Um modelo pré-clínico de miopatia induzida por sepse com desuso em camundongos

Resumo

Este modelo murino combina um insulto séptico com o desuso do músculo dos membros posteriores para recapitular a característica acamada do paciente séptico típico. O modelo representa um afastamento significativo dos modelos anteriores para estudar a disfunção muscular na sepse e é uma abordagem reprodutível para abordar estratégias terapêuticas para tratar essa condição.

Resumo

A sepse é uma das principais causas de mortes intra-hospitalares. Melhorias no tratamento resultam em um maior número de sobreviventes de sepse. Aproximadamente 75% dos sobreviventes desenvolvem fraqueza e atrofia muscular, aumentando a incidência de reinternações hospitalares e mortalidade. No entanto, os modelos pré-clínicos disponíveis de sepse não abordam o desuso do músculo esquelético, um componente chave para o desenvolvimento da miopatia induzida por sepse. Nosso objetivo neste protocolo é fornecer uma diretriz passo a passo para um modelo de camundongo que reproduza o cenário clínico experimentado por um paciente séptico acamado. Camundongos C57Bl/6 machos foram usados para desenvolver este modelo. Os camundongos foram submetidos à ligadura e punção cecal (CLP) para induzir a sepse. Quatro dias após o CLP, os camundongos foram submetidos à suspensão dos membros posteriores (HLS) por sete dias. Os resultados foram comparados com cirurgias simuladas e/ou animais com deambulação normal (NA). Os músculos foram dissecados para avaliação in vitro da mecânica muscular e morfológica. O modelo resulta em atrofia e fraqueza muscular acentuadas, um fenótipo semelhante observado em pacientes sépticos. O modelo representa uma plataforma para testar possíveis estratégias terapêuticas para a mitigação da miopatia induzida por sepse.

Introdução

A sepse é uma condição com risco de vida devido a uma resposta imune hiperativa que afeta adversamente vários sistemas de órgãos, resultando em um grande fardo para os sistemas de saúde em todo o mundo¹. Mais recentemente, a mortalidade intra-hospitalar ligada à sepse diminuiu devido ao melhor gerenciamento da unidade de cuidados de intensidade (UTI) ^1,2. No entanto, aproximadamente 75% dos pacientes que sobrevivem ao insulto séptico inicial desenvolvem atrofia do músculo esquelético (por exemplo, reduções na área de secção transversal) e fraqueza (por exemplo, reduções na capacidade de produção de força)^3,4. Esse fenômeno tem sido caracterizado como miopatia induzida por sepse, altamente ligada à atividade física prejudicada e à falta de independência para realizar tarefas de vida diária, levando à reinternação e mortalidade em até cinco anos após o episódio inicial⁵.

Devido a uma infecção agressiva e generalizada, os pacientes sépticos são expostos a períodos prolongados de repouso no leito enquanto se recuperam na UTI. Nesse contexto, o músculo esquelético sofre desuso grave, o que provavelmente exacerba a atrofia e a fraqueza muscular ^3,4. Atualmente, nenhum tratamento abordou efetivamente a miopatia induzida por sepse. Os modelos pré-clínicos disponíveis projetados para tratar a miopatia usaram ligadura e punção cecal (CLP)⁶, pasta cecal⁷ ou injeção de lipopolissacarídeo purificado (LPS), que é um componente da parede celular em bactérias gram-negativas⁸. Embora esses modelos consigam transmitir a infecção, eles não reproduzem adequadamente o desuso muscular observado em hospedeiros sépticos além de uma redução natural na atividade física observada em animais sépticos⁹.

O principal objetivo deste estudo é fornecer uma descrição detalhada de como executar adequadamente o modelo de miopatia induzida por sepse com desuso em camundongos. Demonstramos a viabilidade de combinar CLP como modelo de sepse com suspensão de membros posteriores (HLS) como modelo de desuso para estudar a miopatia induzida por sepse em camundongos³. Além disso, resultados representativos da mecânica muscular e mudanças morfológicas típicas em resposta ao modelo também são fornecidos.

Protocolo

Os procedimentos foram revisados e aprovados pela Universidade da Flórida IACUC (# 202200000227). Camundongos C57BL/6J machos, com 17 semanas de idade, com massa corporal variando de 27 g a 34 g, foram utilizados para o presente estudo. Os procedimentos experimentais e o cronograma descritos neste protocolo são representados na Figura 1. Conforme indicado, o protocolo abrange um total de 11 dias. Os animais são submetidos a cirurgia de sobrevivência (CLP/Sham) no Dia 0, seguida de quatro dias de suporte de fluidos e analgésicos. No dia 4, os animais iniciam HLS por um período de 7 dias. Experimentos terminais são realizados no dia 11. Os detalhes dos reagentes e do equipamento utilizado estão listados na Tabela de Materiais.

1. Ligadura e punção cecal (CLP)

1. Depois de obter os animais da fonte comercial, deixe-os aclimatar no biotério por pelo menos 1 semana antes de realizar cirurgias CLP (ou simuladas). Isso ajudará a minimizar o estresse associado ao transporte.
2. Agrupar os ratos, aderindo às diretrizes locais da IACUC.
   NOTA: Como orientação geral, os animais são alojados em no máximo 5 camundongos por gaiola até o dia da cirurgia. Gaiolas padrão, medindo 7,25 polegadas de largura, 11,75 polegadas de comprimento e 5 polegadas de altura, são utilizadas e mobiliadas com cama de espiga de milho. Um ciclo claro-escuro de 12h: 12h é mantido, com luzes acesas às 7h e apagadas às 19h. A temperatura da carcaça é mantida em 20-22 °C e a umidade relativa (UR) é mantida entre 30% e 60%. O acesso ad libitum à dieta padrão de ração e água é garantido.
3. Para a realização da FLP, anestesiar o animal com isoflurano (2,5%, 500 mL/min) em câmara de indução. Confirme a anestesia beliscando a pata com uma pinça. Uma vez em anestesia profunda, confirmada pela ausência de retirada reflexa do pinçamento da pata, transferir o animal para anestesia continuada usando um cone nasal (2,5%, 100-125 mL/min).
   NOTA: Técnicas assépticas devem ser empregadas durante todo o procedimento.
4. Aplique pomada lubrificante ocular veterinária para proteger os olhos do animal de possíveis danos ou lesões induzidas pelo nariz durante a cirurgia.
5. Para limpar o local da cirurgia, use removedor de cabelo disponível comercialmente. Remova o pelo apenas da parte inferior do abdômen, evitando a superexposição da pele.
   NOTA: Como alternativa, podem ser usados cortadores de pêlos de animais, mas deve-se tomar cuidado para evitar danos à pele.
6. Uma vez exposto o local da cirurgia, limpe a área com três aplicações de iodopovidona (ou um esfoliante germicida equivalente), seguido de um enxágue com álcool 70% entre cada aplicação.
7. Administre uma dose única de 3,25 mg/kg de buprenorfina de liberação sustentada ou equivalente, de acordo com o tratamento analgésico aprovado pelo IACUC local.
8. Transfira o mouse para a área cirúrgica. Isole o local da cirurgia usando um campo adesivo. Sob anestesia profunda, faça uma incisão na linha média ventral (~ 2 cm) na pele usando uma lâmina de bisturi.
   1. Use uma tesoura para separar a pele da camada muscular. Usando a lâmina do bisturi, faça uma incisão menor (~1 cm) na camada muscular. Uma vez visualizados os intestinos, usando uma pinça romba, localize o ceco e exteriorize-o.
9. Uma vez exteriorizado, ligue o ceco usando uma sutura absorvível de poliglactina 5-0 estéril. Considere a área do ceco ligado, definida como a distância da extremidade distal do ceco ao ponto de ligadura, pois contribuirá para a gravidade da infecção. Para reproduzir os resultados aqui apresentados, amarre o ceco a 1 cm de seu ponto distal.
   NOTA: A ligadura de uma área maior do ceco resultará em aumento da gravidade¹⁰.
10. Usando uma agulha 27 G, perfure o ceco completamente, permitindo que o conteúdo fecal vaze. Com cuidado, aperte suavemente o ceco para exteriorizar o conteúdo fecal. Para realizar a cirurgia simulada, siga os mesmos passos expondo o ceco animal. No entanto, não ligue nem perfure o ceco.
    NOTA: O calibre da agulha afeta diretamente a gravidade da infecção. Para produzir uma infecção de baixo grau, recomenda-se agulhas de 26 G a 28 G. Observe que o uso de calibres de agulha mais grossos resultará em um aumento da taxa de mortalidade e os animais podem não tolerar a fase subsequente de suspensão dos membros posteriores do protocolo.
11. Reposicione o ceco na cavidade abdominal. Feche a camada muscular com uma sutura absorvível 5-0 estéril. Feche a pele com uma sutura de nylon 5-0, não absorvível. Após a conclusão da sutura da pele, forneça solução salina estéril (1 mL para machos e 0,5 mL para fêmeas) por meio de injeção subcutânea nas costas do animal.
    NOTA: Para o fechamento da camada muscular, recomenda-se uma técnica de sutura contínua, enquanto que para a camada de pele, recomenda-se uma técnica de sutura interrompida. Consulte e esteja em conformidade com as diretrizes locais da IACUC para sutura em cirurgia de sobrevivência.
12. Após a cirurgia, alojar os animais em uma gaiola limpa em cima de um colchão de aquecimento ou uma almofada de aquecimento ajustada a 35 °C. Observe o camundongo a cada 15 minutos durante a hora inicial após a recuperação da anestesia, após o que ele pode ser devolvido ao alojamento.
    NOTA: Forneça uma quantidade mínima de ração no chão da gaiola para permitir que os animais se alimentem ad libitum sem afetar o local da cirurgia. Após o retorno às instalações, os animais são verificados duas vezes ao dia após a avaliação séptica dos animais (etapa 3).
13. Forneça solução salina estéril e suporte analgésico nos quatro dias seguintes para permitir que a incisão cirúrgica cicatrize.
    NOTA: O monitoramento diário da temperatura da superfície xifóide e do peso corporal ajuda a manter registros precisos da gravidade da sepse¹¹.

2. Suspensão dos membros posteriores (HLS)

1. Para realizar o HLS, os investigadores devem seguir as diretrizes éticas locais da IACUC. Isso inclui garantir o uso de dimensões e pisos apropriados da gaiola, que são aspectos cruciais para acomodar os hábitos de locomoção, alimentação e bebida dos animais em condições HLS.
   NOTA: 4 dias de recuperação após o CLP são recomendados para a cicatrização de feridas.
2. Após 4 dias de recuperação da FLP ou cirurgia simulada, anestesiar o animal sob fluxo leve de isoflurano (2,5%, 100-125 mL/min). Prenda a cauda do rato a uma corrente de metal curta usando fita de espuma. Coloque a corrente de metal paralela à cauda enquanto a fita de espuma abraça firmemente a cauda e a corrente.
3. Para garantir a suspensão dos membros posteriores, prenda a corrente de metal a um gancho conectado a uma barra transversal ao longo do centro da gaiola. Além disso, afixe uma segunda barra pequena que pode se mover ao longo da barra transversal para permitir maior capacidade de movimento para o animal.
   NOTA: Os animais devem ser capazes de se mover através de seus membros anteriores, utilizando a grade de metal no chão da gaiola.
4. Ajuste a altura dos membros suspensos para evitar o contato das patas com os pellets de ração. Monitore os animais e limpe a área depilada ao redor da pele suturada manualmente com um cotonete embebido em água pelo menos duas vezes ao dia durante o período de suspensão.
   NOTA: A limpeza é crucial para evitar infecções no local da cirurgia, especialmente por queimaduras na urina devido à posição elevada do corpo.
5. Para reproduzir os resultados, certifique-se de que os animais sejam submetidos a 7 dias de suspensão dos membros posteriores. A duração foi determinada com base em estudos anteriores de curso de tempo mostrando o tempo mínimo necessário para a suspensão dos membros posteriores para provocar efeitos significativos nos músculos esqueléticos em condições não sépticas^12,13.
   NOTA: A sobrevivência, desconforto ou angústia do animal aumentará de acordo com a gravidade da infecção.

3. Avaliação séptica de animais

NOTA: Avaliar a condição clínica do animal é um aspecto fundamental para acompanhar a gravidade pós-cirurgias CLP/simuladas. Além disso, conforme exigido pela IACUC, devem ser estabelecidos parâmetros humanitários para o bem-estar animal. Para abordar essas preocupações e fornecer padrões para o cuidado diário dos animais, foram utilizadas orientações para a realização da avaliação animal usando o Modified Murine Sepsis Score (MMSS)¹⁴.

1. Use o MMSS (Arquivo Suplementar 1) para avaliar o animal. Observe que, para cada categoria, uma pontuação de 0 representa um animal saudável. Pontue o animal duas vezes ao dia de 0 a 3 de acordo com a gravidade da infecção.
2. Para aumentar a precisão, medir a temperatura da superfície xifóide e o peso corporal duas vezes ao dia^11,15 e registrar junto com a folha de pontuação do MMSS.
   NOTA: A temperatura típica da superfície xifóide e as flutuações do peso corporal são fornecidas na Figura Suplementar 1.
3. Consulte o IACUC local para desfechos humanos.
   NOTA: Para reproduzir os resultados, os seguintes critérios foram usados como desfechos: (1) Perda de peso corporal >40% da linha de base. (2) Temperatura <30 °C ou redução de >5 °C em relação ao valor anterior. (3) Uma pontuação de 3 no seguinte: Resposta ao estímulo, nível de consciência ou qualidade da respiração. (4) Total diário de MSSS ≥17. A avaliação aqui descrita foi projetada para ser realizada no pós-operatório e em animais submetidos à deambulação normal. Recomenda-se abster-se de manusear animais submetidos a HLS para evitar o contato entre seus membros posteriores e superfícies. Após a avaliação final, eutanasiar o animal de acordo com as recomendações do comitê de ética animal local.

Resultados

Para os dados representativos apresentados nos resultados, foram utilizados camundongos C57BL/6J machos, com 17 semanas de idade, com massa corporal variando de 27 a 34 g. Todo o protocolo leva onze dias para ser concluído e consiste na intervenção cirúrgica (FLP ou sham), suporte salino e analgésico (dias 0 a 4) e desuso do HLS (dias 4 a 11). Experimentos terminais podem ser realizados em qualquer ponto durante a fase de suspensão. Para entender melhor o impacto do modelo na funç...

Discussão

O protocolo atual fornece diretrizes técnicas para a implementação de um novo modelo pré-clínico de miopatia induzida por sepse. Todos os materiais e etapas importantes são descritos em detalhes para a reprodução do modelo. Essa abordagem pode reproduzir a disfunção muscular esquelética observada em pacientes sépticos, destacando o papel do desuso como um componente crucial no agravamento da miopatia. Até o momento, a maioria dos estudos pré-clínicos que abordaram a miopat...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-0 Ethicon Coated Vicryl	Ethicon	D5792	Absorbable suture used for closure of muscle layer and for ligation of the cecum.
4-0 Ethilon Black 18"	Ethicon	662G	Non absorbable suture for closure of the skin layer.
BD  PrecisionGlide Needle 26-28 G	BD	305136 for 27g needle	Needle for puncturing the cecum.
C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	strain #000664
Cotton Tipped Applicators	Puritan	S-18991	Swabs for topical application of iodine.
Cryostat	(Leica CM1950)
Dynarex Povidone Iodine Prep Solution	Dynarex	1415	Topical Antiseptic Liquid for Skin and Mucosa
Ethanol 200 Proof (100%)	Fisher Scientific		To make 70% ethanol for cleaning skin.
Hindlimb Suspension Cages	Custom Made	N/A	These custom made cages will be highlighted in the video recordings of the MS.
Optixcare Eye Lube	Optixcare		Eye lube for protection during survival surgery.
Scalpel blades #11	Fine Science		Blade used to make incisions on skin and muscle.
Skin-Trac	Zimmer	736579	Foam tape for fixing the tail to the suspension apparatus.
SomnoSuite Low-Flow Digital Vaporizer	Kent Scientific Corporation	SS-01	Vaporizer for Isoflurane Anesthesia
Tissue bath apparatus	Aurora Scientific	Model 800A, Dual Mode Muscle Lever 300C