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Neste Artigo

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Resumo

A geração de ânion superóxido é essencial para a estimulação das plaquetas e, se desregulada, crítica para doenças trombóticas. Aqui, apresentamos três protocolos para a detecção seletiva de ânions superóxido e o estudo da regulação plaquetária dependente de redox.

Resumo

As espécies reativas de oxigênio (ROS) são moléculas contendo oxigênio altamente instáveis. Sua instabilidade química os torna extremamente reativos e lhes dá a capacidade de reagir com moléculas biológicas importantes, como proteínas, ácidos nucléicos e lipídios. Os ânions superóxido são importantes ROS gerados pela redução da redução molecular de oxigênio (ou seja, aquisição de um elétron). Apesar de sua implicação inicial exclusivamente no envelhecimento, processos degenerativos e patogênicos, sua participação em importantes respostas fisiológicas tornou-se recentemente aparente. No sistema vascular, os ânions superóxido demonstraram modular a diferenciação e a função das células musculares lisas vasculares, a proliferação e migração de células endoteliais vasculares na angiogênese, a resposta imune e a ativação de plaquetas na hemostasia. O papel dos ânions superóxido é particularmente importante na desregulação das plaquetas e nas complicações cardiovasculares associadas a uma infinidade de condições, incluindo câncer, infecção, inflamação, diabetes e obesidade. Tornou-se, portanto, extremamente relevante na pesquisa cardiovascular ser capaz de medir efetivamente a geração de ânions superóxido pelas plaquetas humanas, entender os mecanismos dependentes de redox que regulam o equilíbrio entre hemostasia e trombose e, eventualmente, identificar novas ferramentas farmacológicas para a modulação das respostas plaquetárias levando à trombose e complicações cardiovasculares. Este estudo apresenta três protocolos experimentais adotados com sucesso para a detecção de ânions superóxido em plaquetas e o estudo dos mecanismos dependentes de redox que regulam a hemostasia e a trombose: 1) detecção de ânion superóxido à base de dihidroetídio (DHE) por citometria de fluxo; 2) visualização e análise de ânions superóxido baseados em DHE por imagem plaquetária única; e 3) quantificação baseada em sonda de spin da saída de ânions superóxido em plaquetas por ressonância paramagnética eletrônica (EPR).

Introdução

O ânion superóxido (O2•-) é o ROS mais funcionalmente relevante gerado nas plaquetas1. O2•- é o produto da redução do oxigênio molecular e o precursor de muitas ROS 2 diferentes. A dismutação de O2•- leva à geração de peróxido de hidrogênio (H2O2) por meio de reações espontâneas em solução aquosa ou reações catalisadas por superóxido dismutases (SODs3). Embora diferentes fontes enzimáticas tenham sido sugeridas (por exemplo, xantina oxidase4, lipoxigenase5, ciclooxigenase6 e óxido nítrico sintase7), a respiração mitocondrial 8,9 e as nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato-oxidases (NOXs) 10 são as fontes mais proeminentes de ânion superóxido em células eucarióticas. Este também parece ser o caso das plaquetas, onde o vazamento de elétrons da respiração mitocondrial11,12 e a atividade enzimática dos NOXs13,14 foram descritos como os principais contribuintes para a produção de ânions superóxido.

Embora vários estudos tenham se concentrado na regulação de plaquetas por O2•-, não há consenso sobre os mecanismos moleculares responsáveis. A modulação da atividade do receptor de superfície via oxidação direta e formação de ligações dissulfeto tem sido proposta para diferentes receptores plaquetários. A regulação positiva da integrina αIIbβ3 por ROS via oxidação direta de resíduos de cisteína tem sido sugerida 15,16,17. Da mesma forma, como as respostas plaquetárias ao colágeno dependem da dimerização dependente de dissulfeto e consequente dimerização da glicoproteína VI (GPVI)18, a potencialização da atividade do receptor por oxidação dependente de ROS tem sidoproposta19, embora não totalmente comprovada experimentalmente. Finalmente, a oxidação induzida por ROS dos grupos sulfidrila da glicoproteína Ib (GPIb) demonstrou promover a adesão plaquetária e a interação plaqueta-leucocitária durante a inflamação20. Por outro lado, como possível consequência da diminuição da oxidação do grupo sulfidrila e da ativação do receptor, a eliminação do ectodomínio de GPVI e GPIb é diminuída pela redução das condições21.

Modos de ação independentes de uma oxidação direta dos receptores da superfície plaquetária também foram propostos. As ROS, incluindo O2•-, demonstraram modular positivamente o receptor de colágeno GPVI, atenuando a atividade da proteína tirosina fosfatase 2 contendo a região de homologia Src 2 (SHP-2), que regula negativamente a cascata de sinalização desse receptor22. Além disso, oO-2•- pode gerar ONOO- (peroxinitrito) por reação rápida com óxido nítrico (NO), que normalmente inibe as plaquetas por meio da guanilil ciclase sensível ao NO (NO-GC) e da geração do regulador plaquetário negativo GMP cíclico (GMPc)23,24. A diminuição resultante nos níveis de NO pode levar à potenciação plaquetária. Alternativamente, sugere-se que a geração deO2•- por NOX2 contribua para a peroxidação lipídica e a formação de isoprostano, que é essencial para a ativação e adesão plaquetária25. Finalmente, a proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK) quinase regulada por sinal extracelular 5 (ERK5), uma proteína quinase proposta como um sensor de estresse redox em plaquetas26, é ativada por O2•- e induz um fenótipo pró-coagulante nas plaquetas (conforme estimado pela medição baseada em citometria de fluxo da externalização da fosfatidilserina)27.

A desregulação deO2•- e outras gerações de ROS nas plaquetas tem sido associada à resposta hemostática exagerada, levando a complicações cardiovasculares trombóticas associadas à aterosclerose, diabetes mellitus, hipertensão, obesidade e câncer28,29. Nesses cenários patológicos, a saída de EROs pelas plaquetas é aumentada, o que leva a uma potencialização de suas respostas adesivas e agregatórias. Além do efeito sobre as respostas plaquetárias, a produção de radicais livres de plaquetas pode ter consequências em outras células sanguíneas e estruturas vasculares, que é uma área pouco compreendida e pouco investigada da saúde cardiovascular30. Apesar de nossa compreensão limitada dos mecanismos moleculares que ligam o estresse oxidativo às condições trombóticas, a relevância clínica dos antioxidantes para a proteção contra doenças cardiovasculares tem recebido atenção considerável. Os níveis plasmáticos de antioxidantes demonstraram estar inversamente correlacionados com o risco de desenvolver doenças cardiovasculares, e o consumo de antioxidantes na dieta demonstrou proteger contra a doença arterial coronariana31,32. Consequentemente, o uso de antioxidantes dietéticos tem sido defendido como uma abordagem promissora para a prevenção de doenças cardiovasculares 33,34,35. Dentre os efeitos da geração de EROs nas plaquetas, o aumento da apoptose pode ter importantes efeitos fisiopatológicos 36,37. No geral, protocolos confiáveis para detectar e quantificar a saída deO2•- pelas plaquetas são cada vez mais relevantes na pesquisa cardiovascular.

Atualmente, as técnicas disponíveis para a detecção de ROS têm limitações importantes de especificidade (ou seja, a natureza química das moléculas oxidantes detectadas é desconhecida) e confiabilidade (ou seja, a interação indesejada com moléculas biológicas e reagentes experimentais leva a resultados não fisiológicos tendenciosos) 38 , 39 . A abordagem mais comumente utilizada para a detecção de ERO em plaquetas baseia-se no uso do diacetato de diclorodihidrofluoresceína (DCFDA), que é convertido em diclorodihidrofluoresceína (DCFH) por esterases intracelulares e, consequentemente, em diclorofluoresceína altamente fluorescente (DCF) por oxidantes celulares, incluindo radicais hidroxila e intermediários peroxidase-H2O2 40,41. Apesar de seu amplo uso, sérias questões têm sido levantadas quanto à confiabilidade dessa abordagem para a medição de ROS intracelulares38. A oxidação de DCFH em DCF pode ser, de fato, induzida por íons de metais de transição (por exemplo, Fe2+) ou enzimas contendo heme (por exemplo, citocromos) em vez de ROS42. Além disso, o DCFDA é convertido por peroxidases celulares em sua forma de radical livre semiquinona (DCF • -), que por sua vez é oxidada em DCF por reação com oxigênio molecular (O2) com a liberação de O2 • -, o que leva à amplificação artificial das respostas oxidativas41 , 43 , 44. Portanto, a detecção de ROS intracelulares por DCFDA é útil para obter insights iniciais, mas requer consideração cautelosa e controles experimentais extensivos38,39.

Este estudo apresenta três técnicas alternativas para a detecção e medição do regulador chave da função plaquetária O2•-1. A primeira técnica é a detecção usando DHE e citometria de fluxo, que oferece vantagens de confiabilidade e especificidade sobre o DCFDA. A segunda técnica proposta aqui também utiliza DHE, mas o método de detecção é a imagem de fluorescência plaquetária viva, que permite o estudo da geraçãode O2•- na sinalização plaquetária com cinética rápida e resolução de célula única. Finalmente, um protocolo baseado no uso da sonda de spin de hidroxilamina 1-hidroxi-3-metoxicarbonil-2,2,5,5-tetrametilpirrolidina (CMH) em experimentos de ressonância EPR oferece a possibilidade de quantificar a taxa de geração deO2•- por plaquetas e compará-la em diferentes condições.

Protocolo

A coleta de sangue periférico de voluntários consentidos é aprovada pelo Comitê de Ética local e pela Autoridade Nacional de Pesquisa em Saúde do Serviço de Saúde (referência REC: 21/SC/0215; ID IRAS: 283854).

1. Método 1: Deteção de aniões superóxidos utilizando DHE por citometria de fluxo

  1. Pré-aqueça (37 °C) a solução de citrato de sódio (4% p/v) e use-a como anticoagulante, adicionando-a diretamente ao sangue no momento da punção venosa na proporção de 1:7 (0,5% p/v final).
  2. Colete sangue humano periférico de voluntários saudáveis por punção venosa da veia cubital mediana.
  3. Obtenha plasma rico em plaquetas (PRP) do sangue total por uma etapa inicial de centrifugação a 200 x g por 20 min.
  4. Centrifugue o PRP a 500 x g por 10 min com os inibidores plaquetários reversíveis indometacina (10 μM) e PGE1 (40 ng/mL).
  5. Ressuspenda o pellet de plaquetas resultante em tampão de Tyrode modificado (145 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 10 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetano sulfônico (HEPES), 1 mM MgCl2, 5 mM de glicose, pH 7,3) (37 °C) a uma densidade de 2 x 108 plaquetas/mL.
  6. Após o isolamento, descanse as plaquetas por 30 min a 37 °C.
  7. Preparar o DHE em dimetilsulfóxido (DMSO) a uma concentração de reserva de 5 mM.
  8. Adicione DHE à suspensão plaquetária na concentração final de 5 μM (dilua a solução estoque de 1 a 1.000, com concentração final de DMSO de 0,1% v / v) e incube por 15 min a 37 ° C.
  9. Trate as plaquetas com agentes farmacológicos e/ou sequestrantes de ROS por 15 minutos antes da estimulação com os estímulos e concentrações fisiológicas desejados (por exemplo,., 0,1 unidade/mL de trombina ou 3 μg/mL de colágeno).
  10. Após a estimulação, dilua as suspensões plaquetárias de 1 a 10 em tampão HEPES modificado gelado.
  11. Para a citometria de fluxo, defina o espalhamento lateral (SSC) e o espalhamento direto (FSC) ganhem a 40 mV e 220 mV, respectivamente, e usem gráficos de dispersão em escala logarítmica para visualizar a população de partículas na suspensão (exemplo na Figura 1A).
  12. (OPCIONAL) Imunocorar uma alíquota de suspensão plaquetária usando um anticorpo anti-CD41 para identificar a população de eventos correspondentes às plaquetas (exemplo na Figura 1B).
  13. Analisar as amostras por citometria de fluxo utilizando excitação a 405 nm (laser violeta) e emissão a 580 nm de comprimento de onda, que detecta selectivamente o produto 2-hidroxietídio (2OH-Et+) específico do anião superóxido (figura 2).
    NOTA: A fixação com paraformaldeído e o armazenamento de amostras a longo prazo não são aconselháveis.

2. Método 2: Detecção de ânion superóxido usando DHE por imagem de fluorescência plaquetária única

  1. Cubra uma lâmina de μ de 8 poços no dia do experimento com 0,1 mg / mL de colágeno fibrilar I de tendões equinos (colágeno Horm), 0,2 mg / mL de fibrinogênio ou 1 mg / mL de poli-L-lisina (PLL) em tampão de Tyrode modificado por 2 h a 37 ° C.
  2. Lave duas vezes com tampão de Tyrode modificado (10 min cada).
  3. Extinguir a adesão não específica por incubação em tampão de Tyrode modificado mais 5 mg/ml de albumina sérica bovina (BSA) durante um mínimo de 30 min (ou até à experiência).
  4. Pré-aqueça (37 °C) a solução de citrato de sódio (4% p/v) e use-a como anticoagulante, adicionando-a diretamente ao sangue no momento da punção venosa na proporção de 1:7 (0,5% p/v final).
  5. Colete sangue humano periférico de voluntários saudáveis por punção venosa da veia cubital mediana.
  6. Obtenha plasma rico em plaquetas (PRP) do sangue total por uma etapa inicial de centrifugação a 200 x g por 20 min.
  7. Centrifugue o PRP a 500 x g por 10 min com os inibidores plaquetários reversíveis indometacina (10 μM) e PGE1 (40 ng/mL).
  8. Ressuspenda o pellet de plaquetas resultante no tampão de Tyrode modificado (145 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM de glicose, pH 7,3) (37 ° C) a uma densidade de 4 x 107 plaquetas / mL.
  9. Após o isolamento, descanse as plaquetas por 30 min a 37 °C.
  10. Preparar DHE em dimetilsulfóxido (DMSO) a uma concentração de reserva de 10 mM.
  11. Adicione DHE na concentração final de 10 μM à suspensão plaquetária (dilua a solução estoque de 1 a 1.000, com concentração final de DMSO de 0,1% v / v) e incube por 1 min (37 ° C).
  12. Após o 1 min de incubação com DHE, remova a solução de bloqueio dos poços escolhidos, posicione a lâmina de μ no estágio do microscópio pronta para a imagem e dispense suavemente as plaquetas.
  13. Monitore a conversão de DHE para 2OH-Et+ por imagem confocal invertida por 10 min (405/580 nm ex/em), com imagens coletadas a cada 10 s com uma lente de imersão em óleo de 40x.
  14. (OPCIONAL) Para poços revestidos com PLL, monitore a geração de ânions superóxido em resposta a um agonista solúvel (por exemplo, 0,1 unidade/mL de trombina ou 3 μg/mL de colágeno) adicionando o agonista 10 minutos após a distribuição de plaquetas e coleta de imagens de fluorescência por mais 10 minutos, conforme descrito na etapa 2.13.
  15. (OPCIONAL) Se necessário, adicionar sequestrantes de aniões superóxido ou inibidores seletivos (por exemplo, inibidores de NOX) dispensando suavemente para o lado do poço durante o decurso do tempo e recolher imagens de fluorescência conforme descrito em 2.13 durante mais 10 min.
  16. Quantifique a análise de fluorescência de célula única selecionando a Região de Interesse (ROI) contendo plaquetas únicas representativas e analisando a intensidade de fluorescência em diferentes quadros com a ferramenta Medir do conjunto de imagens ImageJ 1.53t.

3. Método 3: Detecção de ânion superóxido por plaquetas usando ressonância paramagnética eletrônica (EPR)

  1. Pré-aqueça (37 °C) a solução de citrato de sódio (4% p/v) e use-a como anticoagulante, adicionando-a diretamente ao sangue no momento da punção venosa na proporção de 1:7 (0,5% p/v final).
  2. Colete sangue humano periférico de voluntários saudáveis por punção venosa da veia cubital mediana.
  3. Obtenha plasma rico em plaquetas (PRP) do sangue total por uma etapa inicial de centrifugação a 200 x g por 20 min.
  4. Centrifugue o PRP a 500 x g por 10 min com os inibidores plaquetários reversíveis indometacina (10 μM) e PGE1 (40 ng/mL).
  5. Ressuspenda o pellet de plaquetas resultante no tampão de Tyrode modificado (145 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM de glicose, pH 7,3) (37 ° C) a uma densidade de 2 x 108 plaquetas / mL.
  6. Após o isolamento, descanse as plaquetas por 30 min a 37 °C.
  7. Adicione 5 μM de dietilditiocarbamato (DETC) e 25 μM de desferroxamina à suspensão plaquetária.
  8. Sem incubação, adicionar 200 μM de 1-hidroxi-3-metoxicarbonil-2,2,5,5-tetrametilpirrolidina (CMH).
  9. Carregue as amostras no aggregômetro dentro de cubetas de agregação (incluindo ímãs de agitação revestidos de Teflon).
  10. Após 1 min, adicione os estímulos na concentração desejada (por exemplo, 1 unidade/mL de trombina ou 3 μg/mL de colágeno). Incubar por 10 min.
  11. (OPCIONAL) Obtenha a geração de ânions superóxido em diferentes pontos de tempo, prosseguindo para a etapa 3.12 no momento desejado.
  12. Transfira a suspensão plaquetária da cubeta de agregação para um tubo de microcentrífuga e gire rapidamente a 6.000 x g por 10 s.
  13. Carregue 50 μL do sobrenadante em micropipetas capilares e sele com cera de vedação EPR.
  14. Transfira as amostras para o scanner EPR.
  15. Defina o scanner EPR da seguinte forma: campo central 3.492,5 G, varredura de campo 60 G, amplitude de modulação 2 G, tempo de varredura 10 s, número de varreduras 10, frequência de micro-ondas 9,39 GHz, potência de micro-ondas 20 mW, tempo de conversão 327,68 ms, constante de tempo 5242,88 ms.
  16. Estime a oxidação de CMH em CM● como a área sob a curva (AUC) dos picos de EPR registrados usando os parâmetros acima.
  17. Construa uma curva de calibração traçando a intensidade de EPR medida conforme descrito na etapa 3.16 no eixo y e as concentrações do CM● comercialmente disponível no eixo x (por exemplo, 0, 0,3, 1, 3, 10 e 30 μM).
  18. A partir da concentração de CM● nas amostras, obter a quantidade de ânion superóxido gerada pelas plaquetas nas amostras usando as fórmulas descritas na seção Resultados Representativos.

Resultados

Para detecção de fluorescência DHE por citometria de fluxo, mostramos resultados representativos para plaquetas em repouso (Figura 3A) ou estimuladas com 0,1 unidade/mL de trombina (Figura 3B). A saída de O2•- foi quantificada como intensidade média de fluorescência plaquetária (MFI), conforme mostrado para estimulação com 0,1 unidade/mL de trombina (Figura 3C

Discussão

Neste manuscrito, apresentamos três técnicas diferentes com o potencial de avançar na capacidade de investigar a regulação dependente de redox da função plaquetária por meio da detecção seletiva de O2•-. Os dois primeiros métodos são uma melhoria nas técnicas existentes devido à sonda redox utilizada (DHE em vez do DCFDA mais comum, mas menos confiável). Essas técnicas são, portanto, facilmente acessíveis e a maioria dos laboratórios ...

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pela British Heart Foundation (PG / 15/40/31522), Alzheimer Research UK (ARUK-PG2017A-3) e European Research Council (# 10102507) para G. Pula.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH)Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-02.1-50mgReagent for EPR (spin probe)
BD FACSAria IIIBD Biosciences NAFlow cytometer
Bovine Serum AlbuminMerck/SigmaA7030For μ-slide coating
Bruker E-scan M (Noxyscan)Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH NOX-E.11-BES EPR spectrometer
Catalase–polyethylene glycol (PEG-Cat.)Merck/SigmaC4963Hydrogen peroxide scavenger (specificity control)
ChronoLog Model 490+4Labmedics/ChronologNAAggregometer
CM radicalNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-20.1-100mg Reagent for EPR (calibration control)
deferoxamine Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-09.1-100mg Reagent for EPR
diethyldithiocarbamate (DETC) Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-10.1-1g Reagent for EPR
DihydroethidiumThermo Fisher ScientificsD11347Superoxide anion probe
Dimethyl sulfoxideMerck/Sigma34869For stock solution preparation 
EPR sealing wax platesNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-A.3-VPMConsumable for EPR
EPR-grade waterNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-07.7.1-0.5L Reagent for EPR
Fibrinogen from human plasmaMerck/SigmaF4883For μ-slide coating
FITC anti-human CD41 AntibodyBioLegend303704Platelet-specific staining for flow cytometry
Glass cuvettes Labmedics/ChronologP/N 312Consumable for incubation in aggregometer
Horm CollagenLabmedics/ChronologP/N 385For platelet stimulation
ImageJ National Institutes of Health (NIH)NAImageJ 1.53t (Wayne Rasband)
IndomethacinMerck/SigmaI7378For platelet isolation
Micropipettes DURAN 50µlNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-G.6.1-50µLConsumable for EPR
Poly-L-lysine hydrochlorideMerck/SigmaP2658For μ-slide coating
Prostaglandin E1 (PGE1)Merck/SigmaP5515For platelet isolation
Sodium citrate (4% w/v solution)Merck/SigmaS5770For platelet isolation
Stirring bars (Teflon-coated)Labmedics/ChronologP/N 313Consumable for incubation in aggregometer
Superoxide dismutase–polyethylene glycol (PEG-SOD)Merck/SigmaS9549Superoxide anion scavenger (specificity control)
Thrombin from human plasmaMerck/SigmaT6884For platelet stimulation and μ-slide coating
VAS2870Enzo Life ScienceBML-EI395NOX inhibitor
Zeiss 510 LSM confocal microscopeZeissNAConfocal microscope

Referências

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