Condensados sintéticos e arquiteturas semelhantes a células de nanoestruturas de DNA anfifílico

Resumo

Apresentamos um protocolo para preparação de condensados biomoleculares sintéticos constituídos por nanoestrelas de DNA anfifílico a partir de seus oligonucleotídeos de DNA constituintes. Os condensados são produzidos a partir de um único componente de nanoestrela ou de dois componentes e são modificados para sustentar a transcrição in vitro de RNA a partir de um molde de DNA incorporado.

Resumo

Gotículas e condensados sintéticos estão se tornando constituintes cada vez mais comuns de sistemas biomiméticos avançados e células sintéticas, onde podem ser usados para estabelecer compartimentalização e sustentar respostas semelhantes à vida. As nanoestruturas de DNA sintético demonstraram potencial significativo como blocos de construção formadores de condensado devido à sua forma programável, funcionalização química e comportamento de automontagem. Recentemente, demonstramos que as "nanoestrelas" de DNA anfifílico, obtidas pela marcação de junções de DNA com porções hidrofóbicas, constituem uma solução particularmente robusta e versátil. Os condensados de DNA anfifílicos resultantes podem ser programados para exibir arquiteturas internas complexas e multicompartimentais, responder estruturalmente a vários estímulos externos, sintetizar macromoléculas, capturar e liberar cargas úteis, sofrer transformações morfológicas e interagir com células vivas. Aqui, demonstramos protocolos para a preparação de condensados de DNA anfifílicos a partir de oligonucleotídeos de DNA constituintes. Abordaremos (i) sistemas monocomponentes formando condensados uniformes, (ii) sistemas de dois componentes formando condensados núcleo-casca e (iii) sistemas nos quais os condensados são modificados para suportar a transcrição in vitro de nanoestruturas de RNA.

Introdução

As células sintéticas são dispositivos em escala micrométrica (10-50 μm) construídos de baixo para cima para replicar funções e estruturas de células biológicas existentes ^1,2. As células sintéticas são frequentemente ligadas por membranas construídas a partir de vesículas de bicamada lipídica ^3,4,5,6,7, polimerossomos ^8,9 ou proteinossomos^10,11<....

Protocolo

NOTA: O protocolo é dividido em três seções. A Seção 1 descreve as etapas de pré-requisito, incluindo a preparação de oligonucleotídeos de DNA e capilares de vidro. A Seção 2 descreve a preparação de condensados de estrela C de vários projetos, incluindo projetos de um e dois componentes, e sua extração dos capilares de vidro. A Seção 3 descreve o uso de condensados de estrela C de modelagem de RNA de um componente para a síntese de um aptâmero de RNA. O usuário deve seguir as boas práticas de laboratório o tempo todo, garantir que todas as avaliações e mitigações de risco necessárias estejam em vigor e usar equipamento de proteção individual (EPI) adequado, incluindo....

Discussão

O protocolo descrito aqui fornece uma abordagem para a preparação de condensados de um ou dois componentes a partir de nanoestrelas de DNA anfifílico, com variações de design para introduzir diferentes respostas nos condensados. O protocolo fornecido produz condensados em uma solução tampão de NaCl 0,3 M em TE, mas as condições tampão podem ser alteradas modificando adequadamente os volumes listados acima. Trabalhos anteriores estudaram a formação de condensados C-star em 0,2 M NaCl em TE e 0,1 M NaCl em TE .......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm syringe filters	Sigma-Aldrich	SLGVR33RB
24 x 60 mm #1.5 Rectangular cover glasses, Menzel Gläser	VWR	631-0853
2-Propanol	Sigma-Aldrich	34683
6 L Ultrasonic Cleaner with Digital Timer and Heat, 230 VAC	Cole-Parmer	WZ-08895-11
Araldite Rapid Adhesive 2 Part Epoxy Glue	RS	ARA-400005
Bio-Rad C1000 thermal cycler	Bio-Rad	1851197
Brand Microcentrifuge Tube 2 mL with Locking Lid	Fisher Scientific	15338665	2 mL microcentrifuge tubes for the extraction of C-star condensates
Diamond Scribing Pen	RS	394-217
Difluoro-4-hydroxybenzylidene imidazolidinone (DFHBI)	Sigma-Aldrich	SML1627
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	472301
Eppendorf PCR Clean Colorless Safe-Lock Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	0030123301	0.5 mL microcentrifuge tubes for the preparation of C-star mixtures
Ethanol Absolute 99.8+%	Fisher Scientific	10437341	70% ethanol is sufficient for cleaning purposes
Fisherbrand ZX4 IR Vortex Mixer	Fisherbrand	13284769
Hellmanex III	Hellma	9-307-011-4-507
Hollow Rectangle Capillaries ID 0.40 x 4.00 mm, 50 mm in length	CM Scientific	2540-50
Mineral oil	Sigma-Aldrich	69794
Mini Centrifuge, 230 V	PRISM(TM)	Z763128
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
NanoDrop One Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-ONE-W	Used to measure absorbance of oligonucleotides for concentration calculations
Oligonucleotides	Integrated DNA Technologies	Custom	Oligonucleotide sequences are unique to the C-star design required.
ScriptGuard RNase inhibitor	CELLSCRIPT	C-SRI6310K	RNase inhibitor
T7-FlashScribe Transcription Kit	Cambio	C-ASF3507
Tris-EDTA buffer, 100x stock solution	Sigma-Aldrich	574793
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	Invitrogen	10977035
VWR Spec-Wipe 3 Wipers	VWR	21914-758