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Resumo

Este protocolo descreve as etapas primárias para obter embriões de peixes livres de germes (GF) e mantê-los desde as larvas até o estágio juvenil, incluindo amostragem e detecção de seu status estéril. O uso de modelos de GF com infecção é importante para entender o papel dos micróbios na saúde do hospedeiro.

Resumo

O peixe-zebra serve como modelos valiosos para pesquisas sobre crescimento, imunidade e microbiota intestinal devido às suas semelhanças genômicas com mamíferos, embriões transparentes desenvolvidos em um ambiente córion relativamente limpo e desenvolvimento extremamente rápido de larvas em comparação com modelos de roedores. O peixe-zebra livre de germes (GF) (Danio rerio) é crucial para avaliar a toxicidade de poluentes e estabelecer modelos de doenças semelhantes às humanas relacionadas às funções microbianas. Em comparação com os modelos criados convencionalmente (CR) (peixes em criação comum), o peixe-zebra GF permite uma manipulação mais precisa da microbiota do hospedeiro, auxiliando na determinação da relação causal entre microrganismos e hospedeiros. Consequentemente, eles desempenham um papel crítico no avanço de nossa compreensão dessas relações. No entanto, os modelos de peixe-zebra GF são normalmente gerados e pesquisados durante os estágios iniciais da vida (de embriões a larvas) devido a limitações na função imunológica e absorção de nutrientes. Este estudo otimiza a geração, manutenção e identificação de modelos iniciais de peixe-zebra GF sem alimentação e com alimentação de longo prazo usando alimentos GF (como Artemia sp., artêmia). Ao longo do processo, amostragem e cultura diárias foram realizadas e identificadas por meio de múltiplas detecções, incluindo placas e sequenciamento de rRNA 16S. A taxa asséptica, a sobrevivência e os índices de desenvolvimento do peixe-zebra GF foram registrados para garantir a qualidade e a quantidade dos modelos gerados. É importante ressaltar que este estudo fornece detalhes sobre técnicas de isolamento bacteriano e infecção para peixes GF, permitindo a criação eficiente de modelos de peixes GF desde larvas até estágios juvenis com suporte alimentar GF. Ao aplicar esses procedimentos em pesquisas biomédicas, os cientistas podem entender melhor as relações entre as funções bacterianas intestinais e a saúde do hospedeiro.

Introdução

A microbiota (ou seja, Archaea, Bacteria, Eukarya e vírus) desempenha papéis cruciais na manutenção da saúde do hospedeiro e contribui para o desenvolvimento de várias doenças, influenciando processos fisiológicos e patológicos por meio de interações simbióticas dentro da barreira intestinal, superfície epitelial e funções de mucina em indivíduos 1,2,3. A composição da microbiota em diferentes fases da vida, desde a infância até a juventude, idade adulta e envelhecimento, bem como sua presença em vários locais, como narinas, locais orais, cutâneos e intestinais, é moldada dinamicamente por diversos habitats e ambientes4. A microbiota intestinal nos organismos está envolvida na absorção de nutrientes, resposta imune, invasão de patógenos, regulação metabólica, etc 5,6. Estudos em pacientes demonstraram que as interrupções na microbiota intestinal estão relacionadas à obesidade humana, distúrbios do sono, depressão, doença inflamatória intestinal (DII), doenças neurodegenerativas (Parkinson, Alzheimer), envelhecimento e vários tipos de câncer 7,8,9. Além disso, as vias interativas entre a microbiota intestinal e os hospedeiros envolvem fatores inflamatórios, neurotransmissores, metabólitos, barreira intestinal e estresse oxidativo, conforme observado em pesquisas anteriores usando modelos de camundongos e peixes10,11.

Recentemente, várias abordagens ou terapias relacionadas a bactérias, incluindo potenciais probióticos e transplante de microbiota fecal (FMT), foram exploradas para esses distúrbios em modelos clínicos e animais. Essas explorações são baseadas em descobertas relacionadas ao eixo microbiota-intestino-cérebro/fígado/rim, produtos derivados da microbiota e atividade alterada do receptor12,13. No entanto, o desenvolvimento, várias funções e mecanismos do sistema microbiota-hospedeiro ainda são incompletamente compreendidos e identificados devido à complexidade da comunidade microbiana e ao desafio de gerar poderosos modelos de doenças semelhantes às humanas.

Para resolver essas questões, modelos animais livres de germes (GF) foram propostos com urgência em meados doséculo 19 e desenvolvidos principalmente duranteo século 20. Refinamentos subsequentes, incluindo modelos tratados com antibióticos e gnotobióticos, juntamente com avanços nas tecnologias de detecção e observação microbiana, aperfeiçoaram ainda mais esses modelos 14,15,16. Os animais GF, criados apagando seu próprio fundo e evitando micróbios ambientais, oferecem uma excelente estratégia para explorar as interações entre microrganismos e seus hospedeiros17. Por meio da aplicação de modelos animais e protocolos refinados, os pesquisadores replicaram com sucesso composições microbianas semelhantes encontradas em pacientes em camundongos e peixes GF. Além disso, outros modelos animais de FG, como cães, galinhas e porcos, oferecem diversas opções como sujeitos de pesquisa 18,19,20,21. Essa abordagem permitiu investigações sobre os potenciais efeitos terapêuticos dos microbiomas comensais em várias doenças, incluindo a imunoterapia contra o câncer em humanos16,18. Os modelos GF oferecem informações mais precisas sobre as características e mecanismos de colonização, migração, multiplicação e interação bacteriana específica dentro dos hospedeiros. Isso fornece novos insights cruciais sobre a ocorrência e o desenvolvimento de doenças relacionadas à microbiota22,23. A história de estabelecimento e aplicação do peixe-zebra GF na pesquisa microbiana evoluiu dos relatórios de Rawls et al. em 2004 e Bates et al. em 2006 para o protocolo de Melancon et al. em 2017 16,24,25. No entanto, a viabilidade de modelos de FG adultos ou reprodutores ainda é um processo prolongado, acompanhado de longevidade variável, taxas de sucesso e desafios de saúde.

Dentre os vários modelos animais, o peixe-zebra (Danio rerio) destaca-se como uma ferramenta crítica para a pesquisa básica e biomédica devido à sua semelhança vantajosa com órgãos humanos e genômica, ciclo de desenvolvimento curto, alta fecundidade e embriões transparentes19,26. O peixe-zebra, servindo como modelos confiáveis de doenças humanas, oferece uma representação visual de processos fisiológicos e patológicos in vivo, fornecendo informações sobre as características atraentes das interações hospedeiro-micróbio. Notavelmente, o peixe-zebra exibe linhagens celulares distintas, permitindo imagens da fisiologia intestinal, dinâmica microbiana, gônadas e desenvolvimento reprodutivo, maturação do sistema imunológico do hospedeiro, comportamento e metabolismo27. Os embriões de peixe-zebra se desenvolvem dentro de córions protetores até a eclosão, tornando-se larvas 3 dias após a fertilização (dpf). Eles caçam ativamente por comida a 5 dpf e atingem a maturidade sexual por volta de 3 meses após a fertilização (mpf)28. O primeiro peixe-zebra livre de germes (GF) bem-sucedido, relatado por Rawls et al.24, mostrou que larvas alimentadas com ração autoclavada após a absorção da gema exibiram necrose tecidual de 8 dpf e morte total a 20 dpf. Isso indicou os efeitos da dieta ou a importância de considerar o suprimento de nutrientes exógenos em experimentos envolvendo peixes GF de longo prazo (>7 dpf)29. Estudos subsequentes aprimoraram o protocolo de geração de peixes GF, empregando alimentos estéreis e métodos aperfeiçoados em diferentes modelos de peixes16.

No entanto, a maioria das pesquisas em modelos de peixe-zebra GF tem se concentrado nos estágios iniciais da vida, envolvendo infecção bacteriana a 5 dpf por 24 h a 48 h, com amostras coletadas antes de 7 dpf na conclusão dos experimentos 25,30,31. É amplamente reconhecido que a microbiota em organismos, incluindo humanos e peixes-zebra, é colonizada no início da vida e moldada durante o crescimento e desenvolvimento. A composição permanece estável na fase adulta, sendo os papéis da microbiota no hospedeiro cruciais ao longo da vida, especialmente nos aspectos do envelhecimento, neurodegenerativos, obesidade metabólica e doenças intestinais3. Assim, as perspectivas de animais GF com maior sobrevida podem fornecer insights sobre os mecanismos dos papéis microbianos no desenvolvimento e funções dos órgãos do hospedeiro, considerando os sistemas imunológico e reprodutivo imaturos das larvas de peixes no início da vida. Embora cepas bacterianas no intestino do peixe-zebra tenham sido isoladas e identificadas em estudos anteriores, oferecendo o potencial de infectar modelos animais de GF para selecionar probióticos ou pesquisar funções bacterianas no hospedeiro19,25, a geração e aplicação de modelos de peixes GF foram restritas principalmente aos estágios iniciais da vida. Essa limitação, atribuída ao complexo processo de produção, altos custos de manutenção e problemas associados com alimentos e imunidade, dificulta os esforços de pesquisa destinados a investigar os efeitos crônicos e de desenvolvimento da microbiota no hospedeiro.

A taxa de sobrevivência, comportamento, crescimento, maturação e saúde geral dos peixes, especialmente em modelos livres de germes (GF), são significativamente influenciados pelas práticas alimentares, abrangendo a ingestão e absorção de nutrientes durante o período de boca aberta, desde as primeiras larvas até os juvenis32,33. No entanto, um dos desafios na piscicultura GF é a escassez de dietas estéreis adequadas, limitando a eficácia do suporte nutricional para sustentar o crescimento e a sobrevivência das larvas. Resolver esse problema é crucial para restaurar a vida dos peixes GF, considerando seus mecanismos de defesa de desenvolvimento e fracas habilidades de digestão devido à ausência de um microbioma intestinal. Em termos de alimentação, o artêmia vivo (Artemia sp.) surge como a dieta mais adequada para larvas de peixes juvenis. Observou-se que peixes alimentados com artêmia viva apresentam maiores taxas de crescimento e sobrevivência em comparação com aqueles alimentados com gema de ovo cozida ou outras iscas naturais e sintéticas34. Embora os modelos de início de vida de peixes GF possam sobreviver com suporte vitelino e os modelos de larvas GF possam ser mantidos com alimentação estéril, gerar modelos de longo prazo de larvas a juvenis e atingir a maturidade sexual continua sendo um desafio. Além disso, alimentos em flocos ou em pó são limitados pela composição nutricional desigual e podem afetar a qualidade da água. Em contraste, a Artemia viva tem vantagens como sobrevivência em água salgada e doce, tamanho pequeno adequado para larvas de adultos, facilidade de dosagem e maior qualidade de eclosão35. Com base em métodos anteriores 16,24,30, simplificamos o complexo processo de tratamento e abordamos o desafio da dieta, estabelecendo Artemia sp. viva GF facilmente incubada como alimento estéril por períodos mais longos do que os peixes GF no início da vida.

Este estudo apresenta um protocolo otimizado que abrange (1) geração, (2) manutenção, (3) identificação da taxa de esterilidade e (4) manutenção e alimentação para garantir o crescimento de peixes-zebra livres de germes (GF) de embriões para larvas e estágios juvenis. Os resultados oferecem evidências preliminares sobre a eclosão, sobrevivência, crescimento e esterilidade do peixe-zebra GF, juntamente com índices essenciais para GF Artemia sp. como alimento estéril. As etapas detalhadas na geração de modelos e preparação de alimentos vivos estéreis fornecem suporte técnico crucial para a construção e aplicação de modelos de peixes GF de longo prazo, bem como GF Artemia sp. na pesquisa de interação microbiota-hospedeiro. O protocolo aborda o isolamento, identificação e infecção bacteriana em modelos de peixes GF, delineando métodos para marcação de fluorescência bacteriana e observando sua colonização no intestino de peixes ao microscópio. Peixes GF, peixes gnotobióticos com infecção bacteriana ou modelos de microbiota humana transferidos serão submetidos a várias detecções para elucidar suas funções e efeitos na imunidade do hospedeiro, digestão, comportamento, regulação transcriptômica e aspectos metabólicos. A longo prazo, este protocolo pode ser estendido a diferentes espécies de peixes selvagens, como o medaka marinho, e potencialmente a outras linhagens de peixe-zebra transgênico selecionadas correlacionadas a tecidos ou doenças específicas.

Protocolo

Os experimentos com peixes foram conduzidos de acordo com as diretrizes do Comitê de Cuidados e Uso de Animais de Chongqing e do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Médica de Chongqing, China, bem como os padrões para animais experimentais emitidos pelo Departamento Estadual de Qualidade e Supervisão Técnica (ID de aprovação: GB14922-2001 a GBT14927-2001). O peixe-zebra (Danio rerio, tipo selvagem, cepa AB) foi obtido no Instituto de Hidrobiologia da Academia Chinesa de Ciências e mantido em laboratório seguindo procedimentos relatados anteriormente36.

1. Manutenção do peixe-zebra adulto e coleta de embriões

NOTA: Com base nas modificações de estudos e relatórios anteriores 16,37,38,39, a manutenção de peixes-zebra adultos, a criação de larvas e as práticas para modelos livres de germes (GF) em nosso laboratório foram realizadas seguindo as etapas descritas abaixo. O sistema de fluxo ultrapuro para piscicultura foi obtido comercialmente (ver Tabela de Materiais). A água, mantida com pH, sal e álcalis equilibrados, passa por filtração durante o ciclo para garantir condições de limpeza.

  1. Manter peixes adultos com o seguinte procedimento padrão no sistema de ciclo automático (ver Tabela de Materiais) com um fotoperíodo de escuridão: luz = 10 h: 14 h a 28 ° C ± 0,5 ° C e alimentado com Artemia sp. duas vezes ao dia.
  2. Coloque o peixe-zebra adulto sexualmente maduro (macho: fêmea = 2:1) em tanques com água fresca e limpa na noite anterior.
  3. Deixe os peixes desovarem na manhã seguinte (aproximadamente 8h30) sob estimulação regular de luz no laboratório. Após 1-2 h, transfira o peixe para outro tanque.
  4. Colete embriões em água do sistema de autociclagem como meio de criação em uma placa de cultura usando uma pipeta Pasteur descartável.

2. Geração de peixe-zebra GF de embriões a larvas

NOTA: O procedimento para gerar peixes livres de germes (GF) é descrito na Figura 1, enquanto os índices básicos de desenvolvimento dos modelos convencionais (CR) e GF são apresentados na Figura Suplementar 1. Siga as etapas descritas abaixo em uma cabine de segurança biológica de bancada ou capela de fluxo laminar usando uma técnica asséptica estéril em uma sala limpa.

  1. Lave os embriões usando a água da piscicultura e remova as fezes, impurezas e ovos mortos ou não fertilizados.
  2. Transferir os embriões a 2 hpf para placas esterilizadas (até 480 embriões por placa estéril com um diâmetro de 10 cm) preenchidas com solução de meio de peixe-zebra antibiótico isento de germes (AB-GZM, ver Tabela de Materiais) e cultura a 28,5 °C durante 6-8 h.
    NOTA: AB-GZM é usado para tratar os embriões por várias horas para eliminar os microrganismos da superfície, e GZM sem antibióticos é usado para cultivar peixes GF em subsequência. Normalmente, o tempo de cultura aperfeiçoado é de 6 h).
  3. Exclua os ovos com manchas brancas ou aparência esbranquiçada e selecione aqueles que são normalmente desenvolvidos, exibindo envelopes transparentes e intactos para processamento posterior.
  4. Enxágue os embriões usando AB-GZM três vezes em 10 minutos.
  5. Mergulhe os embriões em solução de iodopovidona 0,2 g / L (PVP-I) por 1 min (consulte a Tabela de Materiais).
    NOTA: Concentração mais alta e mais de 2 min influenciarão a taxa de morte e eclosão dos embriões.
  6. Lave os embriões usando meio de peixe-zebra livre de germes (GZM) três vezes em 10 minutos.
  7. Adicione embriões à solução de trabalho de hipoclorito de sódio (NaClO), cubra firmemente os tubos de microcentrífuga de 50 mL e alvejante por 15 min. Durante este período, suspenda os embriões em solução de alvejante agitando-os suavemente.
  8. Lave os embriões usando GZM três vezes em 10 minutos.
  9. Transfira os embriões para placas estéreis de 6 poços com 5 embriões e 10 mL de GZM por poço. Cultive-os em uma plataforma ultralimpa ou incubadora com um fotoperíodo de escuridão: luz = 10 h: 14 h a 28 °C ± 0,5 °C. A densidade de cultura influenciará a taxa estéril.
  10. Renove o meio de cultura diariamente removendo o GZM gasto, coletando-o como amostras para detecção do status estéril e reabastecendo cada poço com o mesmo volume de GZM estéril.
  11. Registre os índices básicos de desenvolvimento de embriões/larvas GF, incluindo a taxa de sobrevivência, taxa de eclosão, batimentos cardíacos, comprimento e peso do corpo, etc.19.
  12. Transfira o peixe GF para recipientes adequados (pratos, frascos de cultura de células ou garrafas de vidro com tampa) com volume expandido, fornecendo alimento estéril durante todo o processo de crescimento.

3. Manutenção do peixe-zebra GF de larvas a juvenis

  1. Renove o GZM sem alimentação antes de 7 dpf e detecte diariamente os estados estéreis (consulte a etapa 5).
  2. Alimente larvas de peixe-zebra de 8 dpf até os estágios juvenis com gema de ovo estéril (10 μL de solução estoque preparada por poço) uma vez ao dia antes de mudar o GZM.
  3. Alimente juvenis GF de 14 dpf com gema de ovo esterilizada misturada com GF Artemia sp. uma vez ao dia (1-3 Artemia/larvas, consulte a etapa 4), aumentando gradualmente a massa alimentar com o crescimento e desenvolvimento dos peixes GF.
  4. Forneça gema de ovo até que todos os peixes possam consumir náuplios de Artemia.
    NOTA: GF Artemia deve ser submetida a testes de esterilidade antes do uso. Avalie o número de náuplios de Artemia restantes, observe o progresso da perseguição e captura e examine o corpo do peixe com o alimento consumido para indicar o sucesso da alimentação.
  5. De 28 dpf até os estágios iniciais da idade adulta, alimente a GF Artemia uma vez ao dia (3-5 Artemia/larvas) e limpe a Artemia inexplorada ou morta e os peixes mortos nos resíduos GZM como amostras diárias.
  6. Durante o crescimento dos peixes GF, troque as placas de 6 poços após 7 dpf para placas estéreis ou frascos de cultura de células de 8 para 21 dpf e, em seguida, para frascos estéreis após 21 dpf. Aumente o meio de cultura e a massa alimentar de acordo com o número e peso dos peixes GF em cada recipiente.
  7. Renove o GZM diariamente e verifique as amostras para garantir o sucesso dos modelos GF.
    NOTA: Manter modelos de peixes livres de germes (GF) até o início da idade adulta e maturidade sexual é um desafio, com uma baixa taxa média de sobrevivência de 30 dpf, normalmente inferior a 10%. Isso é atribuído principalmente à imunidade fraca, atraso no desenvolvimento e função intestinal prejudicada.

4. Preparação de náuplios de Artemia GF como alimento estéril para modelos de peixes GF crônicos

NOTA: O método de cultivo e preparação da Artemia livre de germes (GF) é descrito na Figura 2. Observe que todas as etapas a seguir são realizadas em uma cabine de segurança biológica de bancada, usando uma técnica asséptica estéril.

  1. Enxágue 0,25 g de cistos de Artemia usando hipoclorito de sódio 2,4 g / L (NaClO, consulte a Tabela de Materiais) por 5 min.
  2. Filtre os cistos de Artemia enxaguados com um filtro ultradenso esterilizado (cerca de 170 malhas de abertura) e lave com água ultrapura esterilizada três vezes, cada vez por 1-2 min.
  3. Transfira os cistos de Artemia lavados para 100 mL de água salina esterilizada a 2,5%, misture e embale para incubação asséptica de acordo com as etapas mencionadas abaixo.
  4. Embale a solução de mistura de cistos de Artemia tratada com 50 mL em um frasco estéril com um volume de 100 mL, feche-o com filme e incube em uma incubadora agitada a 150 rpm, 30 ° C por 18 h a 24 h com luz.
  5. Extraia aproximadamente 30 mL de náuplios de Artemia para eclosão das camadas média e inferior usando uma pipeta Pasteur descartável.
    NOTA: Evite que ovos flutuantes e cascas vazias atinjam a camada superior. Os índices de cistos de Artemia livres de germes (GF) e náuplios incubados por 24 h são apresentados na Figura 3.
  6. Filtre o Artemia com um filtro esterilizante e lave-o em um copo esterilizante com água ultrapura esterilizante três vezes, cerca de 30 s a 1 min para cada vez. Por fim, adicione 4 mL de água ultrapura esterilizada para preparar a solução mista de Artemia .
  7. Usando uma pipeta Pasteur descartável, recupere Artemia nadando ativamente da camada superior, lave e prepare a solução de náuplios para alimentação e identificação asséptica.

5. Identificação de modelos de peixes GF em todas as fases de vida

NOTA: Ao longo de todo o estágio de vida dos peixes livres de germes (GF), os principais índices e as detecções diárias de amostras são cruciais para garantir o sucesso dos modelos. Esta etapa resume a classificação comum das amostras e os métodos usuais de identificação (Figura 4).

  1. Observe e conte o status de sobrevivência e a taxa de larvas de peixe-zebra GF diariamente. Em experimentos que calculam taxas relacionadas, os peixes GF são cultivados em placas de 24 ou 48 poços com um peixe por poço.
    1. Taxa de sobrevivência = (número de peixes vivos no momento da observação / número total de ovos) × 100%.
    2. Taxa de esterilidade = (número de peixes estéreis/número de peixes sobreviventes) × 100%.
      NOTA: Este protocolo se concentra na taxa estéril de peixes vivos. O número de peixes estéreis é determinado pela contagem de peixes GF bem-sucedidos após várias verificações entre os peixes vivos. Quaisquer modelos de FG de peixes mortos ou peixes vivos que tenham falhado devido à presença bacteriana são eliminados durante os procedimentos subsequentes de GF.
  2. Colete as seguintes amostras de larvas de peixe-zebra GF.
    1. Meio de cultura de peixe-zebra GF de cada alvéolo ou recipiente de garrafa.
    2. Alimentos para peixes, como gema de ovo estéril e GF Artemia.
    3. Meio residual, incluindo fragmentos de membrana do ovo após a eclosão e resíduos alimentares ou fezes durante os períodos de alimentação, desde larvas até juvenis.
    4. Amostras de peixes mortos para identificar a presença de bactérias.
    5. Meio de peixe e agentes utilizados no tratamento de embriões como controlo estéril.
    6. Amostras de materiais, plataforma operacional e incubadora, etc.
  3. Detecte amostras coletadas diariamente usando vários métodos.
    1. Primeiro, use o método da placa de propagação e as placas de cultura em uma incubadora a 30 °C.
      1. Cubra com 20-50 μL de amostra de meio residual na placa de ágar soja tripticase (TSA) (consulte a Tabela de Materiais) em condições aeróbicas.
      2. Cubra com 20-50 μL de amostra de meio residual na placa TSA em condições anaeróbias.
      3. Cubra com 20-50 μL de amostra de meio residual nas placas TSA de sangue (consulte a Tabela de Materiais) em condições aeróbicas.
      4. Revestimento com 20-50 μL de amostra de meio residual nas placas de TSA de sangue em condições anaeróbicas.
    2. Em segundo lugar, use o método de cultura líquida.
      1. Leve 200 μL de amostra para tubos aeróbicos com meio Brain Heart Infusion Broth (BHI) (consulte a Tabela de Materiais) e cultura na incubadora agitada a 30 ° C, 150-180 rpm.
      2. Adicionar 200 μL de amostra em tubos anaeróbios com meio BHI e cultura na incubadora a 30 °C.
      3. Adicione 200 μL de amostra em tubos aeróbicos com meio de caldo de soja tripticase (TSB) e, em seguida, cultive na incubadora agitada a 30 °C, 150-180 rpm.
      4. Adicionar 200 μL de amostra em tubos anaeróbios com meio TSB e cultura na incubadora a 30 °C.
    3. Em terceiro lugar, use técnicas moleculares-ensaio de reação em cadeia da polimerase (PCR) 16s.
      1. Analise a amostra de águas residuais com dois pares de primers 27F e 1492R, bem como 63F e 1387R (Tabela 1).
        NOTA: A mistura principal de PCR foi preparada de acordo com a Tabela 2 usando um kit de DNA polimerase disponível comercialmente (consulte a Tabela de Materiais), e a máquina de PCR foi configurada com o programa especificado na Tabela 3.
      2. Após a conclusão do programa de PCR, examine os produtos por eletroforese em gel de agarose a 1%40 em bandas-alvo de 1465 pb (usando os primers 27F e 1492R) ou 1324 pb (usando os primers 63F e 1387R) para inferir a esterilidade das amostras.
  4. Registre e observe os testes de esterilidade, incluindo cultura em placas e meios de 24 h a 3 dias e 7 dias, durante os quais nenhuma colônia em placas e nenhuma turbidez em líquido indicam a construção bem-sucedida de modelos GF. Observe e registre a placa e o meio em 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 120 h, 144 h e 168 h.

6. Identificação de amostras de Artemia GF antes da alimentação com peixes GF

NOTA: Para detectar as amostras de Artemia GF, que são indispensáveis como alimento vivo antes de se alimentar de peixes GF (Figura 4), siga as etapas abaixo.

  1. Coletar amostras de modelos GF Artemia .
    1. Cistos de Artemia não tratados.
    2. Cistos de Artemia GF tratados.
    3. Náuplios GF Artemia chocados.
    4. Água ultrapura esterilizada como controle.
  2. Detecte a artemia GF com os seguintes métodos.
    1. Use o método da placa de propagação para detectar as amostras revestindo-as em placas TSA e placas TSA de sangue em condições aeróbicas e anaeróbicas. Incube-os a 30 °C.
    2. Use um meio líquido para detectar as amostras em tubos TSB e BHI aeróbicos e anaeróbicos. Cultura em shaker a 150-180 rpm, 30 °C.
    3. Use o ensaio de PCR para detectar a presença de bactérias nas amostras coletadas usando os primers de genes-alvo de RNA ribossômico 16s 27F e 1492R, 63F e 1387R (Tabela 1). O volume e o programa são mostrados na Tabela 2 e na Tabela 3.
  3. Registre os resultados: Detecte o produto de PCR por eletroforese em gel de agarose a 1%40 para bandas-alvo medindo 1465 pb (usando primers 27F e 1492R) ou 1324 bp (usando primers 63F e 1387R). Os resultados das placas e do meio líquido podem garantir o estado estéril da Artemia GF antes de ser usada como alimento para peixes GF.

7. Isolamento e identificação de cepas bacterianas intestinais do peixe-zebra

NOTA: Para explorar as funções intestinais in vitro e in vivo, é necessário isolar cepas bacterianas do peixe-zebra, que também fornecem a fonte da espécie para potenciais probióticos rastreados por infecção usando animais GF (Figura 5). Neste protocolo, descrevemos o método tradicional de dissecção para obter o conteúdo intestinal, enquanto as amostras também podem ser coletadas diretamente de peixes vivos anestesiados (dados não mostrados).

  1. Escolha peixes-zebra adultos saudáveis e lave-os com água estéril. Execute as etapas a seguir na bancada limpa.
  2. Anestesiar o peixe com 100 mg/L MS-222 por 5-10 min.
  3. Use álcool 75% para tratar a superfície corporal do peixe.
  4. Dissecar os intestinos dos peixes e expulsar o conteúdo intestinal com meio TSB ou BHI.
  5. Incube o sobrenadante intestinal aplicando TSA, placa de sangue, TSB e meio BHI em condições aeróbicas e anaeróbicas.
  6. Traduza a bactéria para ganhar a cepa de sinal e registre as características de diferentes colônias.
  7. Armazene as bactérias dentro de 30% de glicerol a -80 °C.
  8. Em seguida, identifique as bactérias intestinais por extração de DNA genômico e sequenciamento de PCR.
    NOTA: As principais etapas da extração de DNA genômico bacteriano incluem centrifugação líquida, dissociação de RNase A e Protease K, extração de álcool etílico, enxágue e dissolução usando kits disponíveis comercialmente seguindo as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).
  9. Analise as sequências 16S usando o National Center for Biotechnology Information (NCBI) e a Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) com o banco de dados Bacteria and Archaea40,41 (ver Tabela de Materiais).
  10. Escolha as bactérias e caracteres mais adequados para identificar as cepas intestinais isoladas no nível do gênero.
  11. Detectar as funções metabólicas de cepas bacterianas usando kits disponíveis comercialmente (ver Tabela de Materiais).

8. Rótulo da gripe, infecção e colonização de bactérias no intestino do peixe-zebra GF

NOTA: Antes de infectar o peixe-zebra GF, as bactérias isoladas foram modificadas com corantes e contadas, tornando visível a colonização e migração microbiana continuamente e in vivo (Figura 6).

  1. Escolha bactérias potencialmente benéficas ou cepas dominantes com alta abundância no hospedeiro para infectar os modelos de peixes GF.
    NOTA: As bactérias utilizadas neste estudo foram Aeromonas sp. e Vibrio sp. (ver Tabela de Materiais), selecionadas dos 8 gêneros que foram isolados e identificados a partir de peixes-zebra adultos do tipo selvagem em laboratório42.
  2. Rotule as bactérias frescas com corantes CM-Dil (consulte a Tabela de Materiais) e exponha-as ao peixe-zebra GF a 5 dpf com uma concentração de 106-10 8 Unidades Formadoras de Colônias (UFCs) / mL.
  3. Observe a fluorescência sob o microscópio fluorescente com ampliação de 3× para indicar a colonização e distribuição de bactérias no intestino de larvas de peixe-zebra GF de 6 dpf e 14 dpf.
  4. Conte manualmente o número de bactérias em peixes GF por cultura em placas em cada ponto de tempo.
  5. Detecte as colônias e sequências para garantir que a infecção tenha sido bem-sucedida com as cepas bacterianas alvo.
  6. Colete amostras de peixes GF com infecção bacteriana para ensaios subsequentes, incluindo neurocomportamento, índices de desenvolvimento, análise histopatológica e medições hormonais, etc. 43,44,45.
    NOTA: As bactérias usadas no experimento de infecção devem ser recém-recuperadas e recém-cultivadas pelo meio líquido.

Resultados

Os modelos de peixe-zebra GF podem ser produzidos de forma eficiente utilizando os ovos abundantes gerados por pares de peixes-zebra, com o protocolo otimizado com base em modelos anteriores de peixes GF35. Uma única placa de 6 poços pode cultivar aproximadamente 30-48 embriões/larvas, permitindo ampla coleta de dados e análise estatística. Após o tratamento estéril, os embriões GF são cultivados em uma incubadora limpa até a eclosão das larvas em 48-72 h, e trocados GZM diariamente com...

Discussão

Etapas críticas dentro dos protocolos de preparação de peixes e alimentos GF
Durante a geração de modelos de peixes GF, várias etapas críticas foram envolvidas, incluindo a preparação de materiais estéreis, esterilização de embriões, renovação diária de GZM, coleta de várias amostras e o exame estéril de cada amostra usando vários métodos. Dentre essas etapas, o tratamento inicial dos embriões é fundamental e decisivo para o sucesso dos modelos GF. Os agentes de controle, suas co...

Divulgações

O protocolo da GF Artemia foi concedido como patente pela Administração Nacional de Propriedade Intelectual da China, o que aliviará o uso restrito do método após obter a permissão dos autores. Os autores declaram que não têm outros interesses concorrentes ou financeiros.

Agradecimentos

Agradecemos sinceramente o apoio do Projeto de Talentos da Universidade Médica de Chongqing (nº R4014 para DSP e R4020 para PPJ), Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (NSFC, nº 32200386 para PPJ), Estúdio de Mentores de Inovação de Pós-Doutorado de Chongqing (X7928 DSP) e Programa do Centro Conjunto China-Sri Lanka para Pesquisa e Demonstração de Tecnologia da Água pela Academia Chinesa de Ciências (CAS)/Centro Conjunto China-Sri Lanka para Educação e Pesquisa pelo CAS.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
AB-GZMAmphotericin:Solarbio;  kanamycin:Solarbio; Ampicillin:Solarbio.Amphotericin:CAS:1397-89-3;
kanamycin:CAS: 25380-94-0; Ampicillin:CAS: 69-52-313.		49.6 mL GZM, 50 µL amphotericin stock solution (250 µg/mL), 25 µL kanamycin stock solution (10 mg/mL), and 250 µL ampicillin stock solution (20 mg/mL).
1.5 mL, 15 mL, 50 mL EP tubesbiosharpBS-15-MTo collect samples, and hold agents
2.4 g/L NaClOXILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.CAS: 7681-52-9Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution.
6-well plates, 24-, 48- well platesLABSELECT 11112To culture fish
AeronomasNCBI databaseNo.MK1784992019-JPP-ESN
Anaerobic TSA platestryptone:Oxoid ;
soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;
agar powder:BioFroxx.		tryptone:LP0042B;
soy peptone:Cat#S9500;
NaCl:BS112;
agar powder:9002-18-0.		The TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, and 6 g agar powder under the anaerobic system.
Anaerobic work stationGENE SCIENCEE200GBacterial isolation, sterile testing
AnalysisGraphPad Prism 5v6.07To analysis the data
API 20 E kits BioMerieux SA, FranceNo.1005915090Ref 20100 Kits to detect bacterial metabolism
Artemia (Brine shrimp)Shangjia Aquarium Co., Ltd.Aquamaster brandArtemia cysts, and brine shrimp eggs 
Auto cycle system for fish cultureNingbo Hairui Technology Co., LtdNo CatMaintain the fish
AutoclaveZeal WayG154DWSPrepare the materials
BHI AerobicCoolaberCat#PM0640BHI medium was prepared, wherein 100 mL medium included 3.7 g BHI powder.
BHI AnaerobicCoolaberCat#PM0640BHI medium was prepared and divided into anaerobic tubes under the anaerobic system.
Biochemical incubatorLongYue Co., LtdSPXFor fish and plates
Biosafety cabinetHaierHR40-IIA2Sterile treatment and testing
Bleaching agent of 0.02 g/L NaClOXILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.CAS: 7681-52-9Working solution with sodium hypochlorite (NaClO) concentration: Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution or 166.6 uL 6% sodium hypochlorite with 500 mL distilled water.
Blood platessheep blood:SolarbioCat. NO. TX0030Sterile-defibrinated sheep blood was added into TSA to prepare 5% blood plates.
Cell culture flaskCorning430639To culture fish
CM-Dil dyesMolecular ProbesCat#C7000  To label the bacteria
Constant temperature shaking incubatorPeiving Co., LtdHZQ-X100Bacterial culture
DatabaseNCBIBacteria and Archaea databaseLink: Archaea FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Archaea/
Bacteria FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Bacteria/
Disposable Pasteur pipettebiosharpbs-xh-03lUsed to change water, and transfer eggs
Disposable petri dishbiosharpBS-90-DTo culture fish
DNA kitsSolaribioCat#D1600Bacterial genomic DNA extraction kits 
Electric pipetteSCILOGEXLevo meChange water
ExiguobacteriumNCBI databaseNo.MK1785042019-JPP-ESN
GZMSea salt:LANDEBAO Co., Ltd.No CatComposed of 1 L of water and 1.5 mL of sea salt solution (40 g/L), autoclaved. The content of sea salt in the GZM solution was 60 mg/L.
Laboratory pure water systemHitech Co., LtdPrima-S15Prepare the agents
MicroscopeNikonSMZ18With fluorescent light to observe fish larvae
PCR kitsTIANGENCat#ET101Taq DNA Polymerase kit
PipetteLABSELECT sp-013-10Change water
Povidone iodine (PVP-I)AladdinLot#H1217005Aqueous solution povidone iodine 0.4 g/L pure water.
Timing converterPinYi Co., LtdAL-06To regulate the light
TSA platestryptone:Oxoid ;
soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;
agar powder:BioFroxx.		tryptone:LP0042B;
soy peptone:Cat#S9500;
NaCl:BS112;
agar powder:9002-18-0.		TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, 6 g agar powder.
TSB Aerobictryptone:Oxoid ;
soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;		tryptone:LP0042B;
soy peptone:Cat#S9500;
NaCl:BS112;		TSB medium was prepared, wherein 400 mL medium included 6 g tryptone, 2 g soy peptone, and 2 g NaCl.
TSB Anaerobictryptone:Oxoid ;
soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;		tryptone:LP0042B;
soy peptone:Cat#S9500;
NaCl:BS112;		TSB medium was prepared and divided into the anaerobic tubes under the anaerobic system.
Ultra-clean workbenchAirtechSW-CJ-2FDSterile treatment and testing
Ultra-pure flow system for fish cultureMarine Biological Equipment companyNo CatProduce water for fish
VibrioNCBI databaseNo.MK1785012019-JPP-ESN

Referências

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