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Resumo

Os ritmos circadianos, que existem na maioria dos organismos, regulam a organização temporal dos processos biológicos. Os organoides 3D surgiram recentemente como um modelo in vitro fisiologicamente relevante. Este protocolo descreve o uso de repórteres bioluminescentes para observar ritmos circadianos em organoides, possibilitando investigações in vitro de ritmos circadianos em sistemas multicelulares.

Resumo

A maioria dos organismos vivos possui ritmos circadianos, que são processos biológicos que ocorrem em um período de aproximadamente 24 horas e regulam um repertório diversificado de processos celulares e fisiológicos que vão desde os ciclos sono-vigília até o metabolismo. Esse mecanismo de relógio arrasta o organismo com base nas mudanças ambientais e coordena a regulação temporal de eventos moleculares e fisiológicos. Anteriormente, foi demonstrado que os ritmos circadianos autônomos são mantidos mesmo no nível de uma única célula usando linhagens celulares como os fibroblastos NIH3T3, que foram fundamentais para descobrir os mecanismos dos ritmos circadianos. No entanto, essas linhagens celulares são culturas homogêneas sem multicelularidade e comunicações intercelulares robustas. Na última década, um extenso trabalho foi realizado no desenvolvimento, caracterização e aplicação de organoides 3D, que são sistemas multicelulares in vitro que se assemelham a estruturas e funções morfológicas in vivo . Este trabalho descreve um protocolo para detecção de ritmos circadianos usando um repórter bioluminescente em enteróides intestinais humanos, o que permite a investigação de ritmos circadianos em sistemas multicelulares in vitro.

Introdução

Relógio circadiano
Todos os organismos, de bactérias a mamíferos, têm uma relação complexa e dinâmica com seu ambiente. Dentro dessa relação, a adaptação às mudanças ambientais é fundamental para a sobrevivência dos organismos. A maioria dos organismos possui ritmos circadianos que lhes permitem adaptar e otimizar suas funções a ciclos diurnos de aproximadamente 24 h. O relógio circadiano é uma rede hierárquica de relógios centrais e periféricos que trabalham em cooperação para manter a homeostase fisiológica e manter os organismos sincronizados com as mudanças diárias 1,2. Nos mamíferos, o relógio central ou mestre localizado no núcleo supraquiasmático (SCN) recebe pistas externas, como a luz, e transmite as informações aos relógios periféricos por meio de uma interação avançada de vias de sinalização neural e humoral3. Além do relógio central, os tecidos periféricos possuem seu próprio mecanismo de relógio circadiano autônomo celular, mantido por um loop de feedback negativo transcricional-translacional (TTFL) que regula os genes controlados pelo relógio específico do tecido (CCGs)4,5. Essa maquinaria molecular produz ritmicidade de aproximadamente 24 h em eventos celulares e fisiológicos, como expressões gênicas, vias de sinalização, respostas imunes e digestão. O relógio circadiano está presente em quase todas as células de mamíferos, e foi demonstrado que até 50% dos padrões de expressão dos genes exibem ritmicidade circadiana6. Considerando a abundância de CCGs, a interrupção desse mecanismo de relógio pode resultar em problemas fisiológicos críticos. Portanto, investigações sobre ritmos circadianos são necessárias para elucidar mecanismos biológicos essenciais e desenvolver novas estratégias terapêuticas.

Sistema repórter de luciferase
Em estudos circadianos, o monitoramento em tempo real é fundamental para uma melhor compreensão dos comportamentos e respostas celulares, pois permite rastrear mudanças temporais na expressão gênica e/ou níveis de proteína, fornecendo informações sobre os mecanismos moleculares regulados pelo relógio circadiano. Além disso, o monitoramento em tempo real permite que os pesquisadores estudem os efeitos das mudanças ambientais nos mecanismos moleculares 7,8. Existem inúmeras técnicas para estudos de monitoramento em tempo real, incluindo o ensaio de bioluminescência, que é amplamente utilizado para rastrear a expressão gênica ou os níveis de proteína ao longo do tempo. O ensaio de bioluminescência é um método para detectar processos biológicos usando a produção de luz como leitura. Neste ensaio, uma enzima oxidativa que produz bioluminescência (por exemplo, luciferase) é transfectada de forma transitória ou estável em células de interesse, e a leitura da bioluminescência é medida na presença de um substrato (por exemplo, luciferina) ao longo do tempo. Por exemplo, a enzima luciferase produz bioluminescência oxidando o substrato luciferina na presença de ATP9. Devido à sua meia-vida curta, 3-4 h10, a luciferase de vaga-lumes é uma ferramenta poderosa para estudos circadianos em termos de fornecer monitoramento dinâmico em tempo real com ruído de fundo mínimo 11,12,13. Para a inserção de DNA com um promotor marcado com luciferase ou quadro de leitura aberto (ORF), o sistema de entrega de genes lentivirais é um método confiável que fornece alta eficácia de transdução, integração estável e baixa imunogenicidade. A transdução estável de um repórter bioluminescente fornece expressão robusta em células em divisão e não em divisão, gerando dados consistentes para estudos circadianos14.

Organoide como modelo
As linhagens celulares bidimensionais imortalizadas tradicionais têm sido fundamentais em estudos biológicos que vão desde a descoberta de mecanismos moleculares fundamentais dos ritmos circadianos até a triagem de drogas. Apesar da conveniência de utilizar linhagens celulares homogeneizadas, elas carecem de estruturas multicelulares e interações intercelulares. Em contraste, os organoides são estruturas multicelulares "semelhantes a órgãos" 3D in vitro que imitam a estrutura do órgão em um prato, exibindo semelhança com a arquitetura e multicelularidade do tecido in vivo, incluindo células-tronco, progenitoras e tipos de células diferenciadas15,16. Possuir características de auto-organização, multicelularidade e funcionalidade torna os organoides um modelo in vitro notável que representa os processos celulares e fisiológicos que ocorrem em tecidos reais17. Diferentes tipos de organoides podem ser derivados de células-tronco pluripotentes por meio de diferenciação direcionada ou células-tronco adultas colhidas de vários órgãos, incluindo intestino delgado, cérebro, fígado, pulmão e rim18,19. Uma vez que as estruturas organoides possuem uma arquitetura e função semelhantes a tecidos reais com multicelularidade e interação dinâmica célula a célula, elas são superiores às linhagens celulares homogeneizadas para entender os eventos celulares que ocorrem em tecidos in vivo. Os organoides também são facilmente manipulados e podem ser cultivados sob condições controladas, tornando-os úteis para estudos circadianos20.

O principal objetivo deste trabalho é introduzir um método de monitoramento em tempo real utilizando um ensaio de bioluminescência especificamente adaptado para estudar ritmos circadianos em organoides 3D multicelulares. O monitoramento em tempo real de eventos celulares usando uma técnica de ensaio de bioluminescência tem sido amplamente realizado para culturas de células sem a complexidade multicelular e as comunicações intercelulares que existem em tecidos reais. Os organoides 3D apresentam oportunidades únicas para investigar as funções dos ritmos circadianos em sistemas multicelulares in vitro. Por exemplo, pode-se investigar ritmos circadianos nos organoides com composições celulares alteradas ou organoides derivados de tecidos doentes dos pacientes. Este protocolo permite a utilização de um ensaio de bioluminescência para investigar diferentes aspectos dos ritmos circadianos em um modelo in vitro mais fisiologicamente relevante, os organoides, o que nos ajudará a entender melhor os papéis dos ritmos circadianos em órgãos periféricos.

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Protocolo

Todos os experimentos usando tecidos humanos para a geração de HIEs foram aprovados por um IRB no CCHMC (IRB # 2014-0427). Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais usados neste protocolo.

NOTA: Para ilustrar o procedimento descrito neste protocolo, utilizamos enteróides intestinais humanos (HIEs) Bmal1-luc . Esses enteróides sofreram transdução lentiviral estável22 com o plasmídeo repórter pABpuro-BluF, que contém o promotor Bmal1 fundido à luciferase, mostrando a atividade do promotor Bmal1 21.

1. Transdução lentiviral

  1. Realize a transdução lentiviral22 em condições enriquecidas com células-tronco para HIEs. Especificamente, garanta a formação de esferoides em HIEs dentro de 3-4 dias após a passagem no meio de crescimento intestinal, o que cria condições enriquecidas com células-tronco.
  2. Após a transdução lentiviral22, realizar a seleção de antibióticos com 2 μg/mL de puromicina, recuperar os HIEs resistentes à puromicina e passá-los com densidade relativamente alta (ou seja, 1 poço em 2 poços) por 2-3x. Se a taxa de crescimento dos HIEs for lenta, adicione 10 μM de inibidores de ROCK (Y-27632) e 10 μM de inibidor de GSK-3 (CHIR-99021) ao meio de crescimento organoide intestinal.

2. Preparação de organoides para ensaio de bioluminescência

  1. Dia 1: Passagem HIEs para pratos redondos de 35 mm.
    1. Resumidamente, para expansão de HIEs, misture os HIEs com matriz de cultura 3D reduzida por fator de crescimento (TFG) e semeie-os em placas de 24 poços com três gotículas de 10 μL de matriz de cultura 3D por poço. Adicione 350 μL do meio de crescimento HIE e troque-o a cada dois dias.
      NOTA: A densidade de HIE na matriz de cultura 3D é crítica para o crescimento de enteróides. Aproximadamente, o número de esferóides deve exceder mais de 50 em cada gota. Se o número for baixo, a taxa de crescimento do HIE é afetada negativamente.
    2. Quando os HIEs crescerem o suficiente (aproximadamente 7 dias após a pós-passagem), colete HIEs de quatro poços em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.
    3. Lave os HIEs com o PBS frio usando uma minicentrífuga de bancada (2.000 × g) por 40 s de centrifugação rápida para remover detritos e matriz de cultura 3D excessiva por pipeta.
    4. Adicione 0,5 mL de PBS frio no pellet e aplique turbulência física seringando até 10x com uma seringa de insulina de 1 mL para dissociar os HIEs.
    5. Gire os HIEs dissociados com uma minicentrífuga de bancada como na etapa 2.1.3 e remova suavemente o sobrenadante por pipeta. Em seguida, coloque o tubo de microcentrífuga com o pellet HIE no gelo para esfriar por aproximadamente 3 min.
    6. Adicione a matriz de cultura GFR 3D ao tubo de microcentrífuga e misture-a com o pellet HIE.
      NOTA: Calcule a quantidade da matriz de cultura 3D com base no número de pratos redondos de 35 mm que serão usados para o experimento. Geralmente semeamos 30 μL de gotículas de matriz de cultura 3D por prato redondo.
    7. Semear a mistura de HIEs e a matriz de cultura 3D no centro da placa redonda de 35 mm e incubar a placa a 37 °C durante 20 min para solidificar a matriz de cultura 3D.
      NOTA: A densidade dos HIEs de semeadura deve ser determinada experimentalmente. Com base na intensidade da bioluminescência, pode-se determinar o número de HIEs durante esse processo.
    8. Adicione 2 mL de meio de crescimento organoide intestinal pré-aquecido a cada placa e incube as placas em uma incubadora de CO2 até a próxima etapa.
  2. Dia 3: Início da diferenciação
    1. Para iniciar a diferenciação dos HIEs, remova o meio de crescimento e adicione 2 mL de meio de diferenciação pré-aquecido.
      NOTA: Consulte a Tabela 1 para as receitas dos meios de diferenciação HIE23.
  3. Dia 4: Nenhum processo adicional é necessário.
  4. Dia 5: Substitua o meio dos enteróides por 2 mL de meio de diferenciação pré-aquecido.
  5. Dia 6: Sincronização do relógio e registro da bioluminescência
    1. Para sincronizar o relógio molecular dos enteróides, adicione 2 μL de dexametasona 100 μM (Dex) para fazer a concentração final de 100 nM em cada placa e, em seguida, incube as placas em uma incubadora de CO2 (37 ° C, 5% CO2) por 1 h24.
    2. Durante a reinicialização do Dex, prepare o luminômetro de incubação. Verifique o CO2 e a temperatura do luminômetro de incubação e ajuste para 5% e 37 °C, respectivamente.
      NOTA: Sugere-se limpar o interior do luminômetro de incubação com álcool 70% antes e depois de cada uso da máquina para mantê-la estéril.
    3. Após a sincronização do relógio, reabasteça os enteróides com 3 mL de meio de diferenciação pré-aquecido contendo 200 μM de D-luciferina.
      NOTA: Como a luciferina é sensível à luz, o meio contendo luciferina deve ser embrulhado com papel alumínio e pré-aquecido em banho de calor a 37 ° C antes de aplicá-lo no prato.
    4. Coloque os pratos em uma mesa de prato de 8 poços do luminômetro de incubação e cubra a mesa do prato de amostra com sua tampa. Coloque duas câmaras umidificadoras com lenço úmido ou esponja na parte superior da mesa do prato de amostra. Este é um processo único.
      NOTA: Após o início do experimento, a tampa do luminômetro de incubação deve ser mantida fechada até que o experimento seja encerrado. Certifique-se de molhar os lenços / esponjas o suficiente.
    5. Feche a tampa da máquina e inicie o programa para medir a bioluminescência para o número de dias e resolução desejados.
      1. No software, selecione as configurações de condição clicando na guia Condição e ajuste as configurações neste painel: número de pratos, tempo de medição, processamento em segundo plano e tipo de filtro.
        NOTA: Para esta demonstração, selecionamos todos os pratos de A a H; tempo de medição padrão, que é determinado pelo software com base no número de pratos; tempo de espera para processamento em segundo plano e tipo de filtro F0. Como existem três opções de filtro, três cores luminescentes podem ser medidas simultaneamente.
      2. Depois de inserir todas as configurações adequadas com base no experimento, salve as configurações clicando em OK.
      3. Para começar a executar o experimento, clique na guia Executar | Botão Iniciar (ícone de triângulo verde). Observe os dados como brutos, filtrados por ruído ou sem tendência, fazendo as seleções apropriadas na parte superior da tela do software durante a execução de experimentos. Clique nas guias Raw, Noise Filtered ou Detrended para observar os dados selecionados.
      4. Observe os sinais por até 5 dias.
        NOTA: Após 5 dias de monitoramento em um luminômetro de incubação, os enteróides podem começar a morrer devido ao esgotamento do meio. Para evitar qualquer possível interrupção circadiana durante o experimento, não realizamos alterações de mídia durante o experimento.
      5. No final do experimento, pare a execução clicando no botão Parar (ícone quadrado azul), vá para a guia Arquivo e clique em Salvar como. Salve os dados no formato Kronos; exporte os dados para uma planilha na seção Arquivo clicando na opção Arquivo e selecionando Exportar como formato Excel em Arquivo para análise posterior.

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Resultados

O registro de bioluminescência foi realizado para avaliar a ritmicidade circadiana de enteróides intestinais humanos (HIEs) sob duas condições distintas: condições enriquecidas com células-tronco usando meio de crescimento organoide intestinal (Figura 3) versus condições indutoras de diferenciação, o que foi obtido substituindo o meio de crescimento organoide intestinal por um meio de diferenciação. No dia do experimento, sincronizamos os relógios circadianos realizando um trat...

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Discussão

O ensaio de bioluminescência oferece várias vantagens para a investigação dos ritmos circadianos, o que requer coleta de dados de experimentos de longo prazo. Primeiro, permite que os pesquisadores monitorem a expressão gênica ou proteína de interesse à medida que as células se movem e proliferam. Sem fazer ajustes desnecessários ou interromper as funções das células, os eventos celulares interessados ou a expressão gênica podem ser registrados usando a leitura de bioluminescência, que fornece dados confi...

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Divulgações

Os autores declaram não ter conflitos de interesse.

Agradecimentos

Os enteróides intestinais humanos foram obtidos no laboratório do Dr. Michael Helmrath no Centro Médico do Hospital Infantil de Cincinnati (CCHMC). Este trabalho foi apoiado pelo R01 DK11005 (CIH) e pelo Financiamento Piloto do Centro de Câncer da Universidade de Cincinnati. Somos gratos pelo suporte de imagem do Núcleo de Microscopia ao Vivo da Universidade de Cincinnati (NIH S10OD030402).

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
35 x 10 Falcon tissue culture dishesFisher Scientific08-772A
A 83-01Sigma AldrichSML0788
Advanced DMEM/F12Life Technologies12634-028
B-27 Supplement (50x)Gibco17504-044
BD Micro-Fine IV Insulin SyringesFisher Scientific14-829-1BbMfrn: BD 329424
CHIR99021Cayman Chemical13122GSK-3 inhibitor
DexamethasoneSigma AldrichD4902-500MG
D-Luciferin (potassium salt)Cayman Chemical14681
Gastrin I HumanSigma AldrichG9020
GlutaMAXGibco35050061
Growth Factor reduced (GFR) MatrigelCorningCB-40230C
HEPESGibco15630080
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)Stemcell Technologies06010Consist of IntestiCult OGM Human Basal Medium, 50 mL and Organoid Supplement, 50 mL. Mix both as 1:1 ratio to use as intestinal organoid growth medium
Kronos Dio Luminometer MachineATTO CorporationAB-2550
N-2 Supplement (100x)Gibco17502-048
N-Acetyl-L-cysteineSigma AldrichA9165
pABpuro-BluF reporter plasmidAddgene46824
PBS without Calcium and MagnesiumCorning21-040-CV
Penicillin-StreptomycinGibco15140122
Recombinant murine EGFPeproTech315-09
Y-27632R&D Systems1254/10ROCK inhibitor

Referências

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