Amostragem de sangue e medição hormonal para determinar o estágio do ciclo ovariano em saguis

Resumo

Este protocolo descreve amostras de sangue e urina para medir os níveis de progesterona/estradiol e gonadotrofina coriônica para determinar o estágio do ciclo ovariano. Os níveis hormonais são usados para prever e determinar o momento da ovulação e os hormônios são injetados para regular o ciclo ovariano e o crescimento do oócito.

Resumo

Os saguis comuns são pequenos macacos do Novo Mundo. Como muitos de seus mecanismos biológicos são semelhantes aos dos humanos, os saguis são potencialmente úteis para pesquisas médicas e de biologia humana em vários campos, como neurociência, medicina regenerativa e desenvolvimento. No entanto, há uma falta de literatura descrevendo métodos para muitos experimentos e procedimentos básicos. Aqui, são descritos métodos detalhados para determinar os níveis de hormônios sexuais (progesterona, estradiol e gonadotrofina coriônica) em saguis. A medição desses hormônios permite a previsão do estágio do ciclo ovariano, que normalmente é de 26 a 30 dias em saguis; A determinação precisa é essencial para a colheita de oócitos/zigotos no momento correto e para a preparação de fêmeas hospedeiras para a geração de saguis geneticamente modificados.

Além disso, a medição dos níveis de hormônios sexuais é útil para estudos de endocrinologia, etologia, desenvolvimento inicial e biologia reprodutiva. Este protocolo fornece uma descrição detalhada dos métodos de amostragem de sangue da veia femoral, separação de plasma para medição hormonal, medição dos níveis de gonadotrofina coriônica usando urina e plasma, redefinição do ciclo ovariano usando injeções de um análogo de prostaglandina F2α para encurtar e sincronizar o ciclo e promovendo o crescimento folicular e a ovulação injetando hormônio folículo-estimulante e gonadotrofina coriônica. Usando esses protocolos, os estágios do ciclo ovariano podem ser determinados para a coleta oportuna de oócitos/zigotos.

Introdução

O sagui comum (Callithrix jacchus) é um pequeno macaco do Novo Mundo com muitas características semelhantes às dos humanos, e a duração de seu ciclo ovariano é de 26 a 30 dias ^1,2. Estudos sobre o desenvolvimento inicial e a geração de saguis geneticamente modificados requerem a colheita de oócitos e zigotos em estágios específicos do ciclo ovariano. Assim, a determinação precisa do estágio é crucial e pode ser estimada pela medição dos níveis sanguíneos dos hormônios progesterona (P4) e estradiol (E2)^2,3. Esses hormônios promovem o crescimento endometrial, necessário para a implantação. P4 é produzido a partir do corpo lúteo, que se forma nos ovários imediatamente após a ovulação. E2 é secretado pelos folículos ovarianos em resposta ao hormônio folículo-estimulante (FSH) do complexo hipotálamo-hipófise no cérebro. Os níveis de E2 aumentam à medida que o folículo amadurece, atingindo o pico antes da ovulação³. Altos níveis de E2 causam a liberação pulsada do hormônio luteinizante (LH) através do complexo hipotálamo-hipófise em humanos; esse aumento de LH induz a ovulação. No entanto, em saguis, o gene LH sofreu degeneração durante a evolução, e a ovulação é induzida pela liberação de gonadotrofina coriônica (CG), que tem uma estrutura semelhante à do LH, da glândula pituitária ^4,5.

O ciclo ovariano pode ser controlado por injeções hormonais. As injeções de FSH, em humanos, atuam nos receptores ovarianos de FSH e são usadas para promover a síntese de estrogênio e o crescimento folicular⁶. A injeção de CG humano (hCG) como substituto do LH no final da fase folicular é usada para estimular a ovulação em humanos⁷. As injeções de CG também são usadas para tratar a infertilidade humana porque o CG estimula o corpo lúteo no início da gravidez, resultando em aumento da produção de P4. As injeções de prostaglandina F2α (PGF2α) redefinem o ciclo ovariano⁸. Em bovinos domésticos, a injeção de PGF2α é usada para encurtar a fase lútea e sincronizar o ciclo estral para o manejo reprodutivo.

Embora saguis e humanos tenham mecanismos biológicos semelhantes, tornando-os animais modelo ideais, há uma falta de literatura que descreva métodos básicos para muitas técnicas frequentemente usadas. A coleta de sangue é uma das técnicas mais utilizadas 9,10,11,12. No entanto, os iniciantes às vezes têm dificuldade em encontrar a veia. Assim, este estudo realizou análises anatômicas da região da veia femoral. Com base em observações anatômicas, este protocolo apresenta a região proximal do triângulo femoral como um local fácil para punção venosa.

Protocolo

Todos os métodos envolvendo saguis utilizaram altos padrões éticos e de bem-estar e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Centro Nacional de Saúde e Desenvolvimento Infantil. Os animais utilizados aqui foram alojados individualmente ou pareados (uma fêmea e um macho) com 12 h de luz por dia.

1. Amostragem de sangue da veia femoral

1. Prepare uma seringa de 1 ml (o tipo curto é fácil de utilizar) com uma agulha de 25 G fixada com a lâmina virada para cima. Para evitar entupimento do sangue, heparinize a seringa aspirando 200 μL de solução de heparina sódica não diluída para a seringa. Cubra o interior da seringa uniformemente, puxando-a para cima e para baixo várias vezes; Em seguida, expulse a solução de heparina da seringa.
   NOTA: Como a mudança para uma nova seringa é frequentemente necessária, prepare algumas seringas heparinizadas adicionais.
2. Prepare algodão absorvente e cotonetes com álcool. Ligue uma lâmpada ajustável para iluminar a área onde o sagui será colocado para coleta de sangue.
3. Prepare o dispositivo de retenção (420 x 85 x 85 mm, Figura 1A), que está disponível comercialmente (consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes). Para colocar um sagui no dispositivo, abra a parte de retenção com o cinto de esponja, que prende os saguis. Insira o sagui no dispositivo de retenção voltado para cima.
   NOTA: Os saguis geralmente são calmos em dispositivos de contenção, o que pode anular a necessidade de contenção, aclimatação ou treinamento.
4. Capture o sagui; insira o sagui na parte cilíndrica; e prenda-o pressionando a correia de esponja. Coloque a perna da qual o sangue deve ser coletado em cima da outra (Figura 1A). Segure as pernas usando a mão não dominante; Coloque os dedos médio e anelar dentro de cada perna para prendê-los e os outros dedos fora de cada perna para fixá-los.
   NOTA: Luvas de mordida são recomendadas ao capturar saguis. Se um dispositivo de contenção não estiver presente, faça a coleta de sangue sob anestesia ou com outra pessoa prendendo o sagui.
5. Verifique se a veia femoral está visível perto da base da coxa. Caso contrário, palpe para encontrar a artéria pulsante e use-a como ponto de referência para verificar se a veia corre dentro dela (Figura 1B-D).
   NOTA: Recomenda-se iluminação de mesa e depilação para melhorar a visibilidade. A visibilidade também pode ser melhorada esfregando com cotonetes embebidos em álcool. Os gânglios linfáticos no triângulo geralmente estão localizados perto da veia e mostram uma cor azul escura como veia. Como distingui-los é descrito na seção Resultados representativos.
6. Desinfete o local da punção usando um cotonete embebido em álcool. Insira a agulha com o lado da lâmina para cima em um ângulo de 15°-20°. Para evitar que a agulha escorregue para fora do vaso sanguíneo durante a coleta de sangue, estabilize a mão que segura a seringa, por exemplo, apoiando-a na outra mão.
7. Puxe suavemente o êmbolo para trás para aplicar pressão negativa (Figura 1E). Empurre a ponta da agulha para frente. Assim que o sangue entrar na seringa, mantenha a posição da ponta da agulha até que o volume necessário (500-700 μL) tenha sido coletado.
   1. Quando o sangue não entrar na seringa, mude o local da punção. Se o sangue sair ao retirar a agulha, pare o sangramento aplicando pressão no local da punção por 3 min. Depois de parar o sangramento, reinicie a punção venosa.
   2. Se o sangue que está sendo aspirado para a seringa parar de fluir durante o processo de coleta, empurre lentamente a ponta da agulha para frente e puxe-a para trás para encontrar o vaso sanguíneo. Isso pode restaurar o fluxo de sangue para a seringa. Caso contrário, retire a agulha e faça a punção venosa usando uma seringa nova.
      NOTA: Use a coxa da outra perna quando for difícil coletar sangue do mesmo lado.
8. Puxe cuidadosamente a agulha enquanto pressiona levemente o local da punção usando o dedo mindinho. Em seguida, usando um cotonete absorvente, aplique pressão imediatamente no local da punção por 3 min para estancar o sangramento. Inverta a seringa para misturar sangue e heparina.
   NOTA: Aplique pressão por mais tempo (5 min) enquanto resfria quando o sangue arterial é coletado e confirme cuidadosamente a cessação do sangramento para evitar a formação de hematoma, que às vezes pode resultar em um resultado fatal.
9. Depois de confirmar que o sangramento cessou, remova o cinto de esponja, segure a cintura do animal com uma mão e gire o animal para que se possa segurar a axila do animal com a outra mão por trás.
10. Retorne o sagui para sua gaiola. Para reduzir o estresse e facilitar a coleta repetida de sangue, forneça ao sagui sua comida favorita (por exemplo, biscoitos, marshmallows ou pão de ló). Verifique a ocorrência de hematoma ocasionalmente.
    NOTA: Quando o hematoma for encontrado no estágio inicial, aplique um curativo de pressão para evitar a progressão do hematoma. Quando é encontrado após muito tempo, pode ser necessária a remoção cirúrgica do hematoma com ligadura da artéria femoral e transfusão sanguínea ^9,13.
11. Retire a agulha da seringa para evitar hemólise. Em seguida, expulse lentamente o sangue coletado ao longo da parede interna de um microtubo de 1,5 mL.
    NOTA: O sangue coletado pode ser armazenado a 4 ^oC por até 24 h antes da separação do plasma para medir os níveis de P4 / E2.

2. Separação do plasma e determinação dos níveis hormonais

1. Centrifugue o sangue em um tubo de 1,5 mL a 1.100 × g por 5 min a 4 ^oC.
2. Transfira o plasma separado (sobrenadante) do tubo de 1,5 mL para um novo tubo/copo, evitando cuidadosamente a inclusão de células sanguíneas (sedimento).
3. Meça os níveis de P4 e E2 usando um kit ELISA ou um analisador automático. Se a quantidade de plasma não for suficiente para o analisador automático, utilizar uma solução de diluição da amostra.
   NOTA: Para a medição usando um analisador automático, são necessários > 175 μL de plasma para determinar apenas um nível de P4 e > 250 μL de plasma para determinar P4 e E2.

3. Medição de CG de urina para detectar ovulação e gravidez

NOTA: Os níveis de CG em saguis podem ser medidos usando um teste de kit imunocromatográfico para ovulação e gravidez. No caso da ovulação, um resultado positivo pode ser obtido 0-2 dias antes da ovulação. No caso de gravidez, um resultado positivo é detectado dos dias 15-20 até aproximadamente o dia 100 de gravidez. O teste requer uma pequena quantidade (90 μL) de urina (uma gota de urina equivale a ~ 30 μL).

1. Método da bandeja: Se mais de dois animais estiverem na mesma gaiola, mova o sagui alvo (ou os outros animais) para outra gaiola no dia anterior. Coloque uma bandeja limpa no fundo da gaiola na noite anterior ou anterior ao acendimento. A urina não é drenada da bexiga durante a noite. Portanto, a urina geralmente é liberada da bexiga logo após o acendimento.
   NOTA: Entrar na sala pela manhã antes da iluminação pode interromper o ciclo de sono da coorte. A urina geralmente pode ser coletada em aproximadamente 30 minutos após o acendimento.
2. Método de compressão: Prepare as bandejas lavadas para a coleta de urina. Depois de localizar a bexiga do sagui, aperte-a cuidadosamente pela frente e pelos dois lados usando todo o comprimento dos dedos (Figura 1F). Colete a urina antes de iluminar a sala pela manhã.
   NOTA: Se a coleta de urina não for bem-sucedida devido à ausência de urina na bexiga, aguarde um pouco e tente novamente. Tenha cuidado para não usar força excessiva, pois isso ferirá o animal.
3. Imediatamente após a coleta, coloque a amostra de urina no poço do kit de teste imunocromatográfico. Leia o resultado após 10 minutos de acordo com as instruções do fabricante.

4. Controle e determinação do estágio do ciclo ovariano para a coleta de oócitos, zigotos e embriões

1. Coleta de oócitos de vesículas germinativas (GV) dos ovários
   1. Administre uma injeção intramuscular de 3 μL de cloprostenol 0,263 mg / mL (um análogo sintético de PGF2α) diluído em 150 μL de solução salina¹⁴ (Figura 2) para redefinir o ciclo ovariano no final da fase lútea (ou seja, ≥10 dias após o início da fase lútea).
      NOTA: Fazer a solução diluída em um volume maior pode ser conveniente, pois o cloprostenol diluído permanece estável por, pelo menos, várias semanas a +4 °C.
   2. No dia seguinte (dia 1), confirme o início da fase folicular verificando se o nível de P4 caiu.
      NOTA: Foi relatado que a injeção de cloprostenol diminui drasticamente os níveis de P4 (geralmente <10 ng / mL) em 24 h³.
   3. A partir do dia 1, injete FSH (25 UI, intramuscular) uma vez a cada 2 dias para um total de 5x (dias 1, 3, 5, 7 e 9). No dia 10, injete hCG (75 UI, intramuscular) à tarde.
   4. Coletar GVs dos ovários no dia 11 por aspiração folicular sob anestesia de acordo com a literatura^15,16.
      NOTA: Às vezes, a ovulação ocorre mais cedo do que o esperado. Assim, recomenda-se verificar os níveis de CG a partir do 8º dia. Se o teste de GC for positivo, realizar a coleta de GV neste dia.
2. Coleta de oócitos metafásicos II (MII), zigotos e embriões precoces
   1. Reponha o ciclo ovárico utilizando cloprostenol conforme descrito no passo 4.1.1.
   2. No dia seguinte (dia 1), confirme o início da fase folicular verificando se o nível de P4 caiu.
   3. Para a coleta de zigotos e embriões, alojar saguis fêmeas junto com saguis machos para acasalamento a partir do dia 6.
   4. A partir do dia 7, verifique os níveis sanguíneos de P4/E2 e os níveis de CG na urina das fêmeas. A detecção de CG é uma indicação de ovulação dentro de alguns dias (geralmente no dia seguinte). No dia em que os níveis de P4 aumentam e os níveis de E2 diminuem em relação ao dia anterior, coletar oócitos MII ou zigotos embrionários de dia 0 (E0) dos ovidutos^17,18.
   5. Para a coleta de embriões, conforme descrito na literatura, realize a lavagem dos ovidutos (E1-E3, 1-8 células)^17,18 ou do útero (E5-E10, 8 células-blastocisto)19,20,21,22 no momento apropriado, dependendo do estágio alvo.

Resultados

Os detalhes relacionados aos animais utilizados neste estudo estão listados na Tabela 1.

Análise anatômica da veia femoral
As análises anatômicas da veia femoral foram realizadas em um sagui-comum macho de 2 anos de idade (I 7713M) submetido à eutanásia. As veias e artérias femorais estão localizadas no triângulo femoral. O triângulo femoral é formado nos limites entre a parede abdominal e os músculos da coxa (...

Discussão

A localização da veia é a etapa mais crítica na coleta de sangue. Com base em observações anatômicas, este protocolo apresenta a área proximal no triângulo femoral como um local fácil para coleta de sangue em saguis. Usando esta área, a amostragem de sangue de uma veia grande pode ser facilmente realizada. No entanto, mesmo usando este protocolo, às vezes ocorre lesão em uma artéria. Ao lesionar uma artéria, sugere-se a interrupção completa do sangramento aplicando press...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
AIA-360	Tosoh Corporation	0019945	Hormone measurement (P4/E2)
AIA-PACK DILUENT CONCENTRATE	Tosoh Corporation	0020956	Hormone measurement (P4/E2)
AIA-PACK SUBSTRATE SET II	Tosoh Corporation	0020968	Hormone measurement (P4/E2)
AIA-PACK WASH CONCENTRATE	Tosoh Corporation	0020955	Hormone measurement (P4/E2)
CMS-1	CLEA Japan		Marmoset food
Estrumate	MSD Animal Health		PGF2alpha analog (cloprostenol)
Gonal-f Subcutaneous Injection 150	Merck Biopharma Co., Ltd.		FSH
Gonatropin for intramuscular injection 1000	ASKA Pharmaceutical Co., Ltd.	872413	hCG
Heparin sodium injection solution 5,000 units/5 mL	Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.	224122458	Blood collection
Immunochromatographic Test Kit for Detection of Common Marmoset Chorionic Gonadotropin (Dual Checker)	CLEA Japan, Inc.		Determining CG level
Low-profile double-arm microscope illumination LPF-SD	SHIOKAZE GIKEN		Desk lamp for blood collection
Marmoset blood collection restraint device	JIC Japan	JM-1006	Blood collection http://www.jic-japan.jp/prd/marmoset/prd016.html email: vi@jic-japan.jp
Metacam 0.05%	Boehringer Ingelheim Animal Health Japan Co., Ltd.		Hematoma treatment
Sample Cup, 3 mL, PS, for Tosoh 360 and AIA-600 II, 1000/Bag	Globe Scientific	110913	Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK iE2	Tosoh Corporation	0025224	Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK iE2 CALIBRATOR SET	Tosoh Corporation	0025324	Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK iE2 SAMPLE DILUTING SOLUTION	Tosoh Corporation	0025524	Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK PROGIII	Tosoh Corporation	0025240	Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK PROGIII CALIBRATOR SET	Tosoh Corporation	0025340	Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK PROGIII SAMPLE DILUTING SOLUTION	Tosoh Corporation	0025540	Hormone measurement (P4/E2)
Syringe with 25 G (0.50 x 25 mm) needle	TERUMO	SS-01T2525	Blood collection
Tensolvet 5.000 I.E. gel.	Dechra Pharmaceuticals	14033492	Hematoma treatment
TOSOH MULTI-CONTROL SET	Tosoh Corporation	0015965	Hormone measurement (P4/E2)