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Resumo

Atendendo às necessidades urgentes de diagnóstico da dengue, apresentamos aqui um dispositivo analítico baseado em papel para dengue NS1 integrado ao aplicativo para smartphone (DEN-NS1-PAD) para quantificar a concentração do antígeno NS1 da dengue em amostras clínicas de soro/sangue. Essa inovação aprimora o manejo da dengue, auxiliando a tomada de decisões clínicas em vários ambientes de saúde, mesmo aqueles com recursos limitados.

Resumo

A infecção pelo vírus da dengue (DENV), que é transmitido por mosquitos Aedes , é um grande problema de saúde pública em países tropicais e subtropicais. Com uma incidência anual de aproximadamente 10 milhões de casos e 20.000-25.000 mortes, particularmente entre crianças, há uma necessidade urgente de ferramentas práticas de diagnóstico. A presença da proteína não-estrutural 1 (NS1) da dengue durante a infecção precoce tem sido associada à liberação de citocinas, extravasamento vascular e disfunção endotelial, tornando-a um marcador potencial para dengue grave.

Imunoensaios baseados em papel, como ensaios de fluxo lateral (LFAs) e dispositivos analíticos microfluídicos baseados em papel (PADs), ganharam popularidade como testes diagnósticos devido à sua simplicidade, rapidez, baixo custo, especificidade e facilidade de interpretação. No entanto, os imunoensaios convencionais baseados em papel para detecção de NS1 da dengue normalmente dependem de inspeção visual, produzindo apenas resultados qualitativos. Para abordar essa limitação e aumentar a sensibilidade, propusemos um ensaio de detecção de dengue NS1 altamente portátil em um Dispositivo Analítico Baseado em Papel (PAD), ou seja, DEN-NS1-PAD, que integra um aplicativo de smartphone como um leitor colorimétrico e quantitativo. O sistema de desenvolvimento permite a quantificação direta das concentrações de NS1 em amostras clínicas.

Amostras de soro e sangue obtidas dos pacientes foram utilizadas para demonstrar o desempenho do protótipo do sistema. Os resultados foram obtidos imediatamente e podem ser empregados para avaliação clínica, tanto em instalações de saúde bem equipadas quanto em ambientes com recursos limitados. Esta combinação inovadora de um imunoensaio baseado em papel com um aplicativo de smartphone oferece uma abordagem promissora para detecção e quantificação aprimoradas do antígeno NS1 da dengue. Ao aumentar a sensibilidade além das capacidades a olho nu, esse sistema tem grande potencial para melhorar a tomada de decisão clínica no manejo da dengue, particularmente em áreas remotas ou carentes.

Introdução

A infecção pelo vírus da dengue (DENV) é a doença transmitida por mosquitos de mais rápida propagação1, e mais de 390 milhões de pessoas estão infectadas com 96 milhões de infecções sintomáticas, 2 milhões de casos de doença grave e mais de 25.000 mortes por ano ocorrem no mundo 1,2. De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), estima-se que 3,9 bilhões de pessoas estejam em risco de dengue; ~70% vivem em países da Ásia-Pacífico e principalmente no Sudeste Asiático3. Em 2019, o número de casos de dengue relatados à OMS foi de 4,2 milhões, e a Tailândia contribuiu com pelo menos 136.000 casos de dengue e 144 casos de morte por infecção por dengue4. O surto de dengue na Tailândia ocorre durante a estação chuvosa, de abril a dezembro, em áreas urbanas e rurais, especialmente na área nordeste.

As infecções por DENV têm diferentes manifestações clínicas, desde sintomas subclínicos, dengue leve (FD) até dengue hemorrágica grave (FHD). A principal característica da condição grave de FHD é o aumento da permeabilidade vascular, seguido de choque e disfunção orgânica1. A compreensão da via molecular que pode causar o extravasamento vascular é muito importante no desenvolvimento de tratamentos eficazes para a dengue. A proteína não-estrutural 1 (NS1) do dengue é uma glicoproteína secretada durante a infecção viral precoce 5,6 e funciona como cofator para a replicação do RNA viral7. A NS1 pode desencadear a liberação de citocinas e contribuir para o extravasamento vascular ao se ligar ao receptor toll-like 4 (TLR4) e ao glicocálice endotelial 8,9. Pesquisas in vitro mostraram que a NS1 interage com células endoteliais e induz apoptose. Essa condição pode contribuir para disfunção endotelial e extravasamento vascular10. Os níveis séricos do antígeno NS1, correlacionados com os níveis séricos de Interleucina (IL)-10, estavam aumentados significativamente em pacientes com doença clínica grave11. A NS1 do dengue também contribui para a patogênese da doença ao induzir IL-10 e suprimir as respostas específicas de células T DENV12,13. Além disso, a proteína NS1 da dengue foi relacionada à doença clínica grave, e a concentração de NS1 > 600 ng mL-1 nos primeiros 3 dias de doença foi associada ao desenvolvimento de FHD14.

A persistência do antígeno NS1 da dengue em pacientes com FHD poderia ser utilizada como marcador de denguegrave6. Existem vários métodos para detectar a NS1 em amostras clínicas, como o ensaio imunoenzimático (ELISA) e o testerápido15. O padrão-ouro para medir a concentração de proteínas NS1 em um ambiente clínico é o método ELISA. No entanto, o método ELISA é caro e requer pessoal qualificado e instalações laboratoriais16. Portanto, o desenvolvimento de tecnologia para detecção e quantificação de proteínas NS1 no teste point-of-care (POCT) ainda está em andamento. Na última década, imunoensaios baseados em papel, como os ensaios de fluxo lateral (LFAs) e dispositivos analíticos microfluídicos baseados em papel (μPADs), tornaram-se populares como testes diagnósticos devido à sua simplicidade, rapidez, baixo custo e especificidade 17,18,19. Em um imunoensaio baseado em papel, vários marcadores têm sido usados para gerar sinais, como nanopartículas de ouro (AuNPs)20, nanopartículas magnéticas21,22, pontos quânticos23 e materiais de fluorescência24,25. AuNPs são os rótulos mais comuns usados em imunoensaios baseados em papel devido ao seu custo barato de produção, facilidade de fabricação, estabilidade e leitura simples. Atualmente, os ensaios de fluxo lateral (AFLs) para a NS1 da dengue são notoriamente utilizados no cenário clínico26,27. No entanto, a detecção convencional de rótulos de LFA comumente usa o olho nu e fornece apenas resultados qualitativos.

Na última década, mais de 5 bilhões de smartphones foram amplamente utilizados globalmente, e há potencial para o desenvolvimento de detecção portátil28,29. Os smartphones possuem capacidades multifuncionais, como sensores físicos integrados, processadores multi-core, câmeras digitais, portas USB, portas de áudio, wireless e software aplicativo, tornando-os adequados para uso em diversas plataformas de biossensores30. Além disso, as tecnologias sem fio permitem que os dados sejam enviados rapidamente e podem ser usados para monitoramento em tempo real e no local31. combinaram o imunoensaio baseado em papel e smartphones para desenvolver uma plataforma POCT portátil, livre de equipamentos, rápida, de baixo custo e fácil de usar para malária, tuberculose e HIV32. relataram um ensaio de fluxo lateral combinado com uma câmera de smartphone para detectar quantitativamente a atividade da fosfatase alcalina no leite33. Hou e col. também desenvolveram um sistema de imagem de dupla modalidade baseado em smartphone para sinais quantitativos de cor ou fluorescência no ensaio de fluxo lateral34. Além disso, usar o smartphone como leitor colorimétrico e quantitativo pode melhorar a sensibilidade, enquanto o olho nu não pode relatar com confiança a presença do alvo35.

Apresentando um avanço no diagnóstico da dengue, o DEN-NS1-PAD 36,37,38 (doravante denominado dispositivo) oferece uma solução portátil e eficiente. Usando a tecnologia à base de papel microfluídico impresso em cera, este dispositivo quantifica a NS1 com alta sensibilidade e especificidade através do processamento de imagens. Para melhorar ainda mais sua utilidade, desenvolvemos um aplicativo de smartphone amigável para leitura colorimétrica e quantitativa. A validação clínica usando amostras de pacientes de hospitais tailandeses ressalta seu impacto imediato na avaliação do paciente em tempo real. Nossa inovação marca um avanço fundamental no gerenciamento simplificado da dengue no ponto de atendimento, prometendo revolucionar os diagnósticos em cenários de saúde com recursos limitados.

Protocolo

O Comitê de Ética do Comitê de Revisão Institucional, Departamento Médico do Exército Real Tailandês, Hospital Phramongkutklao, Bangkok, Tailândia (IRBRTA 1218/2562) concedeu aprovação. Na realização deste estudo, foram cumpridas todas as normas éticas necessárias.

1. Fabricação do dispositivo de imunoensaio baseado em papel

NOTA: O dispositivo de imunoensaio em papel foi fabricado seguindo métodos previamente estabelecidos36,37, e o pedido de patente tailandês nº 19010081638.

  1. Projeto e desenho de padrões: Projetar o dispositivo analítico de papel (Figura 1A,B) com 18 padrões de cera PAD em um computador.
    NOTA: O design é específico e destina-se a papel de tamanho A5. O número de PADs está relacionado ao tamanho do papel, conforme a necessidade do usuário.
  2. Imprima o padrão projetado no papel celulose usando uma impressora de cera (Tabela de Materiais).
  3. Derreta o papel impresso com cera num forno de laboratório durante 75 s a 150 °C. Posteriormente, guarde-o em uma caixa de sílica até que seja necessário para as etapas subsequentes.
  4. Aplicar 0,5 μL de poli-L-lisina (PLL) a 0,025% nas áreas de teste e controle. Incubar à temperatura ambiente (TR) durante 2 min numa caixa de sílica e, em seguida, aquecer no forno a 65 °C durante 5 min.
  5. Aplicar 0,5 μL de 1 μg μL-1 de anticorpo IgG de cabra anti-rato na área de controlo e 0,5 μL de 1 μg μL-1 do anticorpo de captura na área de ensaio. Deixe as gotas secar em uma caixa de sílica gel em RT por 30 min.
  6. Aplicar 2 μL do tampão de bloqueio na área da amostra, 3 μL na área conjugada e 2 μL na área de detecção. Deixe as gotas secar em RT em uma caixa de sílica gel por 30 min.
  7. Aplicar 2 μL de solução do complexo nanopartícula-anticorpo de ouro (AuNPs-Ab) na área conjugada e deixar secar em uma caixa de sílica gel em RT por 30 min.

2. Montagem do Imunoensaio em papel

  1. Remova cuidadosamente a película protetora no verso da placa de suporte de plástico adesivo para expor o adesivo.
  2. Alinhe o papel celulose tratado com o cartão de suporte de plástico adesivo e pressione firmemente as duas camadas juntas.
    OBS: Evite tocar no campo hidrofílico para minimizar o risco de contaminação ou danos ao aparelho.
  3. Aplique um filme plástico para revestir o papel e pressione-os.
  4. Corte a peça desejada de dispositivos usando tesouras de folhas de dispositivos completamente montados.
  5. Os DEN-NS1-PADs (Figura 1C) agora estão prontos para uso. Para estabilidade a longo prazo, armazene-os a 4 °C.

3. Preparação do conjugado AuNPs-Ab

NOTA: A AuNPs-Ab foi preparada conforme descrito anteriormente por Prabowo et al.36.

  1. Combinar 10 μL de 1 mg mL−1 de anticorpo anti-NS1 em PBS, 1 mL de coloide de AuNPs de 40 nm e 0,1 mL de tampão borato 0,1 M (pH 8,5).
  2. Girar a mistura a 50 rpm por 60 min e incubar em TR.
  3. Aplicar 0,1 mL de 10 mg mL−1 de BSA em BBS, girar a 50 rpm e incubar em RT por 15 min.
  4. Centrifugar a solução a 20,187 × g e 4 °C durante 30 min.
  5. Pipetar cuidadosamente e separar o sobrenadante dos AuNPs-Ab precipitados.
  6. Ressuspender o AuNPs-Ab em 500 μL de BBS e dispersá-lo usando sonicação.
  7. Repetir a centrifugação a 20,187 × g e 4 °C durante 30 minutos.
    NOTA: Repita os processos de dispersão e centrifugação 3x.
  8. Adicionar 50 μL do tampão conjugado à suspensão, deixando-a pronta para aplicação na área conjugada.

4. Desenvolvimento de aplicativos móveis

  1. Processamento de imagens e desenvolvimento de machine learning
    1. Reúna um conjunto de dados para um modelo de imagem supervisionado coletando mais de 900 imagens de foco automático de DEN-NS1-PADs, capturando várias condições, como diferentes concentrações, marcas de câmeras (12-13 megapixels), rotações (90° e 180°) e configurações de iluminação. Procure 30 imagens em cada condição específica.
    2. Rotule a verdade fundamental identificando e anotando duas regiões de interesse como as áreas de teste e controle dentro das imagens coletadas para aprendizado supervisionado.
    3. Crie um algoritmo para identificar a faixa de fundo. Localize a linha central entre as regiões de teste e controle, calcule seu ponto médio e estabeleça uma região quadrada proporcional ao tamanho médio das duas regiões principais, mantendo a mesma orientação rotacional.
    4. Crie um modelo de segmentação de imagem usando o conjunto de dados e os rótulos verdade de base das etapas 4.1.1 e 4.1.2 para treinar um modelo de segmentação de imagem para identificar as regiões de interesse.
  2. Algoritmo de aplicação
    1. Aplique o modelo de segmentação de imagem treinado a novas imagens para localizar automaticamente as regiões de teste, controle e plano de fundo.
    2. Use técnicas básicas de processamento de imagens para obter um único valor de intensidade para cada uma das três regiões de interesse (teste, controle e fundo).
    3. Transforme a imagem em uma representação de matriz 3D (canal y, x) para acessar valores de pixel.
    4. Converta a imagem em escala de cinza calculando a média dos valores RGB e aplique a inversão com a fórmula (255-x).
    5. Normalize os valores da área de teste e controle subtraindo o valor da área de fundo.
    6. Use a curva de calibração preestabelecida para calcular a concentração de NS1.
    7. Classificar os resultados em positivos ou negativos com base em um valor de corte de 0,1103 derivado das intensidades normalizadas da escala de cinza37.

5. Curva de calibração e sensibilidades

  1. Preparar amostra NS1 em soro humano para calibração com concentrações de 0, 0,1, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 e 1,0 μg mL-1.
  2. Lançar 50 μL de cada concentração sobre a área da amostra e efectuar medições em triplicata.
  3. Deixe as amostras entrarem completamente no dispositivo, o que pode levar de 20 a 30 minutos para obter resultados.
  4. Capture imagens do dispositivo usando uma câmera digital ou smartphone após 5 min de incubação.
  5. Analise as áreas de teste e controle usando o ImageJ e um aplicativo móvel personalizado.
  6. Construa a curva de calibração com base nos dados do ImageJ e do aplicativo móvel.
  7. Calcule o limite de branco (LOB), o limite de detecção (LOD) e o limite de quantificação (LOQ) usando as equações (1-3) abaixo:
    LOB = Média dos dados em branco + 1:645* ð (desvio padrão dos dados em branco) (1)
    LOD = LOB +1:645*ð (desvio padrão dos dados de concentração mais baixa) (2)
    LOQ = Média dos dados em branco + 10*ð (desvio padrão dos dados em branco) (3)

6. Realização de um imunoensaio em papel com amostras clínicas

  1. Coletar e processar 300 μL de sangue periférico de 30 pacientes no primeiro dia de internação em tubos de EDTA de topo roxo, seguindo boas práticas clínicas.
  2. Centrifugar o sangue a 2.884 × g e 4 °C durante 20 minutos.
  3. Transfira o componente líquido (plasma) para um tubo de polipropileno limpo usando uma pipeta.
  4. Conservar o plasma no congelador imediatamente a -20 °C para análise subsequente.
  5. Aplicar 20 μL de plasma na área da amostra na parte superior do dispositivo. Em seguida, adicionar 30 μL de tampão de lavagem (0,05% v/v Tween 20 em solução salina tamponada com fosfato 1x).
  6. Deixe a amostra entrar completamente no dispositivo, o que pode levar de 20 a 30 minutos para obter os resultados.
  7. Capture imagens do dispositivo usando uma câmera digital ou smartphone após 5 min de incubação à temperatura ambiente.
  8. Analise as áreas de teste e controle usando o ImageJ e um aplicativo móvel personalizado.

7. Quantificação com aplicativo móvel

NOTA: A intensidade do imunoensaio em papel é analisada no aplicativo móvel (Figura 2).

  1. Abra o aplicativo móvel desenvolvido no smartphone.
  2. Selecione Usar câmera ou Carregar da Galeria para escolher ou carregar a fonte de dados. Faça isso por meio da captura da câmera ou selecionando uma imagem da galeria do dispositivo.
  3. Navegue até a seção analítica e toque no botão Analisar na tela.
  4. Aguarde até que o aplicativo analise os dados e exiba os resultados.

Resultados

A seleção de um método de fabricação é fundamental para garantir desempenhos de ensaio reprodutíveis em dispositivos de imunoensaio baseados em papel. Em nosso estudo, exploramos vários processos de fabricação e materiais no contexto da demonstração de um imunoensaio baseado em papel. Nosso método escolhido utiliza um sistema de impressão de cera para criar barreiras hidrofóbicas dentro de dispositivos microfluídicos à base de papel. Essa abordagem se destaca pela simplicidade, rapidez e resultados consi...

Discussão

Um dos parâmetros de projeto importantes para um sistema leitor baseado em smartphone é a capacidade de fornecer processamento de imagem reprodutível de amostras. Neste estudo, para simplicidade e conveniência, as imagens foram capturadas de três marcas diferentes de smartphones com câmeras de 12 a 13 MP, sem o uso de caixa de imagem ou acessórios. Condições variáveis de captura de imagem, como a resolução da câmera, o tempo de captura da imagem, as condições de iluminação e o ambiente, podem influenciar...

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

M.H.P. agradece o fundo de pesquisa de bolsas da Universitas Islam Indonesia (UII). Os autores estendem sua gratidão ao Sr. Nutchanon Ninyawee por sua valiosa experiência e assistência durante o desenvolvimento do aplicativo móvel e suas contribuições para o manuscrito. Além disso, os autores agradecem o apoio financeiro fornecido pela Tailândia Science Research and Innovation (TSRI), Fundo de Pesquisa Básica: Ano fiscal de 2023 (projeto nº. FRB660073/0164) no âmbito do Programa Smart Healthcare da Universidade de Tecnologia de Thonburi do Rei Mongkut.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Materials
0.1 M phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.2) 
BBS containing 0.1% Tween 20, 10% sucrose, and 1% casein  the conjugate area treatment and blocking buffer
Borate buffered saline (BBS) (25 mM sodium borate and 150 mM sodium chloride at pH 8.2) supplemented with 1% BSA the washing buffer during the conjugation process AuNPs with the antibody
Boric acidMerck10043-35-3
Bovine serum albumin fraction V (BSA)  PAA Lab GmbH (Germany)K41-001 
CaseinMerck9005-46-3
Chromatography paper Grade 2 GE Healthcare3002-911 
Clear laminate film3M (Stationery shops)
Disodium hydrogen phosphateMerck7558-79-4
Double tape sideStationery shops
Goat anti-mouse IgG antibody MyBiosource (USA)MBS435013
Gold nanoparticles (40 nm)  Serve Science Co., Ltd. (Thailand)
Human IgG polyclonal antibody  MerckAG711-M
Mouse dengue NS1 monoclonal antibody MyBiosource (USA)MBS834415
Mouse dengue NS1 monoclonal antibody MyBiosource (USA)MBS834236
NS1 serotype 2 antigensMyBiosource (USA)MBS 568697
PBS 1X containing 0.1% Tween 20 was used as telution buffer
Plastic backing card 10x30 cmPacific Biotech Co., Ltd. (Thailand)
Poly-L-lysine (PLL)Sigma AldrichP4832
Potassium ChlorideMerck104936
Potassium monophosphateMerck104877
Sodium ChlorideMerck7647-14-5
Sodium tetraborate Sigma Aldrich1303-96-4
SucroseMerck57-50-1
Tween 20Sigma Aldrich9005-64-5
Instruments
CytationTM 5 multimode readerBioTek
Mobile phonesHuawei Y7, iPhone 11, Samsung a20
Photo scannerEpson Perfection V30
OvenMemmert
Wax printer Xerox ColorQube 8880-PS
Software
Could AutoML Vision Object Detection documentationGoogle Cloud
ImageJNational Institute of Health, Bethesda, MD, USA
Inkscape 0.91 Software

Referências

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