Regulando o crescimento de células de Schwann por campo elétrico pulsado de nanossegundos para regeneração de nervos periféricos in vitro

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para aplicação de campo elétrico de pulso de nanossegundos (nsPEF) para estimular células de Schwann in vitro. A capacidade de síntese e secreção de fatores relevantes e alterações no comportamento celular validaram o sucesso da estimulação usando nsPEF. O estudo dá uma visão positiva do método de regeneração de nervos periféricos.

Resumo

As células de Schwann (SCs) são células mielinizantes do sistema nervoso periférico, desempenhando um papel crucial na regeneração dos nervos periféricos. O Campo Elétrico de Pulso de Nanossegundos (nsPEF) é um método emergente aplicável na estimulação elétrica nervosa que demonstrou ser eficaz na estimulação da proliferação celular e outros processos biológicos. Com o objetivo de avaliar se os SCs sofrem mudanças significativas sob nsPEF e ajudar a explorar o potencial de novos métodos de regeneração de nervos periféricos, as células RSC96 cultivadas foram submetidas à estimulação nsPEF a 5 kV e 10 kV, seguida de cultivo contínuo por 3-4 dias. Posteriormente, alguns fatores relevantes expressos por SCs foram avaliados para demonstrar a estimulação bem-sucedida, incluindo a proteína marcadora específica, o fator neurotrófico, o fator de transcrição e o regulador da mielinização. Os resultados representativos mostraram que o nsPEF aumentou significativamente a proliferação e migração de SCs e a capacidade de sintetizar fatores relevantes que contribuem positivamente para a regeneração dos nervos periféricos. Simultaneamente, a menor expressão de GFAP indicou o prognóstico benigno de lesões de nervos periféricos. Todos esses resultados mostram que o nsPEF tem grande potencial como método de tratamento eficiente para lesões de nervos periféricos, estimulando as SCs.

Introdução

A cada ano, milhões de pessoas são afetadas por lesões nervosas envolvendo tanto o sistema nervoso periférico (SNP) quanto o sistema nervoso central (SNC)¹. Estudos demonstraram que a capacidade de reparo axonal do SNC é bastante limitada após lesões nervosas, enquanto o SNP mostra capacidade aumentada devido à plasticidade significativa das SCs². No entanto, alcançar a regeneração completa após lesões de nervos periféricos permanece árduo e continua a representar um desafio significativo para a saúde humana ^3,4. Atualmente, os autoenxertos continuam sendo um tratamento comum, apesar das desvantagens da morbidade do local doador e da disponibilidade limitada⁵. Essa situação levou os pesquisadores a explorar terapias alternativas, incluindo materiais⁶, fatores moleculares⁷ e estimulação elétrica (ES). Como fator promotor do crescimento axonal e da regeneração nervosa⁸, a escolha de um método apropriado de ES e a exploração da relação entre ES e SCs tornam-se essenciais.

As SCs são as principais células gliais do SNP, desempenhando um papel crucial na regeneração do SNP ^9,10. Após lesões de nervos periféricos, os SCs passam por ativação rápida, reprogramação extensa² e transição de um estado formador de mielina para uma morfologia de suporte ao crescimento para conduzir a regeneração do nervo². Uma proliferação substancial de SCs ocorre na extremidade distal do nervo lesado, enquanto as SCs do coto distal sofrem proliferação e alongamento para formar a banda de Bungner, que são necessárias para guiar os axônios a crescerem em direção ao órgão-alvo¹¹. Além disso, os SCs dos cotos nervosos proximal e distal migram para a ponte nervosa para formar cordões SC promovendo a regeneração do axônio¹². Além disso, estudos anteriores demonstraram que a síntese e a secreção de fatores relevantes relacionados às SCs mudam nos casos de regeneração nervosa periférica, incluindo fatores transcricionais¹³, fatores neurotróficos¹⁴ e reguladores da mielinização¹³. Isso também fornece indicadores para avaliar a atividade das CTs. Com base nisso, a promoção da proliferação, migração, síntese e secreção de SC de fatores relevantes têm sido extensivamente investigadas para melhorar a regeneração nervosa periférica¹⁵.

Estudos anteriores demonstraram a possibilidade do uso do ES para regeneração nervosa¹. Uma explicação amplamente aceita é que o ES pode induzir a despolarização das membranas celulares, alterar o potencial da membrana e afetar as funções das proteínas da membrana, alterando as distribuições de carga nessas biomoléculas¹. No entanto, o PFE intenso amplamente aplicado pode causar dor intensa, contrações musculares involuntárias e fibrilação cardíaca⁸. Também aumenta a atividade da creatina quinase (CK), diminui a força muscular e induz o desenvolvimento de dor muscular de início tardio (DOMS)¹⁶. O nsPEF é uma técnica emergente que estimula cobaias com campos elétricos de alta voltagem dentro de uma duração de pulso de nanossegundos, e está gradualmente sendo usada em pesquisas em nível celular^17,18. Estudos anteriores relataram que a possível justificativa do nsPEF promover a proliferação celular e a atividade das organelas é a formação de nanoporos de membrana e a ativação de canais iônicos, o que leva a um aumento na concentração citoplasmática de Ca^{2+ 19}. O nsPEF utiliza a tecnologia de energia de pulso para carregar a membrana celular, produzindo pulsos caracterizados por curta duração, tempo de subida rápido, alta potência e baixa densidade de energia²⁰. Essas características sugerem que o nsPEF pode ser um modo preferido com efeitos colaterais mínimos de estimulação⁸. Além disso, o nsPEF oferece vantagens como procedimentos minimamente invasivos, reversibilidade, ajuste e não destrutividade aos tecidos neurais em comparação com intervenções cirúrgicas. Uma das principais direções de pesquisa do nsPEF no campo biomédico é sua aplicação para ablação de tecido tumoral usando estimulação de campo elétrico de alta energia 21,22,23. Alguns resultados de pesquisas indicam que o 12-nsPEF pode estimular os nervos periféricos sem causar danos²⁴. No entanto, atualmente, há evidências limitadas sobre a aplicação do nsPEF no campo da regeneração nervosa. Além disso, estimular SCs usando nsPEF é uma tentativa pioneira, contribuindo para mais pesquisas in vivo e clínicas. Este estudo explora se a estimulação nsPEF de SCs pode promover a regeneração nervosa e fornecer uma base confiável para pesquisas subsequentes aprofundadas e sistemáticas.

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Protocolo

1. Descongelamento de células RSC96 criopreservadas

1. Descongele o criogênico contendo 1 mL de suspensão celular agitando-o rapidamente em banho-maria a 37 ° C e, em seguida, adicione-o a um tubo de centrífuga contendo 4-6 mL de meio de cultura completo e misture bem.
2. Centrifugue a 1000 x g durante 3-5 min, elimine o sobrenadante e ressuspenda as células em 3 ml de meio de cultura completo.
3. Adicionar a suspensão celular a um balão de cultura (ou cápsula) contendo 6-8 ml de meio de cultura completo e incubar a 37 °C durante a noite.
4. No dia seguinte, observe o crescimento e a densidade celular ao microscópio.

2. Passagem celular:

NOTA: Se a densidade celular atingir 80% -90%, ela está pronta para a passagem.

1. Descarte o meio de cultura e enxágue as células 1-2 vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) sem íons de cálcio e magnésio.
2. Adicionar 0,25% (p/v) de tripsina-0,53 mM de EDTA ao balão de cultura (1-2 ml para um balão T25, 2-3 ml para um balão T75) e incubar a 37 °C durante 1-2 min.
3. Observe o descolamento da célula ao microscópio. Se a maioria das células se tornar redonda e se desprender, retorne rapidamente o frasco para a área de trabalho, bata suavemente no frasco e adicione 3-4 mL de meio de cultura contendo 10% de FBS para interromper a digestão.
4. Misture o conteúdo, aspire a solução e centrifugue a 1000 x g por 5 min. Em seguida, descarte o sobrenadante e ressuspenda as células adicionando 1-2 mL de meio de cultura fresco e pipetando suavemente.
5. Transferir a suspensão celular para um novo balão T25 na proporção de 1:2 e adicionar 7 ml de meio de cultura.

3. Operação do dispositivo nsPEF

1. Ressuspenda as células RSC96 em 1 mL de meio de cultura DMEM e transfira-as para placas colorimétricas com eletrodos em ambos os lados.
2. Ligue o interruptor de alimentação.
3. Ajuste os parâmetros girando o botão no instrumento para alterar a intensidade do campo elétrico. As intensidades estabelecidas neste estudo são 5 kV/cm, 10 kV/cm, 20 kV/cm e 40 kV/cm.
4. Gire cuidadosamente os eletrodos até que apareçam faíscas, permitindo que as células recebam 5 pulsos de nsPEF de acordo com as intensidades de intensidade de campo predefinidas antes de separar imediatamente os dois eletrodos. Após este tratamento, pegue as células do grupo experimental tratadas com nsPEF e as células do grupo controle não tratadas para realizar as seções 4-6, respectivamente, após um certo período de cultura celular (1 dia neste experimento).

4. Ensaio de contagem de células-8 (CCK-8)

1. Preparar uma suspensão celular de uma concentração específica a partir de células RSC96 estimuladas com estimulação elétrica. Adicione 100 μL da suspensão celular a cada poço de uma placa de cultura de células de 96 poços. Considerando os requisitos do ensaio CCK-8, controlar o número total de células no kit de reagentes entre 1 x 10³ e 1 x 10⁶.
2. Pegue 10 μL de solução de CCK-8 do kit e adicione-o à placa de cultura de células de 96 poços. Incubar numa incubadora de CO₂ a 37 °C durante mais 30 minutos a 4 h.
3. Meça a absorbância. Use medição de comprimento de onda duplo com um comprimento de onda de detecção de 430-490 nm e um comprimento de onda de referência de 600-650 nm.
4. Determine a intensidade da intensidade do campo para experimentos subsequentes com base nos resultados experimentais da proliferação celular. Selecione células com boa proliferação para experimentos subsequentes.

5. Ensaio de arranhões celulares

1. Em cada poço de uma placa de seis poços, semeie 3 x 10⁵ células com um volume total de 2 mL por poço. Aproximadamente 72 h depois, as células cobrirão o poço. Realizar o ensaio no grupo experimental e no grupo de controlo separadamente.
2. Use uma ponta de pipeta para desenhar uma linha horizontal na parte inferior do poço de cultura. Certifique-se de que a ponta da pipeta esteja mantida na vertical e tente evitar incliná-la.
3. Aspire o meio de cultura e lave com PBS 2-3 vezes.
4. Adicione 2 mL de meio sem soro a cada poço.
5. Coloque a placa na incubadora a 37 °C. Tire fotos sob uma ampliação de quatro vezes do microscópio invertido em 0 h e 24 h para observar mudanças na migração celular.

6. Imunofluorescência

1. Permeabilização celular:
   1. Depois de pipetar suavemente as suspensões celulares em placas de cultura, desenhe círculos com uma caneta histológica nos locais onde as células são distribuídas uniformemente na lamínula. Trate o grupo controle e os diferentes grupos experimentais separadamente.
   2. Adicione 50-100 μL de solução de trabalho de permeabilização (0,25-0,5% Triton X-100) e incube em temperatura ambiente (RT) por 20 min. Lave três vezes com PBS por 5 minutos de cada vez.
2. Bloqueio de soro: Adicione 3% de BSA dentro dos círculos para cobrir o tecido uniformemente. Incubar em RT por 30 min.
3. Incubação de anticorpos primários: Remova suavemente a solução de bloqueio e adicione o anticorpo primário adequadamente diluído (derivado de camundongo, diluído a 1:300) aos poços celulares. Colocar a placa de cultura de células numa caixa húmida e incubar durante a noite a 4 °C.
4. Incubação secundária de anticorpos: Coloque a placa celular em um agitador e lave-a três vezes por 5 minutos de cada vez. Adicione o anticorpo secundário correspondente (IgG anti-camundongo de cabra marcado com CY3, diluído a 1:300) e incube em RT por 50 min.
5. Coloração nuclear DAPI:
   1. Coloque a lamínula em PBS (pH 7,4) em uma coqueteleira e lave três vezes por 5 minutos de cada vez.
   2. Depois de secar suavemente a lâmina, adicione a solução de coloração DAPI (2 μg/mL, 0,5 mL por círculo) dentro dos círculos e incube em RT por 10 min em uma sala escura.
6. Montagem: Coloque a lamínula em PBS (pH 7.4) em uma coqueteleira e lave três vezes por 5 minutos de cada vez. Depois de secar suavemente a lâmina, sele a lamínula com um meio de montagem anti-desbotamento para fluorescência.
7. Aquisição de imagem: Excite DAPI em um comprimento de onda de 330-380 nm e detecte a emissão em 420 nm; excitar a 465-495 nm e detectar emissão a 515-555 nm para AF488; excitar a 510-560 nm e detectar emissão a 590 nm para CY3; excitar a 608-648 nm e detectar emissão a 672-712 nm para CY5.

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Resultados

Campos elétricos pulsados de baixa intensidade estimulam a proliferação celular
De acordo com o ensaio CCK-8, a taxa de proliferação de RSC96 no grupo de 5 kV/cm foi significativamente mais rápida do que a das células do grupo controle. No entanto, à medida que os parâmetros aumentaram (20 kV/cm e 40 kV/cm), a taxa de proliferação foi instável, ainda menor do que a do grupo controle. A taxa de proliferação celular de células RSC96 no grupo 40 kV/cm foi significativamente menor do que no...

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Discussão

Nos últimos anos, a aplicação do nsPEF tem experimentado um crescimento impulsionado, conforme relatado. O nsPEF tem um efeito altamente direcionado apenas na área desejada, fornecendo energia suficiente para tratar sem causar danos térmicos adicionais, tornando-o mais seguro para o corpo humano²⁸. Essas características lhe conferem perspectivas translacionais promissoras no tratamento de tumores e regeneração nervosa. No entanto, alguns estudos propuseram algumas limitações do nsPEF. Co...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antifade mounting medium	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	G1401
Anti-GFAP Mouse mAb	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	GB12100-100
Anti-Neurofilament heavy polypeptide Mouse mAb	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	GB12144-100
Anti-S100 beta Mouse mAb	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	GB14146-100
BSA	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	GC305010
Coverslip	Jiangsu Shitai experimental equipment Co., LTD	10212432C
CY3-labeled goat anti-mouse IgG	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	GB21302
DAPI Staining Reagent	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	G1012
Decolorizing shaker	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	DS-2S100
High Voltage Power Supply for nsPEF	Matsusada Precision Inc.	AU-60P1.6-L
Histochemical pen	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	G6100
Membrane breaking liquid	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	G1204
Microscope slide	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	G6012
Palm centrifuge	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	MS6000
PBS powdered	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	G0002
Pipette	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD
Positive fluorescence microscope	Nikon, Japan	NIKON ECLIPSE C1
Rabbit Anti-SOX10/AF488 Conjugated antibody	Beijing Bioss Biotechnology Co., LTD	BS-20563R-AF488
RSC96 Schwann cells	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	STCC30007G-1
scanister	3DHISTECH	Pannoramic MIDI
Special cable for nsPEF	Times Microwave Systems	M17/78-RG217
Turbine mixer	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	MV-100