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Resumo

Este estudo examina a associação entre a expressão do gene MLH1 no sangue periférico e no câncer de cólon, utilizando uma abordagem de caso-controle para comparar os níveis de expressão em pacientes e controles saudáveis pareados.

Resumo

O homólogo MutL 1 (MLH1) é um componente do complexo heterodimérico MutLα que detecta e corrige incompatibilidades base-base e loops de inserção/exclusão causados pela incorporação incorreta de nucleotídeos. Na ausência da proteína MLH1, a frequência de incompatibilidades não reparadas aumenta, resultando em câncer de órgão. O presente estudo buscou quantificar a expressão do gene MLH1 e sua relação com a invasão tumoral (T) e a invasão linfonodal (N) em amostras de sangue de pacientes com câncer colorretal (CCR). Amostras de sangue foram obtidas de 36 pacientes com CCR. O RNA foi extraído e o cDNA foi sintetizado usando um kit. Os primers foram construídos usando a abordagem de junção exon-exon, e os genes MLH1 e β-actina foram testados 3x usando reação em cadeia da polimerase em tempo real (Real-Time PCR). O software de análise de expressão gênica foi usado para analisar os dados, e um teste t foi usado para examinar a expressão de MLH1 e sua conexão com as variáveis T e N. Neste estudo, foram incluídos 36 pacientes com câncer colorretal, sendo 15 (41,6%) mulheres e 21 (58,4%) homens, com média de idade de 57,35 ± 4,22 anos e na faixa etária de 26 a 87 anos. Os resultados mostraram que a proporção de expressão gênica de MLH1 em pacientes diminuiu em comparação com indivíduos saudáveis, e a diminuição na expressão gênica em diferentes estágios da doença foi significativa. Os resultados deste estudo mostraram que a redução da expressão do gene MLH1 tem um papel efetivo no desenvolvimento do CCR.

Introdução

O câncer de cólon (CCR) é um dos tipos mais comuns de câncer. É a quarta principal causa de morte relacionada ao câncer em todo o mundo1. O CCR é mais frequente em homens do que em mulheres, e é três a quatro vezes mais comum em países industrializados do que em países em desenvolvimento. A taxa de incidência padronizada por idade (global) por 1 x 10,5 das incidências de CCR é de 19,7 em ambos os sexos, 23,6 em homens e 16,3 em mulheres2. Estudos epidemiológicos mostraram fortes associações ambientais e de estilo de vida com o CCR. Obesidade, carne vermelha/processada, tabaco, álcool, terapia de privação androgênica e colecistectomia estão associados a riscos modestamente aumentados de CCR 2,3.

A instabilidade cromossômica, a instabilidade de microssatélites e o fenótipo metilador da ilha CpG (CIMP) desempenham um papel importante na tumorigênese do CCR4. De acordo com estudos anteriores, aproximadamente 250 mutações diferentes foram identificadas em pacientes com CCR, o que equivale a aproximadamente 55% das mutações conhecidas relacionadas aos genes de reparo de incompatibilidade de DNA (MMR). Defeitos nas proteínas de reparo de incompatibilidade podem ser causados por mutações germinativas nos genes MSH6, MLH1, PMS2 e MSH2, e a maioria dessas mutações é encontrada nos genes MLH1 e MSH2 4,5. A proteína mais importante no sistema MMR, que geralmente está envolvida no CRC, é MLH1. Estudos recentes mostraram que qualquer alteração na expressão de MLH1 pode aumentar o risco de CCR. As mutações germinativas no MLH1 são responsáveis pela Síndrome de Lynch, um tipo hereditário de CCR. Além disso, 13% a 15% dos casos de câncer de cólon difuso são causados por deficiência de MLH1 com base na hipermetilação do promotor somático 6,7,8.

O gene MLH1 está localizado no braço curto do cromossomo 3 na posição 22.2 e contém 21 éxons9. A proteína codificada pelo gene MLH1 pode cooperar com uma endonuclease envolvida no reparo de incompatibilidade, PMS2, para gerar MutLα, que faz parte do sistema MMR. MutLα está envolvido principalmente no reparo de incompatibilidades base-base e loops de deleção e adição como resultado da replicação incompleta do DNA. Além disso, a proteína codificada está envolvida na sinalização de danos ao DNA e pode ser convertida para a forma ɣMutL com a proteína MLH3, que está envolvida no reparo da incompatibilidade de DNA observada na meiose 10,11,12. Estudos mostraram que o MLH1 está envolvido em outras atividades celulares importantes, incluindo regulação de pontos de verificação do ciclo celular, apoptose, recombinação cruzada e incompatibilidade mitótica13.

O gene MLH1 desempenha um papel fundamental no sistema de reparo de incompatibilidade de DNA (MMR). Um defeito na função desse gene pode levar ao acúmulo de mutações genéticas e, consequentemente, ao desenvolvimento de câncer colorretal14. Estudos anteriores mostraram que cerca de 55% das mutações associadas aos genes MMR em pacientes com CCR estão relacionadas a mutações no gene MLH1. Além disso, a diminuição da expressão do gene MLH1 pode levar à síndrome de Lynch, que é uma forma hereditária de câncer colorretal15,16. Além disso, o defeito do gene MLH1 baseado na hipermetilação do promotor somático foi observado em 13% a 15% dos casos esporádicos de câncer colorretal17. Essas evidências científicas mostram que o gene MLH1 atua como um importante biomarcador no câncer colorretal, e sua análise de expressão pode fornecer informações valiosas sobre a função da via MMR e o risco genético do CCR18. A medição dos níveis de expressão de MLH1 no sangue periférico de pacientes com câncer de cólon pode fornecer informações valiosas sobre a funcionalidade da via MMR, que muitas vezes é interrompida no câncer de cólon. Esse método pode ser usado para fins prognósticos e para entender a suscetibilidade genética ao câncer de cólon 19,20. Um estudo sobre a relação entre a mutação MLH1 415 locus G para C e câncer colorretal esporádico em pacientes chineses descobriu que a frequência do genótipo MLH1 C/C foi significativamente maior em pacientes com CCR esporádico do que em controles, sugerindo uma suscetibilidade genética ao CCR esporádico em pacientes chineses21. Outro estudo comparou a expressão gênica de biomarcadores genéticos de CCR em amostras de sangue periférico e biópsia de pacientes com doença inflamatória intestinal (DII), destacando o potencial da análise da expressão gênica do sangue periférico para a compreensão dos biomarcadores relacionados ao câncer de cólon22.

Considerando o importante papel do gene MLH1 e estudos realizados nas últimas décadas com análise molecular por meio de perfis de expressão de mRNA, os cânceres têm sido classificados com maior precisão. O objetivo deste estudo foi investigar quantitativamente a expressão de MLH1 em amostras de sangue periférico de pacientes com CCR por meio de PCR em tempo real e investigar sua relação com fatores patológicos, estágios de progressão tumoral para as camadas da parede intestinal (T) e estágios de invasão aos linfonodos (N). Este estudo foi realizado em 36 pacientes com CCR para potencialmente estabelecer mudanças quantitativas na expressão gênica como biomarcadores para triagem, prognóstico e diagnóstico de CCR usando amostras de sangue periférico.

Protocolo

Uma pesquisa de caso-controle foi realizada no Hospital Afiliado 2 da Universidade de Nantong entre abril de 2021 e maio de 2023. Envolva-se com o departamento administrativo do hospital para estabelecer a estrutura do estudo. A aprovação ética foi obtida submetendo a proposta de estudo ao Comitê de Ética da Universidade de Nantong. Diretrizes éticas foram seguidas para garantir a confidencialidade e o consentimento informado.

1. Recrutamento de pacientes e desenho do estudo

  1. Amostragem para inclusão dos participantes no estudo
    1. Investigar a expressão do gene MLH1 no sangue periférico de 36 indivíduos com câncer de cólon e um grupo controle. Desenvolva critérios claros de inclusão e exclusão para a seleção dos participantes.
    2. Recrutar indivíduos diagnosticados com tipos específicos de câncer de cólon (câncer de cólon retossigmoide, ceco, ascendente, transverso e descendente que foram considerados como tendo tumores colorretais) e ter consentimento informado.
    3. Exclua indivíduos com outros diagnósticos ou condições de câncer que possam confundir a análise da expressão gênica. Além disso, exclua participantes com histórico de transfusão de sangue nos últimos 3 meses, histórico de quimioterapia ou radioterapia nos últimos 6 meses, histórico de uso de álcool ou drogas e histórico de doenças autoimunes ou doenças inflamatórias intestinais.
  2. Categorizar os fatores de risco clínicos de acordo com o sistema de estadiamento TNM (Tumor, Nodes and Metastasis), considerando a massa do câncer, o tamanho do tumor e a invasão de órgãos adjacentes23,24.
    1. Divida os diferentes estágios do câncer (0-4) com base nos dados disponíveis do arquivo de patologia.
    2. Segmente a taxa de crescimento e progressão do tumor nas camadas da parede intestinal (índice T) em quatro grupos distintos (T1-4, T0-TX) e invasão linfonodal (índice N) em quatro grupos (N1-3, N0-NX).
  3. Prepare um grupo de controle com indivíduos saudáveis.
    1. Combine o grupo de controle com o grupo de pacientes em termos de idade e sexo. Colete dados demográficos detalhados de cada participante para garantir a comparabilidade.
  4. Processo de consentimento informado
    1. Prepare documentos de consentimento informado que expliquem o propósito, os procedimentos e os riscos potenciais do estudo.
    2. Interaja com os participantes, dando-lhes tempo suficiente para fazer perguntas. Colete formulários de consentimento informado assinados antes de prosseguir com a coleta de amostras.

2. Extração e purificação de RNA

  1. Colheita de amostras de sangue periférico
    1. Obtenha tubos revestidos com EDTA disponíveis comercialmente que sejam certificados para uso clínico ou laboratorial. Verifique a data de validade dos tubos. Verifique a integridade da embalagem do tubo.
    2. Instrua o participante a sentar-se confortavelmente. Usando uma seringa estéril, retire 5 mL de sangue da veia antecubital. Certifique-se de que o participante esteja relaxado, com o braço estendido para expor a veia. Transfira imediatamente as amostras de sangue para os tubos preparados, garantindo uma exposição mínima ao ar.
    3. Manter as amostras a 4 °C durante o transporte para o laboratório para preservar a integridade do ARN.
  2. Use um minikit de sangue de RNA para isolamento de RNA seguindo as instruções do fabricante.
    1. Resumidamente, lise os glóbulos vermelhos incubando a amostra de sangue total com Buffer EL no gelo. Centrifugue para pellet os leucócitos e descarte o sobrenadante. Lisar os leucócitos com Buffer RLT e homogeneizar o lisado usando uma coluna trituradora.
    2. Adicione etanol ao lisado homogeneizado e transfira para uma coluna de centrifugação. Lave a coluna com Buffer RW1 e Buffer RPE. Eluir o RNA purificado adicionando água livre de RNase à coluna e centrifugando.
  3. Avaliação da quantidade e qualidade do RNA
    1. Quantificação de RNA: Empregue um espectrofotômetro para medir a concentração e a pureza do RNA. Abra o software no computador conectado. Selecione a opção Ácido nucleico no menu principal. Aplique 1 μL de amostra de RNA na área da amostra.
    2. Teste de pureza e integridade do RNA
      NOTA: A integridade e a distribuição de tamanho do RNA total purificado com o minikit de sangue de RNA podem ser verificadas por espectrofotômetro e eletroforese em gel. Os RNAs ribossômicos devem aparecer como bandas ou picos agudos. A proporção aparente de 28S rRNA para 18S rRNA deve ser de aproximadamente 2:1. Se as bandas ou picos ribossômicos de uma amostra específica não forem nítidas, mas aparecerem como uma mancha em direção a RNAs de tamanho menor; é provável que a amostra tenha sofrido grande degradação antes ou durante a purificação do RNA.
      1. Para medição de espectrofotometria, abaixe o braço do dispositivo e clique em Medir para obter a proporção A260/A280. Avaliar a pureza da amostra de RNA, visando uma relação A260/A280 entre 1,8 e 2,0.
      2. Realize eletroforese em gel de agarose a 1% conforme descrito abaixo.
        1. Prepare a solução de agarose a 1% aquecendo o pó de agarose em tampão TAE até dissolver. Adicione brometo de etídio à solução de agarose para atingir uma concentração final de 0,5 μg / mL. Despeje a solução de brometo de agarose-etídio em uma bandeja de fundição de gel e deixe-a solidificar.
          NOTA: O brometo de etídio é um corante fluorescente que se intercala com o RNA para permitir a visualização sob luz UV.
        2. Misture as amostras de RNA com o corante de carregamento e carregue-as cuidadosamente nos poços do gel solidificado. Execute a eletroforese em gel a 100 V por aproximadamente 30 min para separar os fragmentos de RNA por tamanho. Visualize as bandas de RNA colocando o gel em um transiluminador UV ou sistema de imagem, o que faz com que o RNA corado com brometo de etídio fique fluorescente.
  4. Armazenamento de RNA extraído
    1. Pegue as amostras de RNA extraídas. Alíquota do RNA em tubos de microcentrífuga estéreis, usando volumes de 10 μL por alíquota. Armazenar as alíquotas de ARN a uma temperatura igual ou inferior a -80 °C.
  5. Transcrição reversa de RNA em cDNA
    1. Siga o protocolo do kit de transcrição reversa. Descongele e prepare os reagentes necessários no gelo e em temperatura ambiente.
    2. Realize uma reação de eliminação do DNA genômico para remover qualquer contaminação do DNA genômico.
    3. Prepare a mistura master de transcrição reversa no gelo, que contém todos os componentes, exceto o RNA molde.
    4. Adicione o RNA molde da etapa de eliminação do DNA à mistura principal de transcrição reversa. Incubar a reação de transcrição reversa a 42 °C por 15 min.
    5. Inative a enzima transcriptase reversa incubando a 95 °C por 3 min. Use uma alíquota do cDNA acabado para PCR imediata em tempo real ou armazene o cDNA a -20 °C para uso posterior.

3. Projeto de primer para PCR em tempo real

  1. Seleção de genes-alvo e controles internos
    1. Escolha o gene MLH1 como alvo para quantificação devido à sua associação com câncer de cólon. Selecione β-actina como controle interno para normalização dos dados de expressão gênica.
  2. Processo de design do primer
    1. Inicie o software de design de primer e insira a sequência de genes de MLH1 obtida do Ensemble ou UCSC Genome Browser.
    2. Defina a temperatura de fusão (Tm) para primers entre 58-60 °C, conteúdo ideal de GC em 40%-60% e comprimento do primer entre 18-24 nucleotídeos.
    3. Insira as sequências de primers projetadas no banco de dados NCBI BLAST para confirmar a especificidade.
      1. Acesse o site do BLAST, selecione Nucleotide BLAST. Cole as sequências de primer na caixa de pesquisa e clique em BLAST.
      2. Analise os resultados para garantir que nenhuma amplificação fora do alvo seja prevista. Consulte a Tabela 1 para obter detalhes.

4. PCR em tempo real

  1. Configuração de reação de PCR em tempo real. Consulte a Tabela 2 para obter detalhes.
    1. Centrifugue os reagentes a 4 °C durante 5 min a 10 000 x g para recolher o conteúdo no fundo dos tubos.
    2. Prepare uma mistura master de acordo com o protocolo do kit comercial, que inclui SYBR Green, tampão, dNTPs, MgCl2 e Taq polimerase.
    3. Aloque a mistura principal em tubos de PCR rotulados, garantindo consistência no volume entre as amostras.
    4. Adicione o volume apropriado de primers diretos e reversos para MLH1 e β-actina em seus respectivos tubos.
    5. Dilua as amostras de RNA para uma concentração consistente de 100 ng/μL antes da transcrição reversa e transcreva reversamente para cDNA usando um kit de transcrição reversa.
  2. Amplificação e coleta de dados
    1. Coloque os tubos de PCR no sistema de PCR em tempo real.
    2. Programe o termociclador com as condições de ciclo otimizadas: 95 °C por 20 s para desnaturação, 54 °C por 30 s para recozimento e 72 °C por 30 s para extensão. Consulte a Tabela 3 para obter detalhes.
    3. Defina a máquina para funcionar por 45 ciclos.
    4. Monitore a reação em tempo real na interface do software do sistema, observando as curvas de amplificação de cada amostra.
    5. Incluir um controlo negativo sem cDNA para verificar a existência de contaminação. Repita a execução de PCR 3x para cada amostra para garantir a confiabilidade dos dados.
  3. Análise de dados
    1. Após completar os ciclos, use o software do sistema para analisar os valores do ciclo de limiar (Ct). Exporte os valores de Ct para um programa de planilha para análise posterior.
    2. Calcular a expressão gênica relativa usando o método 2-ΔΔCt 25, normalizando os dados para o controle de β-actina.

5. Imuno-histoquímica e análises genéticas

  1. Realize imuno-histoquímica em seções de tecido para correlacionar a expressão da proteína MLH1 com os níveis de expressão gênica.
    1. Prepare lâminas de tecido e aplique anticorpo anti-MLH1.
    2. Use um anticorpo secundário conjugado com HRP e um kit de substrato DAB (3,3'-Diaminobenzidina). Desenvolva as lâminas de acordo com as instruções do kit e analise-as com um microscópio óptico.
  2. Realize PCR específico para metilação e teste de instabilidade de microssatélites para diferenciar entre síndrome de Lynch e CCR esporádico.
    1. Use um kit comercial de extração de DNA. Siga o protocolo do kit para sangue e tecidos tumorais.
    2. Trate o DNA com um kit de conversão de bissulfito. Use primers específicos de metilação projetados para a região promotora de MLH1. Realize PCR de acordo com o protocolo do kit.
    3. Execute eletroforese em gel nos produtos de PCR para visualizar o status de metilação.
    4. Para testes de instabilidade de microssatélites (MSI), eletroforese capilar usando um analisador genético. Compare os comprimentos dos microssatélites analisando produtos de PCR marcados com fluorescência.

6. Análise estatística

  1. Empregue software comercial de análise estatística para análise de dados.
    1. Abra o software e crie um novo conjunto de dados para expressão gênica e dados demográficos.
    2. Insira os valores relativos de expressão gênica e os dados demográficos correspondentes no conjunto de dados.
    3. Use o teste de Kolmogorov-Smirnov para avaliar a normalidade dos dados.
      1. Selecione Analisar no menu superior, escolha Testes não paramétricos e, em seguida, Caixas de diálogo herdadas.
      2. Clique em Teste de Kolmogorov-Smirnov e insira a variável para expressão gênica. Execute o teste e interprete a saída para a significância da normalidade da distribuição.
    4. Realize testes T para comparar a expressão do gene MLH1 entre os grupos de pacientes e controle.
      1. Selecione Analisar, Comparar Médias e escolha Teste T de Amostras Independentes.
      2. Atribua a associação ao grupo (paciente ou controle) como a variável de agrupamento e a expressão gênica como a variável de teste. Execute o teste e interprete o nível de significância bicaudal.
    5. Calcule as mudanças de dobra na expressão gênica usando o método 2-ΔΔCt 25.

Resultados

Neste estudo, 36 pacientes com câncer de cólon foram examinados quanto à expressão do gene MLH1 no sangue periférico e sua relação com o câncer de cólon. A análise das variáveis demográficas mostrou que 15 pacientes (41,6%) eram mulheres e 21 pacientes (58,4%) eram homens. A média de idade dos pacientes foi de 57,35 ± 4,22 anos, e a faixa etária foi de 26 a 87 anos. O índice de massa corporal (IMC) dos pacientes mostrou que 14 pacientes (38,8%) tinham IMC normal ...

Discussão

Este estudo foi realizado com o objetivo de investigar a expressão do gene MLH1 . Neste estudo, foi demonstrado que o nível de expressão do gene MLH1 diminuiu em pessoas doentes em comparação com pessoas saudáveis. Com base em estudos de mudança de dobra, foi demonstrado que a expressão do gene MLH1 no estágio II, estágio III e estágio IV em pessoas doentes em comparação com pessoas saudáveis teve uma diminuição significativa.

Divulgações

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Agradecimentos

Gostaríamos de expressar nossa gratidão e apreço a todos que nos ajudaram a concluir este esforço de pesquisa.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Agarose Gel Electrophoresis EquipmentBio-RadMini-Sub Cell GT SystemsUsed to check RNA quality
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Sigma-AldrichE9884Used as an anticoagulant for blood samples
NanoDropThermoFisher ScientificND-2000Spectrophotometer used to determine RNA purity
Real-time PCR MachineApplied BiosystemsA34322Used for RT-PCR reactions
RNA Extraction KitIntron Biotechnology Co#Cat 17061Used for RNA extraction from blood samples
SYBR Green PCR KitThermo Fisher Scientific4309155Reagents used for RT-PCR experiments

Referências

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