Perfusão Cirúrgica e Isolamento do Pâncreas Suíno para Isolamento de Ilhotas

Resumo

Este protocolo fornece um guia passo a passo para a aquisição de um pâncreas suíno para isolamento e purificação de ilhotas.

Resumo

O transplante de ilhotas pancreáticas é um tratamento emergente para diabetes tipo I; no entanto, é limitado pela correspondência e disponibilidade de doadores. O xenotransplante de ilhotas suínas oferece uma alternativa promissora ao alotransplante, com potencial para produção em larga escala de ilhotas funcionais sob demanda. O rendimento e a viabilidade das ilhotas isoladas são altamente suscetíveis à qualidade do pâncreas doador e ao método de obtenção, particularmente à duração do tempo de isquemia quente. Para melhorar a preservação do órgão e o subsequente rendimento e viabilidade das ilhotas, desenvolvemos um protocolo para perfusão cirúrgica e ressecção do pâncreas suíno. Este protocolo emprega canulação aórtica infrarrenal direta e perfusão de órgãos para minimizar o tempo de isquemia quente e simplificar o procedimento para operadores que não possuem ampla experiência cirúrgica. A perfusão arterial subsequente do pâncreas através da aorta libera o sangue estagnado da microvasculatura, reduzindo assim a trombose e o dano oxidativo ao tecido. Este manuscrito fornece um protocolo detalhado para perfusão cirúrgica e ressecção do pâncreas suíno, seguido de isolamento e purificação das ilhotas.

Introdução

O diabetes tipo 1 é causado pela destruição autoimune das células beta pancreáticas¹. Consequentemente, os pacientes são dependentes de insulina exógena, colocando-os em flutuações glicêmicas de alto risco com episódios de hiper e hipoglicemia². O alotransplante de ilhotas é uma cura potencial para o diabetes tipo I; no entanto, a disponibilidade limitada de doadores de órgãos pancreáticos continua sendo uma grande barreira para a adoção generalizada do procedimento ^2,3. O xenotransplante de ilhotas de doadores suínos é uma alter....

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo animais são aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Divisão de Medicina Comparada da Escola de Medicina da Universidade de Washington. Porcos Yorkshire adultos com variação de 35 a 35 kg são ideais para este procedimento; no entanto, o protocolo pode ser adaptado para suínos de diferentes tamanhos, dependendo do contexto experimental. Todo o procedimento deve ser realizado de forma estéril em uma configuração de sala de cirurgia.

1. Preparo pré-operatório e anestesia

1. Sedar o porco com um coquetel de 4 mg/kg de t....

Discussão

O xenotransplante de ilhotas pancreáticas com doadores suínos é uma estratégia promissora para o tratamento do diabetes tipo I. O isolamento das ilhotas é desafiador, e a viabilidade e o rendimento final das ilhotas são altamente suscetíveis à hipotensão e isquemia tecidual encontradas durante a aquisição de órgãos^16,17. Para otimizar a captação e preservação do pâncreas, este protocolo apresenta um novo método.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M NaOH, 100 mL	Millipore Sigma	1310-73-2
10x HBSS, 500 mL (15 to 30 °C)	Thermo Fisher	14065056
1x D-PBS, 500 mL	Thermo Fisher	14200075
1x HBSS, 1 L	Thermo Fisher	14025076
250 mL Conical Tubes	Millipore Sigma	CLS430236-6EA
Amphotericin B [50 mg]	Millipore Sigma	PHR1662
Antiseptic Povidone Iodine 10%	Millipore Sigma	25655-41-8
BioRad Gradient Former	BioRad	395
Calcium Chloride dihydrate	Thermo Fisher	10035-04-8
COBE Cell Processor	Ebay	317690
Digestion circuit reservoir, Gibco bottle, 1 L	Thermo Fisher	10341001
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Thermo Fisher	85190
Dithizone	Thermo Fisher	60-10-6
Gradient Former Connection Kit	BioRad	1652008
Heparin [1000 U/mL]	Emergency Medical Products	0409-2720-01
HEPES Buffer (1 M), 100 mL	Thermo Fisher	15630080
Human Serum Albumin 25%, 100 mL	Celprogen	HSA2001-25-1
Isoflurane	Covetrus	Item#:11695067772
Ketamine	Patterson	Item #:07-894-8462
Liberase (100 mg)	Millipore Sigma	5401020001
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit	Thermo Fisher	L3224
Lympholyte 1.1 Media 500 mL	Cedarlane Labs	CL5020
Masterflex LS 16 Tubing	Masterfle	96419-16
Masterflex Peristaltic Pump	Masterflex	07522-30
PenStrep (2 mg/mL)	Celprogen	PS-30-002
Pulmozyme (1 mg/mL, 2.5 mL/vial)	Dornase Alfa	8931278
Recovery Medium, PIM(R)	Prodo Laboratories, Inc.	PIM-R001GMP
RPMI 1640	Millipore Sigma	R8758-1L
Standard Culture Medium, PIM(S)	Prodo Laboratories, Inc.	PIM-S001GMP
Tzed™ (tiletamine and zolazepam) Injection C	Patterson	Item #:07-894-6240
University of Wisconsin (UW) Solution, 3 L	Global Transplant Solutions	1000-0046-06
Waterbath	Sigma Alderich	CLS6783-1EA
Xylazine	Patterson	Item #:07-891-6165