Avaliação de triagem de alto rendimento da geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) usando corante de fluorescência Dihidroetídio (DHE)

Resumo

Este protocolo descreve um novo método para quantificar espécies reativas de oxigênio (ROS) intracelulares usando diidroetídio (DHE) como sonda de fluorescência usando uma abordagem de triagem de alto rendimento. O protocolo descreve os métodos para avaliação quantitativa das espécies reativas de oxigênio (EROs) intracelulares nas três diferentes linhagens celulares de carcinoma hepatocelular.

Resumo

As espécies reativas de oxigênio (EROs) desempenham um papel fundamental na regulação do metabolismo celular em processos fisiológicos e patológicos. A produção fisiológica de ERO desempenha um papel central na modulação espacial e temporal de funções celulares normais, como proliferação, sinalização, apoptose e senescência. Em contraste, a superprodução crônica de ERO é responsável por um amplo espectro de doenças, como câncer, doenças cardiovasculares e diabetes, entre outras. Quantificar os níveis de ROS de forma precisa e reprodutível é, portanto, essencial para entender a funcionalidade celular normal. Métodos baseados em imagens de fluorescência para caracterizar espécies intracelulares de ROS é uma abordagem comum. Muitos dos protocolos de imagem ROS na literatura utilizam o corante diacetato de 2'-7'-diclorodihidrofluoresceína (DCFH-DA). No entanto, este corante sofre de limitações significativas em seu uso e interpretabilidade. O protocolo atual demonstra o uso de uma sonda fluorescente de diidroetídio (DHE) como um método alternativo para quantificar a produção total de ROS em um ambiente de alto rendimento. A plataforma de geração de imagens de alto rendimento, CX7 Cellomics, foi usada para medir e quantificar a produção de ROS. Este estudo foi realizado em três linhagens de células de câncer hepatocelular - HepG2, JHH4 e HUH-7. Este protocolo fornece uma descrição detalhada dos vários procedimentos envolvidos na avaliação de ROS dentro das células, incluindo - preparação de solução de DHE, incubação de células com solução de DHE e medição da intensidade de DHE necessária para caracterizar a produção de ROS. Este protocolo demonstra que o corante fluorescente DHE é uma escolha robusta e reprodutível para caracterizar a produção intracelular de ROS de forma de alto rendimento. Abordagens de alto rendimento para medir a produção de ROS provavelmente serão úteis em uma variedade de estudos, como toxicologia, rastreamento de drogas e biologia do câncer.

Introdução

Espécies reativas de oxigênio (ROS) são um grupo de radicais químicos de ocorrência natural, altamente reativos e temporalmente instáveis formados como parte do metabolismo celular normal nas células. As ERO desempenham um papel fundamental e essencial na modulação dos processos fisiológicos e bioquímicos normais que ocorrem nas células ^1,2. A principal fonte de produção de ERO nas células é a via da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial (ETC) como parte do ciclo bioenergético normal. Fontes adicionais significativas de produção de ROS incluem reações enzimáticas como NADPH oxidases celulares em células. O metabolismo das moléculas alimentares (por exemplo, glicose) ocorre através da via de fosforilação oxidativa na matriz mitocondrial. Um nível basal de produção de ERO é essencial para regular os processos normais de sinalização celular fisiológica. Muitas moléculas de proteínas-chave que fazem parte das vias de sinalização metabólica da glicose (por exemplo, Akt e PTEN) são conhecidas por responder aos níveis intracelulares de ROS. Além disso, as ERO são produzidas por várias enzimas intracelulares, como xantina oxidase, óxido nítrico sintase e constituintes peroxissomais, como parte das vias enzimáticas celulares ^1,2. Em contraste com as fontes naturais de EROs, certos fatores ambientais, como xenobióticos, agentes infecciosos, luz UV, poluição, tabagismo e radiação, também levam à produção excessiva de EROs, que são um dos principais impulsionadores do estresse oxidativo intracelular ^1,3. O estresse oxidativo celular elevado pode causar danos às biomoléculas nativas no interior de uma célula, como lipídios, proteínas e DNA, causando várias doenças como câncer, diabetes, doenças cardiovasculares, inflamação crônica e doenças neurodegenerativas ^1,3,4. Portanto, medidas precisas de ERO são essenciais para entender os mecanismos celulares envolvidos na fisiopatologia da doença induzida pelo estresse oxidativo.

Devido às curtas escalas de tempo de produção e eliminação de ROS dentro das células, medidas quantitativas de vários radicais ROS permanecem um desafio. Métodos como ressonância paramagnética eletrônica (RPE)⁵, cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) e imagens baseadas em sonda de fluorescência são usados para medir as várias ROS celulares⁶. Enquanto métodos como EPR e HPLC produzem estimativas quantitativamente precisas, esses métodos envolvem a destruição da morfologia espacial celular e geralmente estão na forma de medidas globais e em massa de uma amostra. Em contraste, métodos baseados em imagem, como métodos baseados em sonda de fluorescência, mantêm a morfologia celular e o contexto espacial da geração de EROs. No entanto, a especificidade de várias sondas de fluorescência para diferentes tipos de radicais ROS não está bem estabelecida ^7,8. Várias sondas fluorescentes como diidroetídio (DHE), diacetato de diclorodihidrofluoresceína (DCFH-DA), diidrorodamina (DHR), dimetilantraceno (DMA), 2,7 diclorodihidrofluresceína (DCFH), 1,3-Difenilisobenzofurano (DPBF) e MitoSox estão disponíveis para detecção de ROS comercialmente. Nas últimas décadas, DHE, MitoSox e DCFH-DA são os corantes fluorescentes comumente utilizados para medir ERO em células e tecidos ^8,9. DCFH-DA é um corante amplamente utilizado para detectar H₂O₂ intracelular e estresse oxidativo. Apesar da popularidade da DCFH-DA, vários estudos prévios mostraram que ela não pode ser usada de forma confiável para medir os níveis intracelulares de H₂O₂ e outras ROS 8,9,10,11,12,13,14.

Em contraste, a sonda fluorescente diidroetídio (DHE) apresenta uma resposta específica ao radical superóxido intracelular (O₂^-). Embora o radical superóxido seja uma das muitas espécies de ROS observadas nas células, é um importante radical envolvido na redução de metais de transição, conversão em peroxinitrato e formação de hidroperóxidos, entre outros efeitos intracelulares. O DHE é rapidamente absorvido pelas células e tem uma emissão de fluorescência na faixa de comprimento de onda vermelha¹⁵. Após a reação com o radical superóxido especificamente, o DHE forma um produto fluorescente vermelho, 2-hidroxietídio (2-OH-E⁺). Assim, o DHE pode ser considerado como uma sonda específica para detecção de superóxido. No entanto, DHE também pode sofrer oxidação inespecífica com ^{ONOO- ou OH.}, H₂O_2, e citocromo c para formar um segundo produto de fluorescência, etídio E^+, que pode interferir com os níveis medidos de 2-OH-E⁺. No entanto, esses produtos 2-OH E⁺ e E⁺, em combinação, representam a maior parte do total de espécies celulares de ROS observadas dentro de uma célula quando coradas com DHE. O E⁺ intercala no DNA, aumentando sobremaneira sua fluorescência ^{8,9,10,11,13,14,15,16}. Uma vez que os espectros de fluorescência do etídio e do 2-hidroxietídio diferem apenas ligeiramente, a maioria dos níveis de ROS observados em uma célula secundária à produção de superóxido pode ser detectada e medida usando produtos de fluorescência DHE. Essas espécies de ROS são identificadas usando excitação de comprimento de onda de 480 nm e emissão de comprimento de onda de 610 nm 15,16,17.

Além de escolher uma sonda de detecção de ROS fluorescente específica, é importante escolher um método sensível de detecção para medir ROS intracelular. A avaliação precisa dos níveis intracelulares de ROS é, portanto, fundamental para identificar estados de equilíbrio redox perturbados que ocorrem em células doentes ou que foram expostas a vários estressores ambientais, como radiação, compostos toxicológicos e agentes genotóxicos¹⁸. Uma vez que as ROS são um fenômeno comum em células que é responsável por regular uma variedade de atividades de sinalização celular, métodos robustos de detecção de ROS são essenciais. Para permitir essa avaliação de alto rendimento da produção de ROS dentro das células, este protocolo usa uma plataforma de triagem de alto conteúdo (HCS) para medir as espécies de ROS. O protocolo atual permite a análise em alto rendimento da produção intracelular de EROs, o que é de fundamental importância em muitos estudos toxicológicos¹⁹. Este protocolo visa fornecer uma solução fácil e versátil para detectar e medir ERO intracelular em células de carcinoma hepatocelular aderente. Os reagentes químicos de H₂O₂ e menadione são usados como potentes estimuladores de ROS para medir os níveis relativos de produção de ROS em um ambiente controlado e de alto rendimento. Este protocolo pode ser ajustado para medir a produção de ERO em células aderentes e não aderentes em condições apropriadas, conforme necessário.

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Protocolo

1. Cultura celular

1. Semeando as células teste (células de carcinoma hepatocelular HepG2, HUH7 e JHH4) em uma placa de 96 poços a uma densidade de semeadura de 10.000 células/poço em um volume final de semeadura de 200 μL por poço.
   1. Antes de cultivar as células HepG2, revestir os 96 poços de placa com colágeno tipo IV (50 μg/mL) por 2 h de duração à temperatura ambiente (TR). Para evitar a solidificação do colágeno estoque, coloque a solução estoque em gelo e, posteriormente, inicie o processo de diluição até a concentração desejada.
   2. Após um período de incubação de 2 h, aspirar o excesso de colágeno e lavar os poços três vezes com o PBS 1x.
2. Cultivar as células em meio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco durante a noite a 37 °C e concentração de 5% de CO₂ em uma incubadora umedecida.
3. No dia seguinte, ou ao atingir a confluência de 80%-90%, o que ocorrer primeiro, tratar as células com H₂O₂ (não tratada, 250 μM, 500 μM, 750 μM e 1000 μM) e Menadione (não tratada, 25 μM, 50 μM, 75 μM, 100 μM), respectivamente, por 30 min para induzir o estresse oxidativo representativo.
4. Alternativamente, opte por testar as células com a substância de teste desejada de escolha capaz de induzir estresse oxidativo dentro das células.

2. Preparação de solução estocada e diluída para coloração de DHE de células

1. Preparar a solução-mãe de DHE (5 mg/mL ou 15,9 mM) dissolvendo 5 mg de DHE em 1 mL de DMSO.
2. Diluir a solução-mãe de DHE com água autoclavada bidestilada até uma concentração final de 100 μM.
3. Para evitar o processo de congelamento e descongelamento do corante (que pode danificar as propriedades de fluorescência ao longo do tempo), prepare várias alíquotas em tubos de centrífuga de 1,5 mL com concentração de 100 μM e armazene-os a -20 °C.
4. Para obter uma concentração final de trabalho de 10 μM, use uma alíquota da concentração de DHE de 100 μM e dilua-a com meio DMEM pré-aquecido.
   NOTA: A solução de trabalho deve ser preparada fresca no dia da experiência.
5. Vórtice a solução de corante de fluorescência de trabalho por 5-10 s para garantir a mistura adequada do corante.

3. Processo de coloração de DHE

1. Remova o meio contendo droga ou substância de teste de cada poço e lave-o suavemente uma vez com 1x PBS ou DMEM.
   NOTA: Ao realizar as etapas de adição ou lavagem no experimento, é crucial evitar o contato direto entre as células e o pipetador. Isso pode ser conseguido pipetando suavemente o PBS ao longo das laterais dos poços para minimizar qualquer dano mecânico potencial às células. Garantir que o pipetador não toque diretamente nas células ajudará a manter a integridade e a viabilidade da célula durante o experimento.
2. Adicionar 100 μL de meio DMEM contendo 10 μM de DHE (solução de trabalho) em cada poço e incubar a 37 °C durante 30 min.
3. Após 30 min de período de incubação, remova o meio contendo DHE e lave cada um bem suavemente três vezes com o 1x phosphate-buffered saline (PBS). Isso pode ser realizado com um pipetador multicanal para garantir um rápido retorno.
4. Adicionar 200 μL de 1x PBS a cada poço com corante nuclear Hoechst 33342 por 10 min em RT.
5. Remova a solução de coloração nuclear Hoechst 33342 do poço e adicione 200 μL de 1x PBS a cada poço.
   NOTA: Para obter células fixas, siga o mesmo protocolo das células vivas, com uma etapa adicional de adição de PFA a 4% por 5 min após o tratamento e coloração de DHE. Retire a solução de PFA e lave as células com o PBS 1x. Em seguida, incubar as células com o corante corante nuclear por 10 min.
6. Mova a placa para a plataforma de triagem de alto conteúdo, microscopia de fluorescência ou leitor de placas para aquisição de imagens o mais rápido possível.

4. Aquisição de imagens e mensuração da intensidade

1. Carregamento de placas
   1. Abra o software Cellomics CX7 de triagem de alto conteúdo (HCS) para aquisição de dados.
   2. Calibre cuidadosamente a plataforma de imagem de acordo com as especificações do fabricante com antecedência com a placa específica de 96 poços de escolha para uso para evitar imagens nebulosas ou borradas nos dados.
      NOTA: Placas multipoços de vários fornecedores podem ter propriedades diferentes do material e podem influenciar a qualidade das imagens finais obtidas.
   3. Uma vez calibrados, salve os parâmetros do sistema específicos da marca da placa no banco de dados de instrumentos e reutilize-os para futuras aquisições de dados.
   4. Coloque cuidadosamente a placa com as amostras preparadas no estágio aquecido do sistema de imagem HCS. Certifique-se de que a placa esteja bem posicionada e na orientação correta para geração de imagens no suporte da microplaca (ou seja, localize a etiqueta marcada como A1 no estágio do leitor e, em seguida, gire a microplaca para que a localização do poço A1 corresponda ao canto com o adesivo).
   5. Pressione suavemente a microplaca para garantir que ela fique encostada no palco. O nivelamento irregular da placa no sistema HCS pode levar a erros na aquisição das imagens.
   6. Depois que a placa estiver no lugar, pressione e mantenha pressionada a tecla Ctrl e clique em Ctrl-OK na caixa de diálogo Carregar/descarregar placa no software.
2. Selecionando parâmetros de imagem
   1. No sistema de imagem HCS, abra o modo de Ativação de Alvo na interface de bioaplicações do Cellomics e crie um novo protocolo usando o protocolo de configuração de dois canais compatível com (a) coloração nuclear e (b) aquisição de dados de sonda de fluorescência DHE. No protocolo atual, os filtros 386_BGSRS_BGSRS, 480_BGS_RS e 386_BGS_RS foram usados para (a) coloração nuclear Hoechst 33342, (b) produção total de ROS e (c) detecção de radicais superóxido, respectivamente. A escolha desses filtros foi orientada pela sobreposição específica para as propriedades de emissão de cada corante (DAPI e DHE) utilizado como parte deste protocolo.
      NOTA: A convenção de nomenclatura de filtros, por exemplo, 386-23_BGRFRN_BGRFRN, refere-se à excitação da amostra com luz de 386 nm com largura de banda de 23 nm, seguida por um filtro dicroico que passa luz azul (B), verde (G), vermelha (R), vermelha (FR) e infravermelha próxima (N) em faixas de comprimento de onda específicas e a 386_BGS_RS refere-se a um filtro de emissão que passa luz de comprimento de onda de emissão BGS e RS após o dicroico.
   2. Especifique os objetivos para o processo de aquisição de imagens dentro da interface do protocolo de software, como ampliação de 10x ou 20x, conforme necessário.
   3. Escolha a ampliação objetiva apropriada dependendo do nível desejado de detalhes de imagem e das resoluções necessárias para o experimento. No entanto, a resolução de cada objetivo é fixa. Detalhes de resolução mais altos exigirão a mudança do objetivo na plataforma. No protocolo atual, utiliza-se uma objetiva de 20x, 0,45 NA, que faz parte da plataforma de triagem de alto conteúdo utilizada nesse protocolo.
      NOTA: A objetiva de 20x representa uma boa compensação entre os detalhes da resolução da imagem e a velocidade de aquisição necessária para capturar as alterações de ROS ao longo do tempo. Objetivos de ampliação mais altos podem ser escolhidos (por exemplo, 40X), no entanto, isso levará a um aumento do tempo de aquisição.
   4. Especifique as configurações de exposição da câmera de aquisição de imagem, como o tempo de exposição, o binning da câmera e o intervalo z-stack, de acordo com os requisitos específicos do protocolo.
      NOTA: O tempo de exposição (geralmente em milissegundos) varia com base na intensidade do sinal e na sensibilidade dos fluoróforos específicos usados. Isso também pode diferir ligeiramente de experimento para experimento com base na concentração do corante e na qualidade da coloração. No protocolo atual, os parâmetros de aquisição são fixados da seguinte forma - Target % - 35%, modo de aquisição de imagens - 1104 x 1104 (com binning 2x2) e objetivo 20x, 0,45 NA. Estes parâmetros podem ser definidos de acordo com as condições experimentais específicas.
3. Parâmetros de configuração de imagem
   NOTA: Uma vez que os parâmetros de imagem são definidos, o processo de coleta de imagens pode ser iniciado usando a interface do software.
   1. Parâmetros da coleção de imagens
      1. Identificar o objeto de rastreamento primário de interesse (o núcleo das células) usando diferentes algoritmos disponíveis no instrumento (óptica - isodados, fixo e triângulo).
         Observação : O método isodata para a identificação e marcação do objeto primário é usado neste protocolo.
      2. Segmente o objeto (se houver) por forma ou parâmetro de intensidade.
      3. Valide o objeto primário com base nos parâmetros de tamanho, forma e intensidade desejados exclusivos para cada tipo de célula.
      4. Em seguida, defina a "região de interesse" (ROI) em torno desse objeto primário.
         NOTA: O ROI é um parâmetro-chave de aquisição de dados que define o local onde a intensidade do corante de fluorescência é identificada para ser consistente e repetível entre os tipos de células. A ROI define os parâmetros-chave (como a intensidade do corante), que são medidos para cada objeto de rastreamento primário (ou seja, uma célula) em diferentes canais do instrumento. A ROI pode ser definida na forma de um círculo ou anel ao redor do núcleo de cada célula. O software HCS obtém automaticamente a intensidade do marcador corante de fluorescência DHE no canal 2 dentro do limite da ROI para cada célula que é segmentada e analisada de forma automatizada.
      5. Defina um círculo de 20 μm em torno do objeto primário (núcleo). A distância de 20 μm foi escolhida neste estudo com base nos tamanhos aproximados das várias linhagens celulares utilizadas neste protocolo (HepG2, JHH-4 e HUH-7). A ROI do anel de 20 μm ao redor das células obteve a intensidade da fluorescência de forma consistente e repetível.
         NOTA O parâmetro-chave na escolha de um ROI é a capacidade de cobrir adequadamente a área da célula; o tamanho da ROI circular depende do tamanho da célula. Células maiores podem exigir um ROI maior e vice-versa para um ROI menor. Esses parâmetros devem ser determinados antecipadamente para cada tipo celular e corante de fluorescência de interesse.
4. Caracterização da população e características selecionadas para armazenar
   1. Uma vez que os vários parâmetros de aquisição são definidos no protocolo de imagem HCS, coloque o sistema HCS no modo de aquisição de dados.
   2. Os parâmetros de aquisição de imagens para este protocolo foram definidos da seguinte forma: limite de varredura de 1000 células/poço, com exigência mínima de 10 objetos (células) por campo.
      NOTA: O número de campos avaliados para cada poço foi determinado com base na contagem final de células atingindo o número 1000. O sistema HCS continua pesquisando vários locais dentro do poço até obter a população-alvo de 1000 células/poço. A velocidade de aquisição depende, portanto, da confluência e do número total de células presentes em cada poço da placa de 96 poços. No protocolo atual, a intensidade total e média do canal 2 (representando os radicais superóxido e a produção total de EROs) foram coletadas de cada poço para análises posteriores a jusante.
5. Captura, processamento e análise de imagens
   1. Após ajustar e finalizar os parâmetros de aquisição da imagem, inicie o processo de digitalização para cada placa de 96 poços.
      NOTA: O sistema de geração de imagens Cellomics CX7 permite a triagem de alto conteúdo e a análise automatizada de amostras de uma variedade de parâmetros, incluindo a produção de ROS dentro das células de maneira de alto rendimento. Além da produção de ROS, o sistema HCS é capaz de fornecer informações adicionais valiosas sobre vários parâmetros, como morfologia celular, localização subcelular e muitas outras características celulares de interesse. Uma vez otimizada para aquisição, a plataforma de imagem HCS permite a caracterização abrangente, qualitativa e quantitativa dos parâmetros celulares de forma robusta.
   2. Após a conclusão do processo de digitalização, inicie o software View Analysis e exporte os vários parâmetros de dados quantitativos em um formato .csv para análise adicional.
   3. Usando software de terceiros, copie e cole os vários valores quantitativos de interesse para análises adicionais a jusante.
      NOTA: No protocolo atual, o software GraphPad Prism foi utilizado para analisar os valores de intensidade de DHE em resposta ao estresse oxidativo induzido devido a exposições a H₂O₂ e menadiona.
6. Dados e análise estatística
   1. Calcular a intensidade média média do canal 2 (representando os valores totais de ROS e radicais superóxido).
      OBS: Todos os experimentos para cálculo dos valores de intensidade foram repetidos três vezes com 6 repetições por condição em cada nível de dosagem.
   2. Realizar ANOVA unidirecional ou teste t para medir as diferenças nos valores de intensidade entre várias condições de teste.

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Resultados

Diidroetídio (DHE) é um corante de fluorescência responsivo a superóxidos que fornece informações específicas sobre os estados de ROS intracelulares. O corante DHE emite intrinsecamente fluorescência azul no citoplasma. Entretanto, ao interagir com radicais superóxido, é transformado em 2-hidroxietídio, que emite fluorescência nos comprimentos de onda vermelho (>550 nm) (Figura 1). O corante DHE é facilmente transportado para as células e o núcleo. A fluorescência emitida pod...

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Discussão

Neste estudo, um protocolo para avaliar a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) intracelulares impulsionadas por superóxido usando corante de fluorescência diidroetídio (DHE) foi estabelecido em um sistema de triagem de alto conteúdo. A maioria dos protocolos atuais disponíveis na literatura utiliza a DCFH-DA como sonda de imagem de fluorescência para quantificar espécies de ROS. No entanto, vários estudos têm demonstrado que a DCFH-AD não é uma sonda ideal para a mensuração de ERO intracelula...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL centrifuge tubes	VWR	20170-038
96- well plate	Corning Costar	07-200-90
Cellomics Cx7	ThermoFisher	HCSDCX7LEDPRO
Collagen	Advanced Biomatrix	5056
DHE (Dihydroethidium)	ThermoFisher	D1168
DMEM	Sigma	6046
FBS	VWR	97068-085
GraphPad Prism	GraphPad	Version 6.0
HepG2 cell line	ATCC
Hoechst	ThermoFisher	33342
HUH7 cell line	ATCC
Hydrogen Peroxide	Sigma	88597
JHH4 cell line	ATCC
Menadione	Sigma	M5625