aldrich	A9418
Cellpose 2.0	NA	NA	Obtained from https://github.com/MouseLand/cellpose
Confocal Laser Scanning Microscope with Airyscan	ZEISS	LSM 880
DAPI	Invitrogen	D1306
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11055
Glycine	Cytiva	GE17-1323-01
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11008
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight 633	Invitrogen	35562
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum (HI FBS)	Gibco	16140071
ImageJ 1.54f	NIH	NA
IMDM	Gibco	12440079
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells	Invitrogen	L3224
Magnesium Chloride, hexahydrate (MgCl2 6 H2O)	Sigma-Aldrich	M2393
Matrigel for Organoid Culture, phenol-red free	Corning	356255	Refered in the manuscript as Matrigel or basement membrane matrix.
Microscope, brightfield
Microscope, EVOS	Thermo Scientific	EVOS M7000
OriginPro 2023 (64-bit) 10.0.0.154	OriginLab Corp	NA
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122
Peptide P (Ac,Ile,Ile,Phe,Lys,NH2)	Lab-made	NA	Can be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem.
Peptide P1 (Ac, Ile, Ile, Phe, Lys, Gly, Gly, Gly, Arg, Gly, Asp, Ser, NH2)	Lab-made	NA	Can be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem.
Peptide P2 (Ac, Ile,Ile,Phe,Lys,Gly,Gly,Gly,Ile,Lys,Val,Ala,Val,NH2)	Lab-made	NA	Can be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem.
Rhodamine Phalloidin	Invitrogen	R415
Round Cover Slip, 10 mm diameter	VWR	631-0170
Scanning Electron Microscope	Thermo Fisher - FEI	TENEO VS
Sterile 30 μm strainer	Sysmex	04-004-2326
sucrose	Sigma-Aldrich	S1888
SW1222 cell line	ECACC	12022910
Triton x-100	Thermo Scientific	85111
Trypsin-EDTA 0.25%	Gibco	25200056
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379
UltraPure water	Invitrogen	10977015