Isolamento imunomagnético das células-tronco CD34+ residentes na parede vascular de camundongos

Resumo

Este estudo estabeleceu um método estável e eficiente para o isolamento, cultura e determinação funcional de células-tronco CD34⁺ residentes na parede vascular (CD34⁺ VW-SCs). Este método de isolamento fácil de seguir e eficaz em termos de tempo pode ser utilizado por outros investigadores para estudar os mecanismos potenciais envolvidos nas doenças cardiovasculares.

Resumo

As células-tronco e progenitoras residentes na parede vascular CD34⁺ residentes (VW-SCs) são cada vez mais reconhecidas por seu papel crucial na regulação da lesão e reparo vascular. Estabelecer um método estável e eficiente para cultivar VW-SCs CD34⁺ murinos funcionais é essencial para investigar ainda mais os mecanismos envolvidos na proliferação, migração e diferenciação dessas células sob várias condições fisiológicas e patológicas. O método descrito combina triagem de esferas magnéticas e citometria de fluxo para purificar VW-SCs CD34⁺ residentes em cultura primária. As células purificadas são então identificadas funcionalmente por meio de coloração por imunofluorescência e imagem de Ca²⁺ . Resumidamente, as células vasculares da adventícia da aorta murina e da artéria mesentérica são obtidas por meio da fixação de blocos teciduais, seguida de subcultura até atingir uma contagem de células de pelo menos 1 × 10⁷. Posteriormente, os VW-SCs CD34⁺ são purificados usando classificação magnética de esferas e citometria de fluxo. A identificação de VW-SCs CD34⁺ envolve a coloração por imunofluorescência celular, enquanto a multipotência funcional é determinada pela exposição das células a um meio de cultura específico para diferenciação orientada. Além disso, a liberação funcional interna de Ca²⁺ e a entrada externa de Ca²⁺ são avaliadas usando uma estação de trabalho de imagem disponível comercialmente em células carregadas com Fura-2 / AM expostas a ATP, cafeína ou tapsigargina (TG). Este método oferece uma técnica estável e eficiente para isolar, cultivar e identificar células-tronco CD34⁺ residentes na parede vascular, proporcionando uma oportunidade para estudos in vitro sobre os mecanismos regulatórios de VW-SCs e a triagem de medicamentos direcionados.

Introdução

A parede vascular desempenha um papel fundamental no desenvolvimento vascular, na regulação homeostática e na progressão de doenças vasculares. Nos últimos anos, vários estudos revelaram a presença de várias linhagens de células-tronco nas artérias. Em 2004, o grupo do professor Qingbo Xu relatou pela primeira vez a existência de células-tronco vasculares / progenitoras na periferia da parede vascular adulta, expressando CD34, Sca-1, c-kit e Flk-1¹. Essas células-tronco vasculares exibem potencial de diferenciação e proliferação multidirecional. Em condições normais, eles permanecem relativamente quiescentes; no entanto, quando ativados por fatores específicos, eles podem se diferenciar em células musculares lisas, células endoteliais e fibroblastos. Alternativamente, eles podem regular a formação da matriz perivascular e dos microvasos por meio de efeitos parácrinos para promover o reparo ou remodelamento dos vasos lesados 2,3,4,5,6. Recentemente, descobriu-se que as células-tronco CD34⁺ residentes na parede vascular desempenham um papel na regeneração das células endoteliais após lesão do fio-guia da artéria femoral². Consequentemente, o isolamento e a quantificação de VW-SCs CD34⁺ e o exame das características biológicas básicas das células-tronco CD34⁺ são cruciais para o estudo das vias de sinal envolvidas na regulação das VW-SCs CD34⁺.

Vários métodos de separação celular estão atualmente disponíveis, incluindo técnicas baseadas nas características da cultura celular ou propriedades físicas das células, como centrifugação por gradiente de densidade, que resulta em células classificadas contendo muitas células não-alvo e pureza relativamente baixa 7,8,9,10,11,12 . Outra técnica comumente usada é a classificação de células por fluorescência / magnética. A classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) é um sistema complexo com altos requisitos técnicos, relativamente caro, demorado e potencialmente afeta a atividade das células selecionadas^13,14. No entanto, a classificação de células ativadas por magnetismo (MACS) é mais eficiente e conveniente, com alta taxa de recuperação e atividade celular e menor impacto em aplicações a jusante⁸. Portanto, neste protocolo, aplicamos MACS para purificar CD34⁺ VW-SCs e identificamos as células por citometria de fluxo. O estabelecimento de métodos de isolamento baseados em MACS para estudar células-tronco da parede vascular seria inestimável. Em primeiro lugar, permite estudos experimentais genéticos e biológicos celulares. Em segundo lugar, o isolamento eficiente e a cultura de células-tronco residentes na parede vascular permitem a avaliação sistemática e a triagem dos fatores de sinalização que regulam as funções das células-tronco. Em terceiro lugar, a identificação de fenótipos cruciais em células-tronco fornece um importante "controle de qualidade" na avaliação do status celular. Assim, a identificação de métodos de purificação pode ser útil para aplicações semelhantes a células-tronco análogas derivadas de vasos.

Este relatório fornece uma demonstração detalhada de um método estável e confiável para a cultura de CD34⁺ VW-SCs, incluindo identificação celular e avaliação funcional realizada por citometria de fluxo, coloração por imunofluorescência e medição de sinalização de Ca²⁺ . Este estudo fornece uma base para pesquisas mais aprofundadas sobre a função dos CD34⁺ VW-SCs e seus mecanismos regulatórios em condições fisiológicas e patológicas.

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Protocolo

Este estudo foi aprovado e os animais foram manejados de acordo com as Diretrizes para o Manejo e Uso de Animais de Laboratório na China. A pesquisa seguiu rigorosamente os requisitos éticos dos experimentos com animais, com aprovação do Comitê de Ética Animal (Número de Aprovação: SWMU2020664). Camundongos C57BL/6 saudáveis de oito semanas de idade, de ambos os sexos, pesando entre 18-20 g, foram utilizados para o presente estudo. Os animais foram alojados no Centro de Animais de Laboratório da Southwest Medical University (SWMU).

1. Cultura de blocos teciduais de adventícia da aorta e artérias mesentéricas

1. Isolamento de VW-SCs CD34⁺ residentes
   1. Anestesiar dois camundongos com inalação de isoflurano a 3% (seguindo protocolos aprovados institucionalmente). Confirme a anestesia adequada beliscando os dedos. Posicione o mouse em decúbito dorsal com fita adesiva e borrife desinfetante com etanol 70% para desinfetar o pelo do mouse. Abra as cavidades torácica e abdominal usando tesouras oftálmicas estéreis e fórceps para expor o coração e os intestinos. Depois de dissecar a aorta isolada e as artérias mesentéricas, prenda a aorta e o leito mesentérico em uma placa de Petri contendo elastômero de silicone e preenchido com uma solução salina fisiológica. Com outro conjunto de tesouras e pinças esterilizadas, disseque rapidamente a gordura ao redor da aorta e das artérias mesentéricas.
   2. Transfira os tecidos dissecados para uma placa de Petri de 6 cm contendo solução de penicilina-estreptomicina-anfotericina B a 1% (ver Tabela de Materiais). Depois de enxaguar duas vezes, transfira as artérias para uma capa de cultura de tecidos sob um microscópio estéreo.
   3. Corte as artérias longitudinalmente e use uma pinça fina para descascar a camada externa da aorta e o primeiro ramo das artérias mesentéricas. Transfira as camadas externas para uma placa de Petri de 3,5 cm contendo 0,1-0,2 mL de meio de cultura (consulte a Tabela de Materiais). Corte as camadas externas em pedaços minúsculos (cerca de 1 mm³).
   4. Transferir os pedaços de tecido para um balão T25 revestido com gelatina, assegurando uma distribuição uniforme no fundo do balão. Mantenha uma distância moderada entre os pedaços de tecido para facilitar o rastreamento e o crescimento das células. Colocar o balão verticalmente numa incubadora (37 °C, CO₂ a 5%) durante 3 h para permitir que blocos de tecido adiram ao fundo do balão.
   5. Após 3 h, adicione 5 mL de meio de crescimento com alto teor de glicose DMEM para submergir os blocos de tecido. Orientar horizontalmente o balão T25. Monitore a migração celular ao redor dos blocos de tecido por meio de um microscópio em intervalos de 3 dias.
      NOTA: O meio deve conter 20% de soro fetal bovino, 0,2% de Fator Inibidor de Leucemia (LIF), 0,2 mM de β-Mercaptoetanol e 1% de penicilina/estreptomicina (ver Tabela de Materiais). O soro fetal bovino suporta a proliferação celular, enquanto o LIF e o β-mercaptoetanol impedem a diferenciação celular ^7,8.
   6. Quando as células no frasco T25 atingirem cerca de 80% de confluência, passá-las e cultivá-las em um ou dois frascos T75. Subcultive as células em cinco passagens para garantir o crescimento e a saúde adequados.
2. Separação magnética de células-tronco CD34⁺ residentes
   1. Quando as células em um ou dois frascos T75 atingirem 80% de confluência, dissocie as células com tripsina e ressuspenda-as em 1 mL de tampão de triagem (2 mM EDTA e 0,5% FBS). Determinar o número de células (balão 10⁷/T75) e centrifugar a suspensão de células a 300 x g durante 5 min (à temperatura ambiente).
   2. Rejeitar completamente o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 98 μL de tampão de triagem por 10⁷ células totais. Adicione 2 μL de anticorpo CD34 (consulte a Tabela de Materiais). Misture bem e incube por 30 min a 4 ° C no escuro com agitação ocasional.
   3. Lave as células adicionando 2 mL de tampão de classificação e centrifugue a 300 x g por 10 min em temperatura ambiente.
   4. Remova o sobrenadante com cuidado e completamente e ressuspenda as células em 80 μL de tampão de classificação.
   5. Adicione 20 μL de MicroBeads Anti-FITC (por 10⁷ células totais, consulte a Tabela de Materiais) no tampão. Misturar bem pipetagem repetitiva e incubar durante 15 min a 4 °C no escuro com agitação intermitente.
   6. Lave as células duas vezes adicionando 2 mL de tampão e centrifugue a 300 x g por 5 min para repelir as células. Descarte o sobrenadante completamente e ressuspenda as células em 1 mL de tampão.
   7. Posicione uma coluna MS dentro do campo magnético de um separador apropriado, garantindo que um tubo de coleta (por exemplo, um tubo de centrífuga de 15 mL) seja colocado abaixo da coluna MS para coletar os componentes separados. (ver Tabela de Materiais). Enxágue a coluna com tampão de 500 μL e espere até que ela tenha passado completamente.
   8. Carregue a suspensão celular na coluna e colete o fluxo contendo células não marcadas no tubo de 15 mL.
   9. Remova a coluna do separador e coloque-a em um novo tubo de centrífuga de 15 mL. Introduza 500 μL de tampão na coluna e, em seguida, lave imediatamente as células marcadas magneticamente empurrando o êmbolo para dentro da coluna.
   10. Para aumentar a pureza das células CD34⁺ , a fração eluída pode ser enriquecida usando uma segunda coluna MS. Repita o processo de separação conforme mencionado acima. Avaliar a pureza das células triadas por citometria de fluxo.
       NOTA: Normalmente, 10% -20% de células CD34 ⁺ são obtidas, com cerca de 70% -80% de células negativas e aproximadamente 10% de perda devido a procedimentos de coloração e centrifugação.
   11. Para confirmar ainda mais a pureza das células-tronco CD34⁺ da parede vascular, identifique as células classificadas por citometria de fluxo. O presente estudo mostrou uma pureza de mais de 90%.

2. Identificação celular por imunofluorescência

1. Células de sementes em lamínulas (diâmetro 8 mm) pré-revestidas com gelatina a 0,04%.
2. Quando as células atingirem cerca de 60% -70% de confluência, enxágue duas vezes com PBS e fixe as células com paraformaldeído a 4% por 10 min.
3. Lave as células com PBS por 3 min (3 vezes) e permeabilize as células com 0,2% de Triton X-100 (em PBS) por 5 min em temperatura ambiente.
4. Lave as células com PBS por 3 min (3 vezes) e bloqueie a ligação não específica dos anticorpos com 5% de soro de burro (em PBS) por 1 h.
5. Remova o tampão de bloqueio segurando cada lamínula em sua borda com uma pinça e drenando-a em uma folha de lenço umedecido sem fiapos.
6. Incubar as células em anticorpos primários diluídos 100 vezes (CD34, Flk-1, c-kit, Sca-1, Ki67, ver Tabela de Materiais) em 1% BSA (em PBS) durante a noite a 4 ° C.
7. Transvase a solução e lave as células com PBS durante 3 min (3 vezes). Incube as células com anticorpo secundário marcado com Alexa Fluor 488 (1:200 em 1% BSA) (consulte a Tabela de Materiais) por 1 h em temperatura ambiente no escuro.
8. Realize a contracoloração de DAPI diluindo a solução estoque de DAPI a 0,5 μg / mL em PBS e incubando células por 5 min.
9. Enxágüe com PBS e sele as lamínulas com reagente antidesbotamento. Capture imagens sob o microscópio confocal de varredura a laser.

3. Diferenciação induzida e caracterização de VW-SCs CD34⁺

1. Semeie células-tronco CD34⁺ em uma densidade apropriada (40% -50% de confluência) em lamínulas e placas de 6 poços, respectivamente.
2. Induza a diferenciação orientada para células endoteliais de células CD34 ⁺ cultivando células em meio de cultura de células endoteliais EBM-2 (ver Tabela de Materiais) por 1 semana.
3. Induza a diferenciação orientada para células de fibroblastos de células CD34 ⁺ cultivando células em meio de cultura de células de fibroblastos FM-2 (ver Tabela de Materiais) por 3 dias.
4. Sujeitar as células indiferenciadas e diferenciadas à coloração por imunofluorescência (conforme mencionado na etapa 2) com excitação a laser de 488 nm e uma objetiva de 40x. Detectar a expressão de marcadores de células endoteliais (CD31, VWF) e marcadores de células de fibroblastos (PDGFRα, Vimentina) (ver Tabela de Materiais).
5. Dissocie as células com tripsina e obtenha o pellet celular por centrifugação (300 x g, 5 min, temperatura ambiente). Ressuspenda as células com 100 μL de tampão de classificação. Pré-incubar a suspensão celular com mAb anti-rato CD16/CD32 purificado (1 μg) (ver Tabela de Materiais) a 4 °C durante 5 min.
6. Adicione 2 μL de anticorpo monoclonal APC anti-camundongo PE Rat CD34 (1:50), anticorpo monoclonal APC CD31 (PECAM-1) (2 μL, 1:50) e anticorpo monoclonal CD140a (PDGFRa) FITC (2 μL, 1:50) diretamente às células pré-incubadas na presença de Mouse Fc Block e incube ainda a 4 ° C por 15 min.
7. Lave as células duas vezes adicionando 2 mL de tampão e centrifugue a 300 x g por 5 min (temperatura ambiente) para repelir as células. Rejeitar completamente o sobrenadante e ressuspender as células em 300 μL de tampão. Coloque tubos de fluxo com células coradas em uma caixa de gelo pronta para citometria de fluxo.

4. Detecção de sinalização intracelular de Ca²⁺ em células-tronco CD34⁺ vasculares

1. Células-semente em lamínulas 10 h antes dos experimentos em uma densidade de até 70% de confluência.
2. Retire as lamínulas e cole-as no fundo de uma câmara personalizada com qualquer vaselina.
3. Lave as lamínulas uma vez com PBS, substitua por Fura-2 / AM (5 μM) na solução de Tyrode (NaCl 137 mM, KCl 5,4 mM, MgCl₂ 1,2 mM, glicose 10 mM, HEPES 10 mM, CaCl₂ 2,4 mM) (ver Tabela de Materiais) e incube as células por 30 min no escuro.
4. Remova o corante tratando com a solução de Tyrode por 10 min para permitir a desesterificação do fura-2 / AM.
5. Monte a câmara no palco de um microscópio de fluorescência invertida equipado com um sistema de imagem de campo amplo contendo um monocromador e uma câmera CCD (consulte a Tabela de Materiais).
6. Abra a janela principal, vá para a caixa de diálogo Configurações de captura e a página da câmera e pressione o botão ao vivo para exibição de imagem ao vivo .
7. Escolha o tipo de imagem de fluorescência, defina os tempos de repetição de loop de 340 nm/380 nm, o tamanho da imagem e o tempo de exposição da câmera em 380 nm e 340 nm para obter o brilho ideal da imagem.
8. Tire instantâneos únicos e desenhe várias linhas à mão livre para circular as células com cores diferentes e predefinir a Região de Interesses (ROIs), indicando o plano de fundo como ROI 0.
9. Reedite um protocolo já incorporado na visualização da área de trabalho e crie uma nova área de trabalho.
10. Execute o protocolo e o "Fluorescência 340 nm div Fluorescência 380 nm (Cinética ao vivo)" exibirá o gráfico cinético online.
11. Na visualização numérica, uma planilha ficará visível, apresentando colunas de valores em escala de cinza e informações de tempo correspondentes. Exporte os dados da planilha usando a área de transferência.
12. Calcular F340 nm/F380 nm indicando alterações intracelulares de Ca²⁺ após subtrair a fluorescência de fundo (ROI 0).

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Resultados

Isolamento e purificação de CD34⁺ VW-SCs
A alta pureza dos VW-SCs CD34⁺ é obtida a partir da adventícia da artéria aórtica e mesentérica de camundongo por fixação tecidual e classificação de microesferas magnéticas. A porcentagem de células CD34⁺ na parede do vaso é geralmente de 10% a 30%. A citometria de fluxo confirma que a pureza das células CD34⁺ obtidas por classificação magnética de esferas é superior a 90% (Fig...

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Discussão

Este estudo fornece um método rápido e conveniente para a obtenção de VW-SCs CD34⁺ funcionais da aorta e artérias mesentéricas de camundongos. Os VW-SCs CD34⁺ obtidos por este método têm atividade proliferativa e propriedades de diferenciação multidirecional. Os receptores de trifosfato inositol 1,4,5-trifosfato (IP₃Rs), os receptores de rianodina (RyRs) e os canais de cálcio operados por armazenamento medeiam a liberação e entrada de Ca²⁺ em VW-SCs CD34⁺

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2% gelatin solution	Sigma	G1393
Anti-CD31 antibody	R&D	AF3628
Anti-CD34 antibody	Abcam	ab81289
Anti-c-kit antibody	CST	77522
Anti-FITC MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-701
Anti-FITC MicroBeads MACS	Miltenyi Biotec	130-048-701
Anti-Flk- 1 antibody	Abcam	ab24313
Anti-Ki67 antibody	CST	34330
Anti-PDGFRα antibody	Abcam	ab131591
Anti-Sca- 1 antibody	Invitrogen	710952
CD140a (PDGFRA) Monoclonal Antibody (APA5), FITC	eBioscience  Invitrogen	11-1401-82
CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), APC	eBioscience  Invitrogen	17-0311-82
CD34 Antibody, anti-mouse, FITC, REAfinity Clone REA383	Miltenyi Biotec	130-117-775
cell culture hood	JIANGSU SUJING GROUP CO.,LTD	SW-CJ-2FD
Centrifuge	CENCE	L530
CO2 incubators	Thermofisher Scientific	4111
Confocal laser scanning microscope	Zeiss	zeiss 980
DMEM High Glucose Medium	ATCC	30-2002
EBM-2 culture medium	Lonza	CC-3162
FACSMelody	BD Biosciences
FACSMelody™ System	BD
Fetal bovine serum	Millipore	ES-009-C
FM-2 culture medium	ScienCell	2331
Fura-2/AM	Invitrogen	M1292
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488	Thermofisher Scientific	A32731
Leukemia inhibitory factor	Millipore	LIF2010
Microscope	Olympus	IX71
MiniMACS   Starting Kit	Miltenyi Biotec	130-090-312
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution	Beyotime	C0224
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)	BD Pharmingen	553141
Stereo Microscope	Olympus	SZX10
TILLvisION 4.0 program	T.I.L.L.Photonics GmbH	polychrome V
VWF Monoclonal Antibody (F8/86)	Thermofisher Scientific	MA5-14029
β-Mercaptoethanol	Thermofisher Scientific	21985023