Imagem Multiplexada de Células Vivas para Respostas a Drogas em Modelos de Câncer Organoides Derivados de Pacientes

Resumo

Organoides tumorais derivados de pacientes são um sofisticado sistema modelo para pesquisa básica e translacional. Este artigo de métodos detalha o uso de imagens de células vivas fluorescentes multiplexadas para avaliação cinética simultânea de diferentes fenótipos organoides.

Resumo

Modelos organoides derivados do paciente (DOP) de câncer são um sistema de pesquisa multifuncional que recapitula melhor a doença humana em comparação com linhagens de células cancerosas. Modelos de DOP podem ser gerados pela cultura de células tumorais de pacientes em extratos extracelulares da membrana basal (EMB) e plaqueando-os como cúpulas tridimensionais. No entanto, reagentes comercialmente disponíveis que foram otimizados para ensaios fenotípicos em culturas de monocamada muitas vezes não são compatíveis com EMB. Neste artigo, descrevemos um método para plaquear modelos de DOP e avaliar os efeitos de drogas usando um sistema automatizado de imagens de células vivas. Além disso, aplicamos corantes fluorescentes compatíveis com medidas cinéticas para quantificar a saúde celular e a apoptose simultaneamente. A captura de imagem pode ser personalizada para ocorrer em intervalos de tempo regulares ao longo de vários dias. Os usuários podem analisar os efeitos da droga em imagens individuais do plano Z ou uma projeção Z de imagens seriais de múltiplos planos focais. Usando mascaramento, parâmetros específicos de interesse são calculados, como número de DOP, área e intensidade de fluorescência. Fornecemos dados de prova de conceito demonstrando o efeito de agentes citotóxicos na saúde celular, apoptose e viabilidade. Esta plataforma de imagem cinética automatizada pode ser expandida para outras leituras fenotípicas para entender diversos efeitos terapêuticos em modelos de PDO de câncer.

Introdução

Organoides tumorais derivados de pacientes (DOPs) estão emergindo rapidamente como um sistema modelo robusto para estudar o desenvolvimento de câncer e respostas terapêuticas. As DOPs são sistemas tridimensionais (3D) de cultura celular que recapitulam o complexo perfil genômico e a arquitetura^{do tumor primário1,2}. Ao contrário das culturas bidimensionais (2D) tradicionais de linhagens celulares de câncer imortalizadas, as DOPs capturam e mantêm a heterogeneidade intratumoral ^3,4, tornando-as uma ferramenta valiosa para pesquisas mecanicistas e translacionais. Embora as DOPs estejam se tornando um sistema modelo cada vez mais popular, os reagentes comercialmente disponíveis e os métodos de análise para efeitos celulares compatíveis com culturas de DOP são limitados.

A falta de métodos robustos para analisar mudanças sutis na resposta ao tratamento dificulta a tradução clínica. O reagente de saúde celular padrão-ouro em culturas 3D, CellTiter-Glo 3D, utiliza os níveis de ATP como determinante da viabilidade celular ^5,6. Embora esse reagente seja útil para ensaios de desfecho, há várias ressalvas, principalmente a incapacidade de usar amostras para outros fins após a conclusão do ensaio.

A imagem de células vivas é uma forma sofisticada de microscopia cinética que, quando combinada com reagentes fluorescentes, tem a capacidade de quantificar uma variedade de leituras de saúde celular dentro de modelos de DOP, incluindo apoptose ^7,8,9 e citotoxicidade¹⁰. De fato, imagens de células vivas têm sido parte integrante da triagem de compostos em plataformas 2D com alto rendimento^11,12. Sistemas como o Incucyte tornaram a tecnologia acessível e, portanto, acessível a grupos de pesquisa em uma variedade de cenários. No entanto, a aplicação desses sistemas para analisar culturas 3D ainda está engatinhando.

Neste artigo, descrevemos um método para avaliar a resposta a drogas em modelos de câncer com DOP usando imagens multiplexadas de células vivas (Figura 1). Através da análise de imagens de campo claro, mudanças no tamanho e morfologia da DOP podem ser monitoradas cineticamente. Além disso, os processos celulares podem ser quantificados simultaneamente ao longo do tempo usando reagentes fluorescentes, como o corante vermelho Anexina V para apoptose e o corante verde Cytotox para citotoxicidade. Os métodos apresentados são otimizados para o sistema de imagem de células vivas Cytation 5, mas este protocolo pode ser adaptado em diferentes plataformas de imagem de células vivas.

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Protocolo

Estudos utilizando espécimes de tumores humanos foram revisados e aprovados pelo Comitê de Revisão Institucional (IRB) da Universidade de Iowa, protocolo #201809807, e realizados de acordo com os padrões éticos estabelecidos na Declaração de Helsinque de 1964 e suas alterações posteriores. O termo de consentimento livre e esclarecido foi obtido de todos os sujeitos participantes do estudo. Os critérios de inclusão incluem o diagnóstico de câncer e a disponibilidade de espécimes tumorais.

1. Chapeamento de DOPs intactas em uma placa de 96 poços

1. Preparar reagentes.
   1. Pré-aqueça placas de 96 poços a 37 °C durante a noite e descongele BME durante a noite a 4 °C.
   2. Preparar meios de cultura organoides completos otimizados para cultivar o tipo de câncer de interesse. Os meios de cultura específicos utilizados para os experimentos aqui apresentados são apresentados na Tabela Suplementar 1.
      NOTA: Os componentes do meio podem precisar ser modificados para diferentes tipos de tumor. Por exemplo, o meio de cultura organoide é suplementado com estradiol 100 nM para tumores ginecológicos¹³. O meio preparado é estável a 4 °C durante 1 mês. Para armazenamento a longo prazo, aliquotar o meio em tubos de 50 mL e armazenar a -20 °C.
2. Preparar duas alíquotas separadas de meios de cultura organoides a 4 °C e 37 °C. Por exemplo, se 60 poços estiverem sendo plaqueados em uma placa de 96 poços, use 6 mL de meio de cultura organoide quente e 150 μL de meio de cultura organoide gelado.
3. Prepare o tampão de lavagem organoide: Suplemento 1x PBS com 10 mM HEPES, 1x Glutamax, 5 mM EDTA e 10 μM Y-27632. Conservar a 4 °C
4. Colher DOPs cultivadas em placa de 24 poços. Execute todas as etapas no gelo ou a 4 °C, salvo indicação em contrário.
   1. Aspirar o meio de cada poço usando um sistema de linha de vácuo.
   2. Adicionar 500 μL de tampão de lavagem organoide gelado e pipetar suavemente 2-3x usando um pipetador de 1000 μL. Incubar a placa no gelo por 10 min.
   3. Transfira o conteúdo de cada poço para um tubo cônico de 50 mL. Para garantir que todas as DOPs estejam em suspensão, lave cada poço com mais 300 μL de tampão de lavagem organoide e transfira para o tubo cônico de 50 mL. Centrifugar durante 5 min a 350 x g a 4 °C
   4. Aspirar o sobrenadante do BME/pastilha organoide usando um sistema de linha de vácuo, deixando ~ 5 mL restantes no tubo. Adicionar 20 mL de tampão de lavagem organoide e ressuspender suavemente o pellet usando uma pipeta sorológica de 10 mL. Incubar no gelo por 10 min.
   5. Centrifugar durante 5 min a 350 x g a 4 °C. Aspirar o sobrenadante com um sistema de linha de vácuo, tomando cuidado para não interromper a pastilha DOP.
5. Plating PDOs em uma placa de 96 poços: Execute todas as etapas no gelo, salvo indicação em contrário.
   1. Ressuspender o pellet de DOP em uma quantidade apropriada de meio de cultura organoide gelado para criar uma suspensão de DOP. Transfira a suspensão de DOP para um tubo de microcentrífuga gelado de 1,5 mL.
      NOTA: Para calcular a quantidade de meios de cultura organoides, determinar o número de poços a serem plaqueados em uma placa de 96 poços, levando em consideração que as DOPs são plaqueadas em uma cúpula de 5 μL em uma proporção de 1:1 de meios de cultura organoides e BME. Por exemplo, ao plaquear uma placa de 96 poços e usar apenas os 60 poços internos, a quantidade total de suspensão de DOP necessária será de 300 μL: 150 μL de meio de cultura organoide e 150 μL de EMB. Para modelos que apresentam crescimento ótimo em diferentes porcentagens de EMB, a razão BME:meio pode ser modificada nesta etapa, embora seja importante padronizar a razão em todos os ensaios para cada modelo específico. Para contabilizar o erro de pipetagem, adicione 10% de volume a cada componente.
   2. Conte o número de DOPs.
      1. Transferir 2,5 μL da suspensão de DOP para um tubo de microcentrífuga gelado de 1,5 mL e misturar com 2,5 μL de EMB. Transfira a mistura de 5 μL para uma lâmina limpa de microscópio de vidro. Não cubra o slide. A mistura vai se solidificar em uma cúpula.
      2. Visualize usando um microscópio de campo brilhante em 4x. Contar o número de DOP na mistura de 5 μL; o objetivo é ter cerca de 25-50 DOPs por cúpula de 5 μL.
         NOTA: Se a densidade desejada não for atingida na mistura de ensaio, ajustar o volume final da suspensão de DOP adicionando mais meios de cultura organoides ou centrifugando a suspensão de DOP e ressuspendendo a pastilha de DOP num volume inferior de meios de cultura organoides gelados. Independentemente da forma como a suspensão de DOP é modificada nesta etapa, a relação final de BME: suspensão de DOP na etapa 1.5.3. deve ser 1:1.
   3. Usando um pipetador de 200 μL com pontas largas, misture cuidadosamente a suspensão de DOP com uma quantidade igual de BME para obter uma proporção de 1:1 de meios de cultura organoides para BME. Evite bolhas, que irão atrapalhar a integridade das cúpulas.
   4. Usando um pipetor de 20 μL, semeie cúpulas de 5 μL no centro de cada poço de uma placa pré-aquecida de 96 poços, semeando apenas os 60 poços internos. Para garantir a distribuição igualitária das DOP, pipetar periodicamente o conteúdo do tubo de 1,5 mL com um pipetador de 200 μL com pontas largas.
   5. Depois que todos os poços tiverem sido semeados, coloque a tampa no prato e inverta suavemente. Incubar a placa invertida a 37 °C durante 20 minutos na incubadora de cultura de tecidos para permitir que as cúpulas se solidifiquem.
      NOTA: A inversão da placa garante que a cúpula do meio de cultura BME/organoide mantenha a estrutura 3D para fornecer espaço adequado para a formação de DOP.
   6. Vire a placa de modo que fique com a tampa para cima e incube por 5 min a 37 °C.

2. Tratamentos e adição de corantes fluorescentes para multiplexação

1. Enquanto as cúpulas BME estão se solidificando nas placas de 96 poços, prepare diluições de reagentes fluorescentes de imagem de células vivas. Parâmetros específicos para multiplexação do corante vermelho Annexin V e corante verde Cytotox são dados aqui.
2. Preparação de reagentes fluorescentes (Dia -1): Calcular o volume adequado de meios de cultura organoides com base no número de poços a serem tratados, supondo que cada poço será tratado com 100 μL de meio corante. Diluir o corante em meio de cultura organoide pré-aquecido até a concentração desejada.
   NOTA: A quantidade total de mídia necessária irá variar dependendo do experimento. Adicione 10% ao volume final para contabilizar o erro de pipetagem. Por exemplo, para tratar os 60 poços internos de uma placa de 96 poços, prepare 6,6 mL de meio dosado com corante (Tabela 1).
3. Trate cada poço com 100 μL de 2x meios de cultura organoides dosados com corante. Adicionar 200 μL de 1x PBS estéril aos orifícios vazios externos da placa. Incubar a 37 °C durante a noite.
   NOTA: O PBS nos poços periféricos diminui a evaporação do meio dos poços internos.
4. Adição de fármacos/agentes de tratamento (Dia 0): Preparar fármacos em meios de cultura organoides pré-aquecidos a uma concentração de 2x num volume de 100 μL por poço.
   NOTA: DMSO pode ser tóxico para as células em altas concentrações. A concentração de 0,1% de DMSO não é excedida nos experimentos realizados neste estudo. Além dos fármacos, alguns reagentes fluorescentes são distribuídos como solução de DMSO. É importante levar em conta a concentração total de DMSO ao trabalhar com esses reagentes.
5. Adicionar 100 μL de 2x meio corante a cada poço; Evite criar bolhas.

3. Configuração de parâmetros de imagem

1. Coloque a placa no Cytation 5. Abrir Software Gen5. Clique em Nova Tarefa > Modo Manual do Imageador. Selecione Capturar agora e insira as seguintes configurações: Objetivo (selecione a ampliação desejada); Filtro (selecionar microplaca); Formato de microplaca (selecionar número de poços); e Tipo de vaso (selecionar tipo de placa). Clique em Usar tampa e Usar velocidade de portadora mais lenta. Clique em OK.
   NOTA: Tipo de vaso: Seja o mais específico possível ao selecionar informações sobre a placa, pois o software é calibrado para a distância específica da objetiva ao fundo da placa para cada tipo de placa e espessura do plástico.
   Velocidade da transportadora mais lenta: Selecione esta caixa para evitar a interrupção das cúpulas ao carregar/descarregar placas.
2. Crie um Z-Stack que irá criar imagens de toda a cúpula BME.
   1. Selecione um poço de interesse para visualizar (painel esquerdo, abaixo do histograma).
   2. Selecione o canal Campo Brilhante (painel esquerdo, parte superior). Clique em Expor automaticamente e ajuste as configurações conforme necessário.
   3. Defina a parte inferior e superior da guia Z-Stack: Expanda o Modo de Criação de Imagem (painel esquerdo, meio). Marque a caixa Z-Stack . Usando as setas de ajuste de curso (painel esquerdo, meio), clique no ajuste para baixo até que todos os PDOs tenham entrado e saído do foco e estejam confusos. Defina isso como a parte inferior do Z-Stack. Repita na direção oposta usando as setas de ajuste de curso para definir a parte superior do Z-Stack.
   4. Para garantir que as configurações do Z-Stack sejam apropriadas para outros poços de interesse, selecione outro poço (painel esquerdo, abaixo do histograma) e visualize a parte superior e inferior do Z-Stack.
   5. Para inserir manualmente as posições focais, clique nos três pontos ao lado do ajuste fino (painel esquerdo, parte superior). Uma janela será aberta; digite o valor Z-Stack superior (localizado no painel esquerdo, ao centro, em Modo de Imagem). Repita para o valor Z-Stack inferior. Ajuste conforme necessário para capturar a faixa Z desejada repetindo a etapa 3.2.3. Se forem necessários ajustes, selecione outro poço para verificar as configurações.
3. Defina as configurações de exposição para o(s) canal(es) fluorescente(s). As configurações são descritas para dois canais fluorescentes (GFP & TRITC). O número específico de canais fluorescentes dependerá do experimento e de quais cubos fluorescentes serão instalados no sistema de imagem de células vivas.
   NOTA: Se a intensidade do sinal for significativamente maior no final do experimento, os usuários devem considerar a realização de experimentos de teste para determinar as configurações de exposição ideais no final do experimento que podem ser aplicadas ao configurar os parâmetros iniciais.
   1. Expanda a guia Modo de Criação de Imagem (painel esquerdo, no meio) e abra Editar Etapa de Criação de Imagens. Uma janela pop-up será exibida.
   2. Em Canais, clique na bolha para o número desejado de canais. Designe um canal para campo brilhante e canais adicionais para cada canal fluorescente. Neste exemplo, Canal 1 = Campo Brilhante; Canal 2 = GFP; Canal 3 = TRITC. Usando os menus suspensos Cores, selecione a configuração apropriada para cada canal. Feche a janela de edição clicando em OK.
   3. Configure cada canal fluorescente.
      1. Mude o canal para GFP (painel esquerdo, superior).
      2. Clique em Exposição automática (painel esquerdo, parte superior). Expanda a guia Exposição (painel esquerdo, meio) e ajuste as configurações de exposição para minimizar o sinal de fundo.
      3. Copie as configurações de exposição para a guia Modo de imagem seguindo as etapas 3.3.3.3-3.3.3.6.
      4. Clique no ícone Copiar ao lado da caixa Editar etapa de geração de imagens . Clique em Editar etapa de geração de imagens, que abrirá outra janela.
      5. No canal GFP, clique no ícone Área de transferência na linha Exposição para adicionar as configurações Iluminação, Tempo de integração e Ganho de câmera ao canal.
      6. Repita as etapas 3.3.3.4-3.3.3.5 para o canal TRITC. Clique em OK para fechar a janela.
4. Configure as etapas de pré-processamento e projeção Z da imagem para automatizar o pré-processamento da imagem.
   1. Clique no ícone Câmera (painel esquerdo, canto inferior). Uma nova janela será aberta.
   2. Em Adicionar etapa de processamento (painel esquerdo, parte inferior), clique em Pré-processamento de imagem. Uma nova janela será aberta.
   3. Na guia Campo Brilhante , desmarque Aplicar Pré-processamento de Imagem.
   4. Para cada guia Canal Fluorescente , verifique se a opção Aplicar Pré-processamento de Imagem está selecionada. Desmarque Usar as mesmas opções do canal 1 e clique em OK. A janela será fechada.
   5. Em Adicionar etapa de processamento, clique em Projeção Z. Uma nova janela será aberta. Se desejar, ajuste o intervalo de fatias (por exemplo, para reduzir o intervalo Z). Feche a janela selecionando OK.
5. Criar protocolo.
   1. Clique em Conjunto de imagens na barra de ferramentas. No menu suspenso, clique em Criar experimento a partir deste conjunto de imagens. A Janela de Criação de Imagens será fechada e a Janela de Procedimento será aberta.
      NOTA: Os parâmetros selecionados no Modo Manual do Imager serão automaticamente carregados na nova janela, onde um protocolo experimental pode ser criado.
   2. Defina a temperatura e o gradiente: clique em Definir temperatura sob o título Ações (à esquerda). Uma nova janela será aberta. Selecione Incubadora ligada e insira manualmente a temperatura desejada em Temperatura. Em seguida, em Gradiente, insira manualmente 1. Feche a janela selecionando OK.
      NOTA: A criação de um gradiente de 1 °C impedirá a formação de condensação na tampa da placa.
   3. Designe poços para a imagem.
      1. Clique duas vezes na etapa de imagem em Descrição. Clique em Chapa cheia (canto direito, parte superior). Isso abrirá a janela Layout da placa .
      2. Destaque poços de interesse usando o cursor. Clique em OK. Se desejar, marque as caixas Autofocus Binning e Capture Binning . Clique em OK para fechar a janela.
         NOTA: Binning exigirá ajuste de exposição, conforme descrito na etapa 3.3.3.2 acima. Consulte a seção Discussão para cenários específicos nos quais esse recurso pode ser usado.
   4. Defina intervalos para imagens cinéticas.
      1. Clique em Opções sob o título Outro (à esquerda). Marque a caixa Procedimento cinético descontínuo .
      2. Em Tempo Total Estimado, insira o tempo de execução do experimento (por exemplo, 5 dias). Em Intervalo estimado, insira o intervalo para obter a imagem da placa (por exemplo, a cada 6 h).
      3. Clique em Pausar após cada execução para dar tempo para que a placa seja transferida para a incubadora. Feche a janela selecionando OK.
   5. Atualize as etapas de redução de dados.
      1. Clique em OK para fechar a Janela de Procedimento. Uma guia será aberta para atualizar as etapas de redução de dados. Selecione Sim. Clique duas vezes em Pré-processamento de imagem. Clique nos diferentes canais para verificar as configurações e clique em OK.
      2. Clique duas vezes em Projeção Z. Clique nos diferentes canais para verificar as configurações. Clique em OK. Em seguida, clique em OK novamente para fechar a janela de redução de dados.
   6. Formate o layout da chapa.
      1. Abra o Assistente de layout de placa e designe tipos de poço seguindo as etapas 3.6.2-3.6.3.
      2. Clique no ícone Layout de Placa na barra de ferramentas (canto esquerdo, superior) para abrir o Assistente de Layout de Placa.
      3. Marque as caixas ao lado dos tipos de poço usados no experimento. Em Controles de Ensaio, insira o número de diferentes tipos de controle usando as setas. Clique em Avançar para abrir a janela Controle de Ensaio #1 .
      4. Defina as condições do poço de controle de ensaio seguindo as etapas 3.6.5-3.6.8.
      5. Na janela Controle de Ensaio #1, insira o rótulo do controle na caixa ID do layout da placa . Se desejar, digite o nome completo na caixa adjacente. Selecione o número de réplicas para a respectiva condição de controle usando as setas.
      6. Se estiver usando várias concentrações ou uma série de diluição dentro do controle, clique em Definir diluições/concentrações e use o menu suspenso para selecionar o Tipo. Introduzir valores para cada concentração/diluição no quadro.
         NOTA: A função auto pode ser usada se as concentrações mudarem por um incremento consistente.
      7. Selecione a guia Cor na barra de ferramentas. Escolha a cor do texto desejado e a cor do plano de fundo para controle no menu suspenso. Clique em Avançar.
      8. Repita conforme necessário com controles adicionais.
      9. Definir as condições do poço de amostra de acordo com 3.6.10-3.6.12.
      10. Na página Configuração de Exemplo , insira o Prefixo de ID de exemplo (por exemplo, SPL). Selecione o número de réplicas usando as setas. Se estiver usando amostras com concentrações de tratamento variadas, selecione Concentrações ou Diluições no menu suspenso Tipo . Indicar diluições/concentrações no quadro e introduzir unidades na caixa Unidade .
      11. Selecione Campos de identificação na barra de ferramentas. Insira o(s) nome(s) de categoria desejado(s) (por exemplo, ID da amostra, medicamento) na tabela.
      12. Selecione a guia Cor na barra de ferramentas. Selecione uma cor diferente para cada grupo/amostra de tratamento. Clique em Concluir. Isso abrirá a página Layout da placa.
          NOTA: Os números no lado esquerdo correlacionam-se com os diferentes números de amostra.
      13. Atribua IDs de exemplo seguindo as etapas 3.6.14-3.6.16.
      14. Selecionar SPL1 no painel esquerdo. Use o cursor para selecionar poços.
          Observação : ferramentas de seleção automática podem ser ajustadas na caixa de atribuição serial. O número de réplicas e a orientação do layout podem ser pré-designados.
      15. Repita com outras amostras para completar o layout da placa. Quando estiver satisfeito, clique em OK.
      16. Na barra de ferramentas Arquivo , selecione IDs de exemplo. Preencha as colunas ID da amostra com as informações apropriadas para cada amostra (por exemplo, tipo de medicamento). Pressione OK.
   7. Salve o protocolo.
      1. Na barra de ferramentas, clique em Arquivo > Salvar protocolo como. Selecione o local para salvar o arquivo. Insira um nome de arquivo. Clique em Salvar para fechar a janela.
      2. Clique em Arquivo > Sair na barra de ferramentas. Uma guia será aberta para salvar as alterações no Modo Manual do Imager. Selecione Não.
      3. Uma guia será aberta para salvar as alterações no Experimento 1. Selecione Não. Uma guia será aberta para atualizar a definição do protocolo. Selecione Atualizar. Feche o software.
6. Importe o protocolo para o BioSpa OnDemand e conclua a configuração do Experimento.
   1. Abra o software BioSpa OnDemand (software de agendamento).
   2. Selecione um slot disponível no software.
   3. Remova a placa do sistema de imagem de células vivas. Clique em Abrir Gaveta para acessar o slot apropriado no software de agendamento e insira a placa. Clique em Fechar Gaveta.
      Observação : esta etapa pode ser executada em qualquer ponto uma vez que o protocolo foi criado na etapa 3.5.7 acima. No entanto, a placa deve estar no Cytation 5 para executar uma corrida de temporização no passo 3.6.4.3 abaixo.
   4. Importe o protocolo.
      1. Na guia Informações do Procedimento , selecione Usuário no menu suspenso. Ao lado do slot Protocolo , clique em Selecionar > Adicionar uma nova entrada.
      2. Ao lado do slot Protocolo, clique em Selecionar. Isso abrirá uma nova janela para navegar até o protocolo desejado na arquitetura de arquivos. Clique em Abrir para importar o protocolo para o software de agendamento.
      3. Insira a quantidade de tempo necessária para criar imagens da placa. Clique em OK para fechar a janela Lista de Protocolos Gen5 .
         Observação : esta etapa é especialmente importante ao executar vários experimentos ao mesmo tempo. Para determinar o tempo necessário para criar a imagem do, clique em Executar uma execução de tempo agora. Clique em OK.
   5. Defina intervalos de imagem e agende o experimento.
      1. Em Intervalo, insira o intervalo de imagem designado na etapa 3.5.4.
      2. Em Opções de Hora de Início, selecione Quando Disponível. Em Duração, selecione Fixo ou Contínuo.
         Observação : uma hora de início específica pode ser designada em vez de executar o protocolo na próxima hora disponível. A seleção de Duração Fixa definirá um ponto de extremidade específico para o experimento e exigirá que o usuário designe um período de tempo experimental. A Duração Contínua permitirá que o experimento seja executado sem ponto de extremidade e só poderá ser encerrado por um usuário interrompendo o experimento.
      3. Clique em Agendar Placa/Embarcação. Isso abrirá a Sequência de Validação de Placa. Uma guia será aberta com o horário de primeira leitura proposto. Clique em Sim para aceitar esta agenda.

4. Análise das imagens no software Gen5 (Figura 2)

1. Abra o módulo de Análise de Imagens.
   1. Abra o Gen5. No Gerenciador de Tarefas, selecione Experimentos > Abrir. Selecione o experimento para abrir o arquivo. Clique em Placa > Exibir na barra de ferramentas.
   2. Altere o menu suspenso Dados para Projeção Z. Clique duas vezes em um poço de interesse. Selecione Analisar > desejo configurar uma nova etapa de redução de dados de Análise de Imagem. Clique em OK.
2. Análise celular
   1. Máscara primária
      1. Em Configurações de análise, selecione Tipo: Canal de detecção e análise celular: ZProj[Tsf[Campo brilhante]] (painel esquerdo, centro).
      2. Clique em Opções. Isso abrirá a página Máscara primária e Contagem . Na caixa Limite , marque Automático e clique em Aplicar. Clique na caixa Realçar Objetos (painel direito, inferior) para mostrar objetos dentro do limite designado. Ajuste conforme necessário para incluir objetos de interesse.
         Observação : configurações de limite são baseadas na intensidade de pixel. Por exemplo, se o limite for definido como 5000, pixels com intensidade maior que 5000 serão incluídos na análise.
      3. Em Seleção de Objeto, designe o tamanho mínimo e máximo do objeto (μm). Ajuste conforme necessário para excluir detritos celulares/células únicas.
         NOTA: O tamanho da DOP pode variar significativamente entre diferentes modelos e tipos. Use a ferramenta de medição no software Gen5 para determinar os limites mínimos e máximos de tamanho PDO para cada modelo. Os usuários podem escolher um limite mínimo de tamanho de DOP menor em relação ao valor fornecido pelo instrumento de medição, a fim de evitar a exclusão de fragmentos de DOP em momentos posteriores após o tratamento medicamentoso.
      4. Para limitar a análise a uma determinada região do poço, desmarque Analisar imagem inteira e clique em Conectar. Na janela Plugue de imagem , use o menu suspenso para selecionar a forma Plug . Ajuste os parâmetros de tamanho e posição conforme necessário para se ajustar à região de interesse.
         NOTA: É importante maximizar o número de PDOs dentro do plugue e, ao mesmo tempo, excluir áreas livres de PDO para minimizar o plano de fundo. Designe um tamanho de plugue que capture consistentemente a maioria dos objetos de interesse em replicações. Gerar um plugue que também exclua as bordas da cúpula é importante, pois exclui quaisquer objetos que possam parecer distorcidos devido à refração da luz da curvatura extrema da cúpula ao redor das bordas. Incluir objetos de borda primária também pode ser desmarcada para capturar apenas PDOs inteiros dentro do plugue.
   2. Análise de subpopulações. Um exemplo de designação de subpopulação é fornecido na Figura 3.
      1. Clique em Métricas calculadas na barra de ferramentas Análise celular. Clique em Selecionar ou criar métricas de interesse no nível de objeto (canto direito, parte inferior). Em Métricas de objeto disponíveis, selecione métricas de interesse (por exemplo, circularidade) e clique no botão Inserir. Clique em OK.
         NOTA: A morfologia e a densidade de cada modelo de DOP determinarão as melhores métricas de interesse para distinguir a subpopulação.
      2. Clique em Análise de Subpopulação na barra de ferramentas Análise Celular . Clique em Adicionar para criar uma nova subpopulação. Uma janela pop-up será aberta.
      3. Se desejar, insira um nome para a subpopulação. Em Métricas de Objeto, selecione uma métrica de interesse e pressione Adicionar Condição. Na janela Editar Condição , insira parâmetros para a Métrica de Objeto escolhida. Repita com métricas adicionais conforme necessário.
         NOTA: Os parâmetros podem ser ajustados manualmente ou definidos usando a ferramenta localizador. Por exemplo, para excluir detritos, os usuários podem adicionar Área como uma Métrica de Objeto e selecionar objetos menores que 800. A circularidade como métrica de objeto é usada rotineiramente, e quaisquer objetos com circularidade maior que 0,2-0,5 são incluídos, dependendo do modelo.
      4. Na tabela na parte inferior da janela, verifique os resultados desejados para exibição. Clique em OK > Aplicar.
      5. Para exibir os objetos dentro da subpopulação, use o menu suspenso Detalhes do objeto (painel direito, centro) para selecionar a subpopulação. Os objetos que se enquadram nos parâmetros serão realçados na imagem.
         Observação : para alterar as cores de realce da máscara primária e subpopulação, clique em configurações (painel direito, parte inferior).
      6. Para ajustar os parâmetros de subpopulação, reabra a janela Análise de Subpopulação na barra de ferramentas Análise Celular . Selecione a subpopulação e clique em Editar. Clique em Adicionar etapa.
         NOTA: Isso aplicará a mesma análise a todos os poços dentro do experimento em todos os pontos de tempo. No menu suspenso na página Matriz, diferentes métricas podem ser selecionadas para visualização individual.

5. Exportando dados do Gen5 para o Excel

1. Para personalizar um arquivo de dados para exportação, selecione o ícone Construtores de Relatório/Exportação na barra de ferramentas. Na janela pop-up, clique em Nova exportação para o Excel.
2. Na página Propriedades da janela pop-up, selecione Escopo > Chapa e Conteúdo > Personalizado. Clique na opção Conteúdo na barra de ferramentas. Clique em Editar modelo, que abrirá o programa Excel.
3. Na planilha, selecione Suplementos > Tabela > Dados de Poços. Passe o mouse sobre as várias seleções para ver as opções de exportação. Selecione a métrica de interesse (por exemplo, Object Mean[ZProj[Tsf[TRITC]]]).
   NOTA: O layout da placa pode ser adicionado ao modelo de análise de planilha selecionando Suplementos > Resumo do Protocolo > Layout.
4. Uma janela Editar será aberta. Na caixa Poços , designe os poços para exportação por Well-ID ou Well #. Selecione OK. Um modelo será carregado no arquivo de planilha. Feche a planilha. O modelo é salvo automaticamente.
5. Clique em OK na janela Nova exportação para Excel e feche a janela Construtores de Relatório/Exportação .
6. Clique no ícone Exportar na barra de ferramentas Gen5. Marque a caixa ao lado do arquivo de exportação desejado. Clique em OK. O Gen5 preencherá automaticamente o modelo de planilha e abrirá o arquivo no Excel.

6. Análise de dados externos

1. Abra o arquivo de exportação (.xlsx) no Excel.
2. Para cada poço, divida cada valor individual pelo valor de 0:00 ponto de tempo para esse poço. Isso definirá o ponto de tempo 0 igual a 1, e cada valor além disso será relativo à leitura inicial.
3. Abra um novo arquivo no software de análise de dados. Selecione a opção de layout XY .
   OBS: Neste protocolo foi utilizado o GraphPad Prism (versão 9.5.1).
4. Rótulos de entrada para cada grupo de dados. Copie e cole os pontos de tempo e os valores normalizados correspondentes para cada grupo de tratamento na tabela Prism. Um gráfico para os dados será gerado automaticamente e pode ser encontrado em Gráficos.

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Resultados

Nosso objetivo foi demonstrar a viabilidade do uso de imagens multiplexadas de células vivas para avaliar a resposta terapêutica da DOP. Experimentos de prova de conceito foram realizados em dois modelos separados de DOP de câncer de endométrio: ONC-10817 e ONC-10811 (veja a Figura Suplementar 1 e a Figura Suplementar 2 para dados do ONC-10811). A apoptose (coloração da anexina V) e a citotoxicidade (captação do Cytotox Green) foram monitoradas cineticamente em resposta ao agente...

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Discussão

As culturas de DOP estão se tornando um sistema modelo in vitro cada vez mais popular devido à sua capacidade de refletir respostas e comportamentos celulares². Avanços significativos foram feitos nas técnicas de geração, cultura e expansão de DOP, mas os métodos para analisar as respostas terapêuticas ficaram para trás. Os kits de viabilidade 3D disponíveis comercialmente são ensaios de desfecho lítico, perdendo dados de resposta cinética potencialmente valiosos e limitando análise...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrfuge tube	Dot Scientific Inc	1008113
15 mL conical centrifuge tube	Sarstedt	62.554.100
554 NM LED Cube	Agilent	1225012
96-well plate	Corning Costar	3596	Prewarmed to 37 °C
96-well plate	Agilent	204626-100	Prewarmed to 37 °C
A83-01	Tocris	2939	Final concentration is 500 nM (component of organoid culture media)
Advanced DMEM/F-12	Gibco	12634-010	component of organoid culture media
B27 Supplement	Gibco	17504044	Final concentration is 1x (component of organoid culture media)
BioTek BioSpa 8 Automated Incubator	Agilent	BIOSPAG-SN	Tabletop incubator; BioSpa OnDemand scheduling software comunicates with Gen5 to transfer plates between the BioSpa and the Cytation 5 for imaging (this protocol uses version 1.01.10)
BioTek Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader	Agilent	CYT5PW-SN	Plate reader; Gen5 software is used for this device (this protocol uses version 3.12.08)
Cultrex UltiMatrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract	R&D Systems	BME001-10
Daunorubicin HCl	Sigma-Aldrich	S3035	Reconstituted in DMSO
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2438
EDTA (0.5 M)	Thermo Fisher	AM9260G
Forskolin	Tocris	1099	Final concentration is 10 µM (component of organoid culture media)
Glutamax	Gibco	35050-061	Final concentration is 1x (component of organoid culture media)
HEPES	Gibco	15630-080	Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media)
Human EGF, Animal-Free Recombinant Protein	Gibco	AF-100-15-1MG	Final concentration is 0.5 ng/mL (component of organoid culture media)
Human FGF-10 Recombinant Protein	Gibco	100-26-1MG	Final concentration is 10 ng/mL (component of organoid culture media)
Human R-Spondin 1 Recombinant Protein	Gibco	120-38-5UG	Final concentration is 250 ng/mL (component of organoid culture media)
Hydrocortisone Stock Solution	StemCell Technologies	7926	Final concentration is 500 ng/mL (component of organoid culture media)
Imaging Filter Cube- GFP	Agilent	1225101
Imaging Filter Cube- TRITC	Agilent	1225125
Imaging LED GFP/CFP	Agilent	1225001
Incucyte Annexin V Red Dye	Sartorius	4641	Reconstituted in organoid culture media
Incucyte Cytotox Green Dye	Sartorius	4633	DMSO solution
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma-Aldrich	A7250	Final concentration is 1.25 mM (component of organoid culture media)
Nexcelom Bioscience ViaStain AOPI Staining Solution	Fisher-Scientific	13366169	Add 1:50 volume
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636	Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media)
Noggin	R&D Systems	6057-NG	Final concentration is 100 ng/mL (component of organoid culture media)
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Final concentration is 10 units/mL (component of organoid culture media)
Phosphate Buffered Saline (1x)	Gibco	14190-144
Primocin	InvivoGen	ant-pm-05	Final concentration is 100 µg/mL (component of organoid culture media)
Recombinant Human Heregulinβ-1	Pepro Tech	100-03	Final concentration is 37.5 ng/mL (component of organoid culture media)
Staurosporine solution from Streptomyces sp.	Sigma-Aldrich	S6942
TrypLE Express	Life Technologies	12604013
Y-27632, CAS 331752-47-7	Sigma-Aldrich	688000	Final concentration is 5 µM (component of organoid culture media)
β-Estradiol	Sigma-Aldrich	E2758	Final concentration is 100 nM (component of organoid culture media)