Isolamento nuclear de células sanguíneas derivadas criopreservadas in vitro

Resumo

Descrevemos um protocolo para extrair núcleos de alta qualidade de tipos de células estromais/endoteliais e sanguíneas derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas por criopreservas, para apoiar análises de sequenciamento de próxima geração de núcleo único. A produção de núcleos intactos e de alta qualidade é imperativa para experimentos multiômicos, mas pode ser uma barreira à entrada no campo para alguns laboratórios.

Resumo

Modelos baseados em células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) são excelentes plataformas para entender o desenvolvimento do sangue, e as células sanguíneas derivadas de iPSC têm utilidade translacional como reagentes de testes clínicos e terapias de células transfusíveis. O advento e a expansão da análise multiômica, incluindo, entre outros, o sequenciamento de RNA de núcleo único (snRNAseq) e o sequenciamento de cromatina acessível por transposase (snATACseq), oferece o potencial de revolucionar nossa compreensão do desenvolvimento celular. Isso inclui biologia do desenvolvimento usando modelos hematopoiéticos in vitro . No entanto, pode ser tecnicamente desafiador isolar núcleos intactos de células cultivadas ou primárias. Diferentes tipos de células geralmente requerem preparações nucleares personalizadas, dependendo da rigidez e do conteúdo celular. Essas dificuldades técnicas podem limitar a qualidade dos dados e atuar como uma barreira para os investigadores interessados em realizar estudos multiômicos. A criopreservação de amostras é frequentemente necessária devido a limitações na coleta e/ou processamento de células, e amostras congeladas podem apresentar desafios técnicos adicionais para o isolamento nuclear intacto. Neste manuscrito, fornecemos um método detalhado para isolar núcleos de alta qualidade de células derivadas de iPSC em diferentes estágios de desenvolvimento hematopoiético in vitro para uso em fluxos de trabalho multiômicos de núcleo único. Focamos o desenvolvimento do método no isolamento de núcleos de células estromais/endoteliais aderentes derivadas de iPSC e células progenitoras hematopoiéticas não aderentes, pois representam tipos de células muito diferentes em relação à identidade estrutural e celular. As etapas de solução de problemas descritas limitaram a aglomeração e os detritos nucleares, permitindo a recuperação de núcleos em quantidade e qualidade suficientes para análises a jusante. Métodos semelhantes podem ser adaptados para isolar núcleos de outros tipos de células criopreservadas.

Introdução

A hematopoiese é um sistema de desenvolvimento relativamente bem caracterizado, mas a incapacidade de recapitular a formação de células sanguíneas in vitro demonstra uma compreensão incompleta dos fatores relacionados. Modelos de hematopoiese baseados em células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) podem ajudar a elucidar os principais fatores de desenvolvimento e a biologia relacionada. O sistema iPSC também oferece um excelente modelo para estudar distúrbios sanguíneos, e células sanguíneas baseadas em iPSC foram desenvolvidas para produzir reagentes traducionais e terapeuticamente relevantes 1,2,3,4. Estudos de células únicas têm sido usados extensivamente para investigar a biologia do desenvolvimento baseada em iPSC, incluindo tipos de células que são produzidas durante a hematopoiese⁵. Em comparação com o sequenciamento de RNA em massa, que não pode inferir relações entre subpopulações celulares⁶, as modalidades unicelulares permitem avaliações da heterogeneidade celular e podem facilitar a identificação e caracterização do desenvolvimento celular ^6,7.

A formação de células hematopoiéticas a partir de iPSCs requer diferenciação sequencial através de estados primitivos, mesoderma e endotelial para formar células endoteliais hemogênicas. As células endoteliais hemogênicas são precursoras diretas das células-tronco hematopoiéticas e progenitoras⁸. Esses tipos de células têm propriedades morfológicas e celulares notavelmente diferentes. Há uma compreensão limitada da paisagem epigenética e da dinâmica de desenvolvimento de modelos de células hematopoiéticas derivadas in vitro, embora este seja um conhecimento essencial para desbloquear todo o potencial terapêutico do sistema iPSC. Em muitos casos, apenas as modalidades de análise de células únicas permitem a identificação de populações celulares, atividades transcricionais, paisagens de cromatina e mecanismos regulatórios que governam o desenvolvimento entre preparações celulares heterogêneas.

Duas metodologias, sequenciamento de RNA de célula única (scRNAseq) e sequenciamento de RNA de núcleo único (snRNAseq), podem revelar insights transcricionais no nível de célula individual⁹. Um fator principal que determina a validade e a confiabilidade dos dados é a necessidade intransigente de amostras que atendam a rigorosos critérios de qualidade. Isso inclui requisitos precisos para densidade celular/nuclear, viabilidade ideal e aglomeração mínima. A preparação de núcleos únicos pode ser tecnicamente desafiadora. Pode haver desafios adicionais associados ao uso de células previamente criopreservadas.

Observamos quatro limitações potenciais importantes para as abordagens scRNAseq padrão. Primeiro, os protocolos padrão para gerar suspensões celulares geralmente fazem referência a preparações de células ou tecidos frescos, em vez daquelas recuperadas após a criopreservação¹⁰. Isso pode reduzir a utilidade de recursos potencialmente valiosos. Em segundo lugar, a eficiência de dissociação de diversos tipos de células é variável. Por exemplo, muitos tipos de células imunes sofrem dissociação com relativa facilidade. Em contraste, células estromais, fibroblastos e células endoteliais, que normalmente estão embutidas na matriz extracelular e na membrana basal, têm propriedades celulares únicas que podem complicar o isolamento dos núcleos^11,12. Essas propriedades podem exigir protocolos de dissociação agressivos, o que pode comprometer a integridade estrutural de populações de células mais delicadas. Em terceiro lugar, algumas células (por exemplo, megacariócitos) podem ultrapassar 100 μm de diâmetro e representar dificuldades para várias plataformas comerciais de célula única existentes¹³. Além disso, o manuseio inadequado pode levar a danos celulares e respostas ao estresse durante as etapas iniciais do isolamento celular, envolvendo hidrólise enzimática e dissociação mecânica, o que pode afetar os perfis de expressão gênica^11,14.

Por essas e outras razões, uma abordagem de núcleo único pode ser uma alternativa preferível aos métodos de célula única¹⁵. Dada a estabilidade superior da membrana nuclear em comparação com a membrana celular, o envelope nuclear pode permanecer intacto mesmo após a criopreservação do tecido¹⁶. Isso pode facilitar a extração nuclear e aumentar a diversidade de tipos de amostras adequados para modalidades de sequenciamento de próxima geração. Em segundo lugar, os núcleos exibem maior resistência a perturbações mecânicas e tendem a manifestar menos mudanças transcricionais durante a dissociação¹⁴. Portanto, os núcleos podem fornecer maior estabilidade do RNA e perfis transcricionais mais reprodutíveis. Uma terceira vantagem digna de nota dos métodos de núcleo único é a falta de restrições de tamanho celular e a aplicabilidade para células maiores, como cardiomiócitos ou megacariócitos¹². Em quarto lugar, os núcleos servem como substratos adequados para análises multiômicas, que oferecem insights expandidos da análise integrada da expressão gênica, regiões de cromatina acessíveis e outros parâmetros¹⁷, permitindo uma compreensão mais profunda da heterogeneidade, desenvolvimento e estados funcionais celulares¹⁸.

Ao traçar o perfil das iPSCs durante o desenvolvimento hematopoiético, as abordagens multiômicas podem ajudar a definir os processos de desenvolvimento em modelos de doenças normais ou patológicas. As comparações de células derivadas de iPSC com células ou tecidos primários também podem fornecer uma avaliação da fidelidade do modelo iPSC à biologia in vivo , facilitando a melhoria do modelo iPSC e a descoberta de novas populações de células e fatores que impulsionam a formação de sangue.

Embora muitos grupos tenham navegado com sucesso no isolamento nuclear e na análise de sequenciamento de próxima geração resultante, o isolamento de núcleos de alta qualidade continua sendo uma barreira para alguns laboratórios interessados em realizar análises baseadas em núcleo único. Este manuscrito detalha um protocolo para isolar núcleos de qualidade de células derivadas de iPSC previamente criopreservadas. Nós nos concentramos em células estromais/endoteliais aderentes e células progenitoras hematopoiéticas não aderentes, pois representam tipos de células muito diferentes em relação à estrutura e conteúdo que exigem modificações personalizadas e solução de problemas para aumentar a recuperação de núcleos de alta qualidade passíveis de sequenciamento de próxima geração ou outros experimentos.

Protocolo

1. Criopreservação de células

1. Congele >1 x 10⁶ células derivadas de iPSC isoladas por mL em 1 mL de 90% de FBS e 10% de DMSO. Coloque os criogenianos em um recipiente de congelamento a -80 ° C para reduzir a velocidade de congelamento e otimizar a recuperação de células viáveis (Tabela de Materiais). Antecipe uma perda celular considerável, que pode variar de acordo com as condições de cultura e a identidade celular.
2. Passar de -80 °C para armazenamento de nitrogênio líquido em 24 h.

2. Descongelamento de células

1. Recupere o criovial do armazenamento de nitrogênio líquido e descongele em banho-maria a 37 °C por 2 min. Retire do banho-maria enquanto pequenos cristais de gelo ainda estão visíveis.
2. Transfira as células do criogênico para um tubo vazio de 15 mL e adicione lentamente 10 mL de meio pré-aquecido (RPMI 1640 + 10% FBS) enquanto mistura cuidadosamente. Centrifugue a 400 x g por 3 min a 25 °C.
3. Aspire o sobrenadante e reconstitua em 1 mL de DPBS suplementado com 2% de FBS e 1 mM de CaCl₂ (Tabela de Materiais). Misture cuidadosamente pipetando 3x com uma micropipeta de 1000 μL. Transfira para um tubo inferior redondo de poliestireno de 5 mL.

3. Remoção de células mortas

1. Adicione 50 μL de coquetel de remoção de células mortas (Tabela de Materiais) a 1 mL de suspensão celular. Adicione 50 μL de coquetel de seleção de biotina à mistura celular. Incube em temperatura ambiente por 3 min. Essas etapas rotulam as células mortas da Anexina V ⁺ contidas na suspensão celular com biotina.
2. Vigorosamente vórtice por 30 s, os grânulos de dextrano projetados para o esgotamento de tipos de células indesejadas marcadas com biotina (Tabela de Materiais). Adicione 100 μL de grânulos de dextrano à suspensão celular e misture pipetando suavemente para cima e para baixo 2x com uma micropipeta de 1000 μL (Tabela de Materiais).
3. Adicione 1,3 mL de DPBS contendo 2% de FBS e 1 mM de CaCl₂ à suspensão celular e misture pipetando suavemente para cima e para baixo 2x com uma micropipeta de 1000 μL. Coloque o tubo no ímã (Tabela de Materiais) e incube em temperatura ambiente por 3 min.
4. Inverta o ímã e o tubo para despejar a suspensão de células vivas enriquecida em um novo tubo cônico de 15 mL. Centrifugue a 400 x g por 3 min a 4 ° C. Remova a maior parte do sobrenadante e ressuspenda em 1 mL de DPBS + 0,04% BSA. Misture delicadamente pipetando 3x com uma micropipeta de 1000 μL.

4. Isolamento de núcleos

1. Centrifugar a suspensão de células vivas a 460 x g durante 5 min a 4 °C e aspirar o sobrenadante, garantindo que não se rompe o sedimento celular.
2. Adicione 100 μL de tampão de lise 0,5x recém-preparado resfriado em gelo (Tabela 1) e misture delicadamente pipetando 10x com uma micropipeta de 100 μL. Incube 3 min no gelo.
3. Adicione 500 μL de tampão de lavagem refrigerado (Tabela 2) ao tubo sem misturar. Centrifugue a 600 x g durante 5 min a 4 °C.

5. Lavagem e avaliação de núcleos

1. Aspirar o sobrenadante e adicionar 500 μL de tampão de lavagem refrigerado para dissolver o sedimento intacto restante sem misturar. Centrifugue a 600 x g durante 5 min a 4 °C. Remova todo o sobrenadante sem interromper o pellet dos núcleos.
2. Ressuspender em 120 μL de tampão de núcleos diluídos resfriados (Tabela 3). Filtrar a suspensão celular com um filtro de células de 40 μm (Tabela de Materiais).
3. Corar com 0,4% de azul de tripano e avaliar visualmente a qualidade dos núcleos isolados ao microscópio de 10x (Tabela de Materiais).

6. Processamento de núcleos isolados

1. Mantenha os núcleos no gelo. Prossiga para o processamento adicional imediatamente, pois a aglomeração nuclear pode ocorrer ao longo do tempo e exigir etapas adicionais de filtragem.

Resultados

Empregamos o protocolo acima mencionado para extrair núcleos de células estromais/endoteliais aderentes derivadas de iPSC criopreservadas e células progenitoras hematopoiéticas não aderentes (flutuantes). Uma representação esquemática detalhada do procedimento de isolamento nuclear pode ser encontrada na Figura 1.

Para o exame morfológico, os núcleos isolados foram corados com azul de tripano e visualizados ao microscópio. O exame morfológico nuclear ?...

Discussão

Etapas críticas dentro do protocolo
Isolar núcleos de alta qualidade é essencial para a implementação bem-sucedida das atuais modalidades de sequenciamento de próxima geração baseadas em núcleo único, que estão evoluindo rapidamente. Em reconhecimento às barreiras existentes para laboratórios interessados nessas abordagens, particularmente para espécimes criopreservados, nossa intenção era criar uma técnica de isolamento nuclear adaptada para células previamente congeladas. O isolame...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Culture Reagents
Dimethyl sulfoxide solution (DMSO)	Sigma	673439
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)	Corning	21031CV
Fetal Bovine Serum (FBS)	GeminiBio	100106
RPMI Medium 1640 (1X)	Gibco	11875093
Cells
Induced pluripotent stem cells	N/A	N/A	The iPSCs used in this study were obtained through the CHOP Human Pluripotent Stem Cell Core Facility
Cell Staining Reagents
Trypan Blue Solution	Corning	25900CI
Dead Cell Removal Reagents
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma	C4901
EasySep Dead Cell Removal (Annexin V) Kit	StemCell Technologies	17899	This kit is designed for the depletion of unwanted cell types labeled with biotin. The kit includes Dead Cell Removal (Annexin V) Cocktail, Biotin Selection Cocktail, and Dextran beads. This kit targets phosphatidylserine on the outer leaflet of the cell membrane of apoptotic cells using Annexin V. Unwanted cells are labeled with Annexin V, Biotinylated antibodies, and magnetic particles, and separated without columns using an EasySep magnet. Desired cells are simply poured off into a new tube.
Materials
10 µl Micropipette	Wards science	470231606
100 µl Micropipette	Wards science	470231598
1000 µl Extended Universal Tip	Oxford Lab Products	OAR-1000XL-SLF
1000 µl Micropipette	Wards science	470231602
2.0 ml Cryogenic vials	Corning	431386
20 µl Micropipette	Wards science	470231608
200 µl Micropipette	Wards science	470231600
5ml Polystyrene Round-Bottom Tube	Falcon	352063
Corning DeckWork 0.1-10 µl Pipet Tip Station	Corning	4143
Corning DeckWork 1-200 µl Pipet Tip Station	Corning	4144
Counting chamber	CytoSMART	699910591
Flowmi Cell Strainer, 40 µm	Bel-Art	H136800040
Magnet	StemCell Technologies	18000
NALGENE Cryo 1°C Freezing Container	Nalgene	51000001
Nuclei Isolation Reagents			Nuclei isolation reagents include Lysis Buffer,  Wash buffer, and Diluted Nuclei Buffer,and Lysis Dilution Buffer. The constitution of these buffers are in the Table 1, 2, and 3. Our nuclei isolation method improved isolation from the standard kit protocols (e.g., 10x Genomics Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide [CG000338]). This protocol can be used with several commercial kits, including the Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 16 rxns (PN-1000283).
Dead Cell Removal kit	STEMCELL	17899
Digitonin	Thermo Fisher Scientific	BN2006
DL-Dithiothreitol solution (DTT)	Sigma	646563
Flowmi Cell Strainer, 40 µm	Bel-Art	H136800040
MACS bovine serum albumin (BSA) stock Solution	Miltenyi Biotec	130091376
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma	7786303
Magnesium Chloride Solution, 1 M	Sigma	M1028
Nonidet P40 Substitute	Sigma	74385
Nuclease-Free Water	Thermo Fisher Scientific	AM9937
Nuclei Buffer (20X)	10X Genomics	2000153
Protector RNase inhibitor	Sigma	3335399001
Sodium chloride (NaCl)	Sigma	S7653-250G
Sodium Chloride Solution, 5 M	Sigma	59222C
Trizma Hydrochloride Soultion, pH 7.4	Sigma	T2194
Trizma hydrochloride (Tris-HCl) (pH7.4)	Sigma	T3252-500G
Tween 20	Bio-Rad	1662404
Other equipment
Automated cell counter	CytoSMART	699910591
Microscope	Zeiss	Primostar 3