Reconstrução Vascular com a Técnica do Manguito no Transplante Hepático Ortotópico de Camundongo

Resumo

Este protocolo fornece informações técnicas para a reconstrução de vasos usando a técnica do manguito no transplante hepático ortotópico de camundongos.

Resumo

O transplante hepático ortotópico de camundongos é uma metodologia eficaz para investigar os mecanismos subjacentes da isquemia hepática e lesão de reperfusão. No entanto, os desafios técnicos representam uma barreira para a utilização desse valioso modelo experimental e a transmissão dessas habilidades para a próxima geração. O aspecto mais desafiador desse procedimento é a reconstrução vascular, incluindo a veia porta (VP), a veia cava inferior infra-hepática (IHIVC) e a veia cava inferior supra-hepática. O uso de manguitos de plástico, em vez de suturas, permite uma reconstrução mais suave da VP e da IHIVC. Os vasos são reconstruídos anexando um manguito feito de um cateter intravenoso à ponta do vaso do enxerto e interpondo o manguito no vaso receptor. Os dois aspectos mais cruciais são visualizar adequadamente o lúmen interno do vaso e evitar o uso de força excessiva. Nosso objetivo é fornecer uma visão geral técnica das reconstruções vasculares usando a técnica do manguito na cirurgia do receptor. Espera-se que essas dicas técnicas para a técnica do manguito ajudem os microcirurgiões a facilitar a reconstrução vascular e avançar em suas pesquisas.

Introdução

O transplante hepático ortotópico de camundongo (MOLT) é um método experimental eficaz relatado pela primeira vez em 1991¹. Este modelo experimental, que utiliza camundongos geneticamente modificados e vários reagentes de pesquisa, desempenhou um papel fundamental na investigação de lesões de isquemia e reperfusão quentes e frias. No entanto, a alta complexidade técnica do modelo tem dificultado o desenvolvimento da medicina básica para transplante hepático². O MOLT envolve três etapas principais: (1) recuperação do fígado do camundongo doador, (2) cirurgia na mesa dorsal e (3) implantação do fígado no receptor. Dentre esses procedimentos receptores, a anastomose vascular representa o maior desafio. Enquanto a anastomose da veia cava inferior supra-hepática é tipicamente completada por costura à mão², a veia cava inferior infra-hepática (IHIVC) e a veia porta (PV) podem ser reconstruídas de forma mais eficiente usando manguitos de plástico no lugar de suturas costuradas à mão.

O período anepático significa o intervalo entre a remoção do fígado nativo do receptor e o implante do enxerto. Para garantir resultados consistentes, é imperativo limitar o tempo anepático a menos de 20 min. Consequentemente, os estudos que empregam esse modelo têm sido confinados a instituições específicas 3,4,5,6,7,8,9. Entre os vários estágios do MOLT, a reconstrução suave de PV e IHIVC é crucial para minimizar o tempo anepático e garantir o sucesso do transplante.

A reconstrução da VP e da VCI é geralmente realizada com manguitos vasculares, uma vez que a técnica do balonete simplifica a anastomose vascular em comparação com as suturas costuradas à mão ^2,5,8. A técnica envolvida na preparação do manguito vascular e na fixação segura do manguito afeta significativamente a complexidade da reconstrução vascular do receptor. Nosso objetivo é fornecer orientação visual detalhada para inúmeras dicas técnicas relacionadas ao método do manguito, reduzindo assim a curva de aprendizado. Esses videoclipes fornecerão uma compreensão clara de como prender o manguito aos vasos e reconstruir o PV e o IHIVC durante a cirurgia do receptor.

Protocolo

O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Experimentação Animal da Universidade de Kyoto. O estudo utilizou camundongos C57BL/6, com idade superior a 10 semanas e peso entre 25 g e 30 g, obtidos de uma fonte comercial (ver Tabela de Materiais). Todos os animais foram anestesiados com isoflurano a 2,5% (seguindo protocolos aprovados institucionalmente), mantidos em condições específicas livres de patógenos, e todos os procedimentos experimentais foram conduzidos em conformidade com o Regulamento de Experimentação Animal da Universidade de Kyoto. Os instrumentos apropriados utilizados para o estudo estão listados na Tabela de Materiais e representados na Figura 1 e na Figura 2.

1. Seleção de animais

1. Use ratos com um peso corporal de 25-30 g.
   NOTA: Embora os aloenxertos de fígado de camundongo² sejam geralmente aceitos através da barreira do complexo principal de histocompatibilidade, optamos pelo modelo MOLT singênico neste estudo para focar no mecanismo detalhado da lesão de reperfusão de isquemia fria¹⁰. Camundongos com peso inferior a 25 g não são recomendados porque é impossível inserir um stent interno em um ducto biliar fino. Da mesma forma, camundongos com peso superior a 30 g não são recomendados devido à presença de uma grande quantidade de gordura intra-abdominal ao redor dos vasos.

2. Fabricação de manguitos

1. Prepare cateteres intravenosos de 20 G e 16 G para PV e IHIVC, respectivamente.
2. Usando um bisturi, corte o cateter para criar o manguito. O corpo principal do manguito deve medir 2 mm de comprimento, com uma alça de extensão de 1 mm (Figura 3A).
   NOTA: Se a alça for muito grande, pode ser um desafio inserir o manguito.
3. Na superfície do manguito, crie uma ranhura rasa para fixação da linha usando a parte de trás da lâmina do bisturi.
   NOTA: Ao aplicar a parte de trás da lâmina do bisturi no manguito, certifique-se de que a ponta da lâmina esteja em um ângulo de aproximadamente 60 graus (conforme mostrado na Figura 3B). Depois de fazer a primeira ranhura, prenda a lâmina do bisturi e gire o manguito. Idealmente, duas ranhuras são recomendadas, mas uma única ranhura pode ser suficiente sem problemas.

3. Fixação do manguito

1. Em um recipiente de plástico retangular, coloque pequenos cubos de gelo e posicione um pequeno copo de metal (6 cm de diâmetro) por cima. Encha o copo com fluido de preservação de órgãos (consulte a Tabela de Materiais) e coloque o enxerto singênico dentro.
2. Role suavemente o enxerto de fígado singênico (extraído de outro camundongo doador) usando um cotonete, garantindo que a porta hepática esteja voltada para cima. Remova completamente qualquer sangue armazenado no lúmen da VCI com fluido de preservação de órgãos.
3. Passe o PV pelo manguito usando um fio preso, por exemplo, à veia esplênica (ver Figura 4A).
4. Com a alça do manguito na posição de 12 horas, prenda a alça e o manguito com um bulldog clamp (consulte a Tabela de Materiais), posicionando-o a 2 a 3 mm da borda PV.
5. Prenda ainda mais a pinça bulldog usando uma pinça vascular grande e um molde de fixação para estabelecer o campo operatório (ver Figura 4B).
6. Inspecione cuidadosamente o lúmen PV com ampliação de aproximadamente 15 a 20x. Se necessário, o gotejamento de água pode aumentar a visibilidade do lúmen.
7. Segure suavemente o lúmen PV e exteriorize-o através do manguito.
8. Uma vez totalmente exteriorizado, prenda-o com uma ligação dupla usando 8-0 fio de seda ao longo da ranhura do manguito (Figura 4C,D).
   NOTA: Certifique-se de que a ligadura não esteja solta. Além disso, tome cuidado para que o ponto de ligadura não seja muito grande, pois pode interferir na inserção do manguito. O ponto de ligadura pode ser posicionado em qualquer direção.
9. Fixe o manguito ao IHIVC usando um procedimento semelhante ao usado para o VP (Figura 4E).
   NOTA: Ao pinçar o IHIVC com o manguito, evite morder o parênquima hepático. Como o pescoço é mais curto que o PV, determine cuidadosamente a posição de fixação.
10. Crie um nó corrediço passando a linha ao redor da base do IHIVC para ligar temporariamente o IHIVC (Figura 5). Este fio será removido após a reperfusão.

4. Reconstrução da veia porta

1. Anestesiar o camundongo receptor induzindo anestesia com isoflurano a 2,5% e reduzi-lo para 0,6% antes de extrair o fígado nativo, conforme descrito na literatura publicada². Dinsinfectar a área cirúrgica pelo menos três vezes com rodadas alternadas de iodóforo e etanol a 70% antes da laparotomia.
2. Certifique-se de que o lobo hepático esteja posicionado corretamente e que o PV balonetado esteja livre de dobras e torções.
3. Segure suavemente a borda PV do receptor usando uma pinça Pean e prenda-a com um torno.
   NOTA: Neste artigo, um torno refere-se a um aparelho mecânico usado para prender a pinça de Pean na mesa. Para obter mais informações sobre o torno, consulte Tabela de materiais.
4. Aplique uma pinça vascular no PV do receptor e passe um 8-0 fio de seda em torno dele.
5. Crie uma seção circunferencial de 1/4 a aproximadamente 0,5 mm da borda PV (Figura 6A). Amplie o orifício enquanto passa a solução salina pelo lúmen usando um instrumento especializado (uma agulha de 27 G com a ponta cortada e dobrada em forma de L).
6. Use uma pinça reta para segurar a alça do manguito e insira-a no lúmen.
7. Uma vez totalmente inserido, prenda o manguito com um 8-0 fio de seda. Uma única ligadura é suficiente para a fixação.
8. Remova o grampo vascular e reperfunda o fígado.
9. Solte cuidadosamente a pinça de Pean e conclua a reconstrução da veia porta. Todo o processo de reconstrução do PV deve levar aproximadamente 5 min.

5. Reconstrução da veia cava inferior infra-hepática

1. Posicione o lobo do fígado adequadamente e mova a pinça de Pean presa ao receptor IHIVC dorsal para o lobo inferior direito do enxerto, prendendo-o com um torno.
2. Elimine qualquer tecido hepático remanescente ao redor do IVIHC do receptor esfregando suavemente com um cotonete.
3. Passe um 8-0 fio de seda ao redor do IVIHC do destinatário.
4. Crie uma seção circunferencial de 1/4 a aproximadamente 0.5 mm da borda IVIHC do receptor (Figura 6B).
5. Depois de introduzir solução salina normal no lúmen, insira o manguito no lúmen.
   NOTA: Devido ao pescoço curto, o manguito é frequentemente inserido de forma mais superficial do que no PV.
6. Prenda cuidadosamente o manguito com um 8-0 fio de seda e, em seguida, remova a braçadeira vascular e a pinça Pean.

6. Cuidados pós-operatórios

1. Utilize uma almofada de aquecimento e uma lâmpada de aquecimento para facilitar a recuperação pós-operatória.
2. Monitore continuamente a pressão arterial, frequência cardíaca, frequência respiratória, temperatura corporal, bem como o consumo de alimentos e água.
3. Administre injeção subcutânea de carprofeno (5 mg / kg, a cada 6 h ou até que seja necessário) para aliviar a dor pós-operatória. Siga as diretrizes institucionais locais.
   NOTA: Se a condição dos camundongos se deteriorar, o experimento será interrompido imediatamente e os camundongos serão sacrificados por inalação de dióxido de carbono.
4. Para coletar a amostra de tecido, reanestesiar os camundongos e sacrificá-los por um método aprovado pela IACUC.

Resultados

A reconstrução da VP é bem-sucedida quando, ao despinçar a veia porta, não há tortuosidade e o fígado é perfundido uniformemente. O tempo anepático deve ser inferior a 20 min, pois tempos anepáticos superiores a 25 min aumentam o risco de mortalidade em camundongos. A reconstrução da IHIVC é considerada bem-sucedida se não houver regurgitação sanguínea do enxerto.

O armazenamento do enxerto em temperaturas frias por 1 h com solução de preservação de órgãos resulta em um ...

Discussão

Aprender a reconstrução vascular é o aspecto mais desafiador para alcançar o MOLT bem-sucedido. A qualidade do manguito influencia significativamente na dificuldade de reconstrução, dado o pequeno tamanho dos camundongos⁵. Este artigo fornece um protocolo detalhado para preparação, fixação e reconstrução do manguito.

Embora não haja grandes diferenças em relação aos relatos anteriores em relação à preparação e conexão do man...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
16 G intravenous catheter	TERUMO	SR-FF2032	IHIVC cuff
20 G intravenous catheter	TERUMO	SR-FF1651	PV cuff
8-0 braid silk	Natsume Seisakusho	CR9-80B2	8-0 silk
Belzer UW Cold Storage Solution	Astellas		Organ preservation fluid
Bulldog clamp	B BRAUN	FB329R	Bulldog clamp
C57BL/6 mice	Oriental Bio Service
Isoflurane inhalation solution	Viatris		Anesthesic
Micro Blunted Tips 0.1 mm x 0.06 mm	F.S.T	11253-20	Straight microforceps
Micro Serrefine Clamp Applicator with Lock	F.S.T	18056-14	Vessel clip applicator
Micro Serrefines	F.S.T	18055-4	Vessel clip
No.11 Spare Blades	FEATHER Safety Razor	11	Blades
Ophthalmic scissor, round handle	B BRAUN	FD103R	Microscissor
Plastic rectangular-shaped container	Daiso		10 cm long, 15 cm wide and 6 cm high
SuperGrip Tips	F.S.T	00649-11	Curved microforceps
SZX7	Olympus	SZX7	Microscope
Vise	Niigataseiki	00505351	A mechanical tool to secure Pean forceps on the table