Usando organoides intestinais humanos para entender o epitélio do intestino delgado no nível transcricional de uma única célula

Resumo

O protocolo combina a tecnologia organoide intestinal humana com análise transcriptômica de célula única para fornecer informações significativas sobre a biologia intestinal anteriormente inexplorada.

Resumo

A transcriptômica de célula única revolucionou nossa compreensão da biologia celular do corpo humano. As culturas organoides do intestino delgado humano de última geração fornecem sistemas modelo ex vivo que preenchem a lacuna entre modelos animais e estudos clínicos. A aplicação da transcriptômica de célula única a modelos de organoides intestinais humanos (HIO) está revelando biologia celular, bioquímica e fisiologia do trato gastrointestinal anteriormente não reconhecidas. As plataformas avançadas de transcriptômica de célula única usam particionamento microfluídico e código de barras para gerar bibliotecas de cDNA. Esses cDNAs com código de barras podem ser facilmente sequenciados por plataformas de sequenciamento de última geração e usados por várias ferramentas de visualização para gerar mapas. Aqui, descrevemos métodos para cultivar e diferenciar HIOs do intestino delgado humano em diferentes formatos e procedimentos para isolar células viáveis desses formatos que são adequados para uso em plataformas de perfil transcricional de célula única. Esses protocolos e procedimentos facilitam o uso de HIOs do intestino delgado para obter uma maior compreensão da resposta celular do epitélio intestinal humano no nível transcricional no contexto de uma variedade de ambientes diferentes.

Introdução

O epitélio do intestino delgado possui duas zonas distintas: a cripta que abriga a célula-tronco intestinal (CEI) e a vilosidade, que é composta por células diferenciadas das linhagens secretora e absortiva. Somando-se a essa complexidade está a especificidade regional do epitélio que fornece propriedades funcionais únicas entre as regiões do intestino delgado. Trabalhos pioneiros estabeleceram condições de cultura nas quais tanto a cripta do intestino delgado humano quanto as zonas de vilosidades podem ser geradas ex vivo a partir de tecidos cirúrgicos ou biópsias de tecidos¹. Essas culturas estão preenchendo a lacuna entre estudos em....

Protocolo

As linhagens organoides usadas aqui foram obtidas do Texas Medical Center Digestive Disease Center GEMS Core. Resumidamente, para estabelecer inicialmente as linhas organoides, amostras de tecido doador foram lavadas e digeridas enzimaticamente para liberar as criptas intestinais. As criptas foram embutidas em uma membrana basal e cultivadas em um meio. O Conselho de Revisão Institucional do Baylor College of Medicine aprovou o protocolo do estudo para obter amostras de tecido a partir das quais as linhas organoides foram estabelecidas, e o consentimento informado foi obtido de todos os doadores para estabelecer linhas organoides do tecido doado.

Discussão

Usando plataformas genômicas de célula única, sistemas biológicos complexos, como culturas HIO derivadas de tecidos que modelam o epitélio intestinal, podem ser divididos para produzir contribuições celulares individuais para a resposta biológica geral ^4,5,6. A heterogeneidade celular e as populações de células raras também podem ser identificadas e interrogadas. A entrada celular precisa ser otimizada para maximizar.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
[Leu15]-Gastrin I	Sigma-Aldrich	G9145	10 nM
0.05% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25300054
0.4% Trypan blue	Millipore-Sigma	T8154
0.5 M EDTA	Corning	46-034-CI
1x PBS Ca- Mg-	Corning	21-040-CM
24 mm Transwell	Costar	3412
24 well Nunclon delta surface tissue culture dish	Thermo Scientific	142475
40 µm cell strainer	Falcon	352340
40 µm Flowmi tip strainer	SP Bel-Art Labware	H13680-0040
70 µm Flowmi tip strainer	SP Bel-Art Labware	H13680-0070
96 well plate	Corning	3595
A-83-01	Tocris	2939	500 nM
Accutase	StemCell Technologies	7920
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-028
B27 supplement	Invitrogen	17504-044	1X
Chromium Next GEM Single Cell 3’ GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1	10x Genomics	PN-1000128
Collagen IV	Sigma-Aldrich	C5533-5MG	33 µg/mL
Corning Cell Recovery Solution	VWR	354253
DPBS (Mg2-, Ca2-)	Invitrogen	14190-136	1X
GlutaMAX-I	Invitrogen	35050-061	2 mM
HEPES 1M	Invitrogen	15630-080	10 mM
L-WRN conditioned media	ATCC	CRL-3276
Matrigel, GFR, phenol free	Corning	356231
mouse recombinant EGF	Invitrogen	PMG8043	50 ng/mL
N2 supplement	Invitrogen	17502-048	1X
N-Acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165-5G	500 µM
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636	10 mM
SB202190	Sigma-Aldrich	S7067	10 µM
Transwell	Corning	3413
Y27632	Stem Cell Technologies	72308	10 µM