Hemostasia de Ferida por Punção e Preparação de Amostras para Análise de Microscopia Eletrônica de Área Larga Montada

Resumo

Um procedimento de punção para formação de trombo hemostático é apresentado aqui. Os trombos formados são grandes e têm centenas de mícrons de diâmetro. Portanto, as abordagens de imagem de volume são apropriadas. Sugerimos microscopia eletrônica de transmissão de área ampla montada como uma abordagem de alta resolução disponível para muitos e detalhamos um protocolo preparativo.

Resumo

A hemostasia, o processo de controle fisiológico normal do dano vascular, é fundamental para a vida humana. Todos nós sofremos pequenos cortes e perfurações de vez em quando. Na hemostasia, a agregação plaquetária autolimitada leva à formação de um trombo estruturado no qual a cessação do sangramento vem do fechamento do orifício pelo lado de fora. A caracterização detalhada dessa estrutura poderia levar a distinções entre hemostasia e trombose, um caso de agregação plaquetária excessiva levando à coagulação oclusiva. Uma abordagem baseada em imagem para a estrutura do trombo da ferida por punção é apresentada aqui, que se baseia na capacidade da microscopia eletrônica de seção fina de visualizar o interior dos trombos hemostáticos. A etapa mais básica em qualquer protocolo experimental baseado em imagem é uma boa preparação da amostra. O protocolo fornece procedimentos detalhados para a preparação de feridas por punção e trombos ricos em plaquetas em camundongos para microscopia eletrônica subsequente. Um procedimento detalhado é fornecido para a fixação in situ do trombo da ferida de punção em formação e seu processamento subsequente para coloração e incorporação para microscopia eletrônica. A microscopia eletrônica é apresentada como a técnica de imagem final devido à sua capacidade, quando combinada com o seccionamento sequencial, de visualizar os detalhes do interior do trombo em alta resolução. Como método de imagem, a microscopia eletrônica fornece amostragem imparcial e uma saída experimental que escala de nanômetros a milímetros em 2 ou 3 dimensões. É citado um software de microscopia eletrônica freeware apropriado que suportará microscopia eletrônica de área ampla, na qual centenas de quadros podem ser combinados para fornecer imagens em escala nanométrica de seções transversais inteiras de trombos de feridas de punção. Assim, qualquer sub-região do arquivo de imagem pode ser facilmente colocada no contexto da seção transversal completa.

Introdução

A formação de um trombo de punção que leva à cessação do sangramento é um dos eventos mais essenciais da vida¹. No entanto, apesar dessa essencialidade, o conhecimento do que ocorre estruturalmente durante a formação do trombo, seja em uma veia, uma artéria, um evento aterosclerótico ou um coágulo oclusivo, tem sido limitado pela resolução e profundidade da imagem. A microscopia óptica convencional é limitada em profundidade quando comparada a um trombo de ferida por punção totalmente formado, 200 a 300 μm em Z¹, e em nível de resolução quando comparada ao tamanho das organelas plaquetár....

Protocolo

Os experimentos foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Arkansas para Ciências Médicas. Aqui, foram usados camundongos C57BL / 6 machos e fêmeas do tipo selvagem de 8 a 12 semanas de idade. Esses camundongos são adultos jovens com pouco acúmulo de gordura. Os mesmos procedimentos são aplicáveis a mutantes de camundongos para várias proteínas importantes para a hemostasia, como o fator de von Willebrand ou a glicoproteína plaquetária VI (GPVI)^5,6. Todos os equipamentos, instrumentos cirúrgicos, reagentes e ou....

Discussão

Apresentamos um procedimento detalhado de punção para produção de trombos hemostáticos em veias jugulares e artérias femorais, sua fixação de perfusão in situ e processamento de amostras para microscopia eletrônica de transmissão de área ampla montada. Os procedimentos gerais são úteis para gerar trombos hemostáticos para análise ultraestrutural e para comparar tempos de sangramento em camundongos experimentais, por exemplo, camundongos tratados com diferentes ti.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Normal Saline Solution	Medline	BHL2F7123HH
27G x 3/4 EXELint scalp vein set	Medline	NDA26709
30G x 1/2 EXELint hypodermic needles	Medline	NDA264372
33G x 1/2 EXELint specialty hypodermic needles	Medline	NDA26393
50 mL Conical Tubes	Fisher Scientific	06-443-20
Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl Alcohol)	Medline	MDS090670Z
Aluminum Foil	Fisher Scientific	01-213-100
Animal Heating Plate	Physitemp Instruments	HP-1M
Araldite GY 502	Electron Microscopy Sciences	10900
Axiocam 305 Color R2 Microscopy Camera	Carl Zeiss Microscopy	426560-9031-000
BD Luer-Lok Syringes, 20 mL	Medline	B-D303310Z
Calcium Chloride	Fisher Scientific	C79-500
Cell Culture Dishes 35mm x 10mm	Corning Inc.	430165
Cotton Tipped Applicators	Medline	MDS202055H
DMP-30 Activator	Electron Microscopy Sciences	13600
Dodecenyl Succinic Anhydride/ DDSA	Electron Microscopy Sciences	13700
Dressing Forceps, 5", curved, serrated, narrow tipped	Integra Miltex	6-100
Dressing Forceps, 5", standard, serrated	Integra Miltex	6-6
EMBED 812 Resin	Electron Microscopy Sciences	14900
Ethyl Alcohol, anhydrous 200 proof	Electron Microscopy Sciences	15055
Fisherbrand 4-Way Tube Rack	Fisher Scientific	03-448-17
Fisherbrand Digital Timer	Fisher Scientific	14-649-17
Fisherbrand Single Syringe Infusion Pump	Fisher Scientific	7801001
Gauze Sponges 2" x 2"- 4 Ply	Medline	NON26224H
Glutaraldehyde (10% Solution)	Electron Microscopy Sciences	16120
Isoflurane Liquid Inhalant Anesthesia, 100 mL	Medline	66794-017-10
Jeweler-Style Micro-Fine Forceps, Style 5F	Integra Miltex	17-305	Need 2 pairs.
L/S Pump Tubing, Silicone, L/S 15; 25 Ft	VWR	MFLX96410-15
L-Aspartic Acid	Fisher Scientific	BP374-100
Lead Nitrate	Fisher Scientific	L-62
Malachite Green 4	Electron Microscopy Sciences	18100
Masterflex L/S Easy-Load II Pump Head	VWR	MFLX77200-62
Masterflex L/S Variable Speed Digital Drive	VWR	MFLX07528-10
MSC Xcelite 5" Wire Cutters	Fisher Scientific	50-191-9855
Osmium Tetroxide 4% Aqueous Solution	Electron Microscopy Sciences	19150
Paraformaldehyde (16% Solution)	Electron Microscopy Sciences	15710
Physitemp Temperature Controller	Physitemp Instruments	TCAT-2LV
Potassium Ferrocyanide	Sigma-Aldrich	P-8131
Propylene Oxide, ACS Reagent	Electron Microscopy Sciences	20401
Pyrex Glass Beakers	Fisher Scientific	02-555-25B
Rectal Temperature Probe for Mice	Physitemp Instruments	RET-3
Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000"	3M Company	305289
Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH 7.4	Electron Microscopy Sciences	11623
SomnoFlo Low Flow Electronic Vaporizer	Kent Scientific	SF-01
SomnoFlo Starter Kit for Mice	Kent Scientific	SF-MSEKIT
Stainless Steel Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-10
Stereomicroscope steREO Discovery.V12	Carl Zeiss Microscopy	495015-9880-010
Sylgard 184 Silicone Elastomer	World Precision Instruments	SYLG184	silicone mat
Tannic Acid	Electron Microscopy Sciences	21700
Thiocarbohydrazide (TCH)	Sigma-Aldrich	88535
Uranyl Acetate	Electron Microscopy Sciences	22400
Vannas Spring Micro Scissors	Fine Science Tools	15000-08
Von Graefe Eye Dressing Forceps, 2.75", Curved, Serrated	Integra Miltex	18-818	Need 2 pairs.
Wagner Scissors	Fine Science Tools	14068-12
Wahl MiniFigura Animal Trimmer	Braintree Scientific	CLP-9868
Zen Lite Software	Carl Zeiss Microscopy	410135-1001-000