Epon Post Embedding Correlative Light e Microscopia Eletrônica

Resumo

Apresentamos um protocolo detalhado para microscopia eletrônica e de luz correlativa pós-incorporação de Epon usando uma proteína fluorescente chamada mScarlet. Este método pode manter a fluorescência e a ultraestrutura simultaneamente. Esta técnica é passível de uma ampla variedade de aplicações biológicas.

Resumo

A microscopia correlativa de luz e eletrônica (CLEM) é uma microscopia abrangente que combina as informações de localização fornecidas pela microscopia de fluorescência (FM) e o contexto da ultraestrutura celular adquirida pela microscopia eletrônica (ME). CLEM é um trade-off entre fluorescência e ultraestrutura e, geralmente, a ultraestrutura compromete a fluorescência. Em comparação com outras resinas de incorporação hidrofílica, como metacrilato de glicidila, HM20 ou K4M, Epon é superior em propriedades de preservação e seccionamento de ultraestrutura. Anteriormente, demonstramos que o mEosEM pode sobreviver à fixação de tetróxido de ósmio e à incorporação de Epon. Usando o mEosEM, conseguimos, pela primeira vez, o Epon pós-incorporação CLEM, que mantém a fluorescência e a ultraestrutura simultaneamente. Aqui, fornecemos detalhes passo a passo sobre a preparação da amostra EM, a imagem FM, a imagem EM e o alinhamento da imagem. Também aprimoramos os procedimentos de identificação da mesma célula por imagem de FM durante a imagem de EM e detalhamos o registro entre as imagens de FM e EM. Acreditamos que se pode facilmente obter Epon pós-incorporação de microscopia correlativa de luz e eletrônica seguindo este novo protocolo em instalações tradicionais de EM.

Introdução

A microscopia de fluorescência (FM) pode ser usada para obter a localização e distribuição da proteína-alvo. No entanto, o contexto que envolve a proteína-alvo é perdido, o que é crucial para investigar a proteína alvo completamente. A microscopia eletrônica (ME) tem a mais alta resolução de imagem, fornecendo vários detalhes subcelulares. No entanto, a EM carece de rotulagem de alvo. Ao mesclar com precisão a imagem de fluorescência obtida por FM com a imagem cinza adquirida por EM, a microscopia correlativa de luz e eletrônica (CLEM) pode combinar as informações obtidas por esses dois modos de imagem 1,2,3,4.

Protocolo

A criação de animais e os experimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Fujian Medical University Medical Center. O fluxo de trabalho passo a passo do protocolo atual é mostrado na Figura 1.

1. Preparação da amostra

1. Cérebro de camundongo
   1. Compre camundongos transgênicos (veja Tabela de Materiais) e primers de oligonucleotídeos (veja Tabela de Materiais) para genotipar esses camundongos.
   2. Perfundir e remover o cérebro íntegro da abóbada craniana seguindo protocolo previamente publicado

Discussão

O protocolo aqui apresentado é um método de imagem versátil, que pode combinar as informações de localização da proteína-alvo da microscopia de luz (LM) e o contexto em torno da proteína-alvo da microscopia eletrônica (ME)⁶. Com as limitações das proteínas fluorescentes atuais, o método amplamente utilizado é a pré-incorporação de microscopia eletrônica e de luz correlativa (CLEM), o que significa que a imagem de LM é feita antes da preparação da amostra EM. Quase todas as pr.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 M Phosphate Buffer (PB)			NaH2PO4 · 2H2O+Na2HPO4 · 12H2O
0.2 M Tris-Cl (pH 8.5)	Shanghai yuanye Bio-Technology	R26284
25% Glutaraldehyde (GA)	Alfa Aesar	A17876	Hazardous chemical
Abbelight 3D	Nanolnsights
Acetone	SCR	10000418
Ammonium hydroxide	J&K Scientific	335213
BioPhotometer D30	eppendorf
Cleaning buffer of cover glasses			50 mL Ammonium hydroxide, 50 mL Hydrogen peroxide, 250 mL H2O
Coverglass	Warner	64-0715
DABCO	Sigma	290734	Hazardous chemical
DDSA	SPI company	GS02827	Hazardous chemical
Desktop centrifuge	WIGGENS	MINICEN 10E
Diamond knife	DiATOME	MX6353
DMP-30	SPI company	GS02823	Hazardous chemical
DNA transfection reagent	Thermo Fisher	2696953	Lipofectamine 3000 Transfection Kit
Epon 812	SPI company	GS02659	Hazardous chemical
Ethanol	SCR	10009218
Fiji image J	National Institutes of Health
Fixative solution			4% PFA+0.25% GA+0.02 M PB
Formvar	Sigma	9823
Glycerol	SCR	10010618
Gold nanoparticles	Corpuscular	790120-010
Gradient resin			Acetone to resin 3:1, 1:1, 1:3
Hydrofluoric acid	SCR	10011118
Hydrogen peroxide	SCR	10011218
ICY (https://icy.bioimageanalysis.org/about/)			Easy CLEMv0 Plugin
Imaging chamber	Thermo Fisher	A7816
Large gelatin capsules	Electron Microscopy Sciences	70117
Mounting buffer			Mowiol 4-88, Glycerol, 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5), DABCO
Mowiol 4-88	Sigma	9002-89-5
Na2HPO4 ž12H2O	SCR	10020318
NaH2PO4 ž2H2O	SCR	20040718
NMA	SPI company	GS02828	Hazardous chemical
Oligonucleotide primers	Takara Biomedical Technology (Beijing)		Three oligonucleotides primers were used to detect Vglut2-ires-Cre and wild-type simultaneously. The primers 5,-ATCGACCGGTAATGCAGGCAA-3, and 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, aimed to detect Vglut2-ires-Cre. The primers  5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, and 5,-CATGGTCTGTTTTGAATTCAG-3, aimed to detect wild-type.
Oscillating microtome	Leica	VT1000S
Osmium tetroxide	SCR	L01210302	Hazardous chemical
OsO4 solution			1% Osmium tetroxide+1.5% K4Fe (CN)6·3H2O
Parafilm	Amcor	PM-996
Paraformaldehyde (PFA)	SCR	80096618	Hazardous chemical
Perfusion buffer			4% PFA+0.1 M PB
Pioloform	Sigma	63148-65-2	Hazardous chemical
Poly-L-lysine	Sigma	25986-63-0
Potassium ferrocyanide (K4Fe (CN)6·3H2O)	SCR	10016818
Scalpel blades	Merck	S2771
Scalpel handles	Merck	S2896-1EA
Stereomicroscope	OLYMPUS	MVX10
Transgenic mice	The Jackson Laboratory		Vglut2-ires-Cre mice (strain: 129S6/SvEvTac) were housed in standard conditions (25 °C, a 12 h light/dark cycle, with water and food given ad libitum. Male and Female mice were used at 2–3 months old, weight range 20-30 g.
Transmission electron microscope (TEM)	FEI		TECNAL G2
UA solution (2% UA)			Aqueous solution
Ultramicrotome	Leica	LEICA EM UC6
Uranyl acetate (UA)	TED PELLA	19481	Hazardous chemical