Cultivo de um biofilme polimicrobiano relevante para fibrose cística para sondar fenótipos da comunidade

Resumo

Este protocolo descreve um modelo de biofilme polimicrobiano de quatro espécies relevante para o pulmão de fibrose cística (FC) que pode ser usado para explorar o impacto das interações bacterianas entre espécies.

Resumo

A maioria dos modelos in vitro não tem a capacidade de investigar completamente os fenótipos bacterianos emergentes das interações complexas observadas em ambientes da vida real. Isso é particularmente verdadeiro no contexto de infecções de difícil tratamento, crônicas e baseadas em biofilme polimicrobiano detectadas nas vias aéreas de indivíduos que vivem com fibrose cística (FC), uma doença genética de múltiplos órgãos. Embora vários estudos de microbioma tenham definido as composições microbianas detectadas nas vias aéreas de pessoas com FC (pwCF), nenhum modelo in vitro até agora integrou totalmente características pulmonares críticas relevantes para FC. Portanto, existe uma lacuna significativa de conhecimento na capacidade de investigar os mecanismos que impulsionam a patogênese de infecções pulmonares por FC de espécies mistas. Aqui, descrevemos um modelo de comunidade microbiana de quatro espécies recentemente desenvolvido, incluindo Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus sanguinis e Prevotella melaninogenica cultivadas em condições semelhantes à FC. Através da utilização deste sistema, fenótipos clinicamente relevantes, como a recalcitrância antimicrobiana de vários patógenos, foram observados e explorados em nível molecular. A utilidade deste modelo in vitro reside em seu fluxo de trabalho padronizado que pode facilitar o estudo das interações interespécies no contexto de infecções pulmonares crônicas por FC.

Introdução

Estratégias destinadas a erradicar micróbios causadores de doenças, como os detectados nas vias aéreas da fibrose cística (FC), uma doença genética de múltiplos órgãos, muitas vezes falham¹. Ou seja, a presença de comunidades microbianas resilientes semelhantes a biofilme crescendo no ambiente pulmonar rico em muco da FC pode causar infecções crônicas que se estendem por várias décadas². Além disso, embora a utilização de antimicrobianos de primeira linha (Abx) e moduladores tenha resultado em melhores resultados em pessoas com FC (pwFC), a abordagem clínica "um inseto, uma infecção" tipicamente empregada contra patógenos canônicos da FC, como Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus, tem sido ineficaz na resolução de infecções difíceis de tratar detectadas nos pulmões desses indivíduos ^{3,4, 5,6,7}.

Nas últimas duas décadas, vários estudos mudaram nossa compreensão da doença pulmonar crônica da FC⁸. Ou seja, relatos indicam que as infecções detectadas nas vias aéreas da pwCF não são causadas apenas por um único patógeno, mas são de natureza polimicrobiana⁸. Além disso, embora a patogênese das infecções pulmonares mistas por FC ainda seja pouco compreendida, evidências clínicas mostram que a pwCF co-infectada com S. aureus e P. aeruginosa em suas vias aéreas piorou a função pulmonar do que os indivíduos colonizados por qualquer um desses dois patógenos⁹.

Acredita-se que as interações interespécies entre patógenos da FC sejam uma razão pela qual as infecções baseadas em biofilme polimicrobiano não são prontamente erradicadas por meio da utilização de terapias para FC, impactando os resultados dos pacientes³. Apoiando isso, estudos in vitro demonstraram que as interações entre micróbios como P. aeruginosa, S. aureus e outros podem afetar fenótipos clinicamente relevantes, como a capacidade de resposta do Abx a medicamentos de FC de primeira linha, incluindo vancomicina e tobramicina ^6,10,11. Portanto, ainda não foi possível revisitar as estratégias atuais de tratamento destinadas a erradicar os patógenos da FC no contexto de infecções de espécies mistas.

O padrão-ouro no manejo de infecções pulmonares por FC de base microbiana depende fortemente da utilização de testes de suscetibilidade antimicrobiana (AST) para orientar intervenções clínicas¹². No entanto, a AST é tipicamente feita usando monoculturas bacterianas cultivadas em culturas ricas e bem misturadas, o que não reflete as condições de crescimento microbiano detectadas nas vias aéreas da FC ^3,13. Dada a desconexão significativa entre os resultados do paciente e o sucesso do tratamento, os relatórios clínicos agora defendem o desenvolvimento de novas abordagens que integram características críticas do pulmão da FC^12,14.

Poucos estudos desenvolveram sistemas in vitro multiespécies bacterianas relevantes para a FC contendo mais de dois patógenos^15,16. No entanto, esses modelos (1) não refletem inteiramente a natureza polimicrobiana e semelhante ao biofilme do pulmão para FC e (2) não utilizam condições nutricionais e ambientais próximas às detectadas na via aérea da FC^15,16. Por meio da mineração de grandes conjuntos de dados e computação do gene 16S rRNA derivado do pulmão da FC, Jean-Pierre e colegas desenvolveram recentemente um modelo de co-cultura in vitro integrando os recursos mencionados acima¹⁰. Este sistema inclui P. aeruginosa, S. aureus, Streptococcus spp. e Prevotella spp. cultivados em condições semelhantes às vias aéreas da FC e estáveis por até 14 dias. Os autores também relataram o crescimento específico da comunidade de Prevotella spp. e várias mudanças na capacidade de resposta do Abx desses patógenos da FC por meio de mecanismos que ainda precisam ser identificados¹⁰. Este sistema tratável in vitro também ofereceu a possibilidade de aprofundar questões mecanicamente focadas relacionadas à recalcitrância Abx de uma variante comum de P. aeruginosa frequentemente detectada nas vias aéreas do pwCF¹⁰. Portanto, o objetivo deste protocolo é fornecer à comunidade de pesquisa em FC um fluxo de trabalho experimental padronizado para cultivar um biofilme in vitro que tenha o potencial de ser expandido para abordar uma série de questões relevantes para a FC.

Protocolo

Os detalhes de todos os reagentes e equipamentos estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação de meio de escarro artificial

NOTA: Ao longo deste protocolo, o meio de escarro artificial (ASM) é definido como o meio relevante para a FC modificado do SCFM2, publicado anteriormente por Turner e colegas¹⁷. Abaixo está uma descrição das etapas para preparar este meio. Consulte a Tabela de Materiais para fazer soluções de estoque e condições de armazenamento. Essa versão do ASM difere de Turner et al.,¹⁷ pois a capacidade tampão na versão original não permite um pH estável ao longo do tempo. Ou seja, a atividade fermentativa realizada por Streptococcus spp. e anaeróbios como Prevotella spp. resulta na acidificação do meio de crescimento (observações não publicadas). Portanto, a concentração de ácido 3-morfolinopano-1-sulfônico (MOPS) foi ajustada de 10 mM para 100 mM.

NOTA: A preparação de uma solução estoque de base 2x ASM (ASMb) facilita a adição de componentes como mucina, ágar, água, etc., sem afetar a concentração final de moléculas presentes no ASM^10,18. O 2x ASMb pode ser preparado com antecedência e armazenado a 4 °C por até duas semanas em local escuro. Se o meio ficar amarelo, descarte.

1. Para preparar 2x ASM base, em um béquer limpo contendo 400 mL de diH₂O, adicione o seguinte enquanto agita:
   1. Adicione 6,50 mL de um 0,2 M NaH₂PO₄. H₂O estoque; 6,25 mL de um estoque de 0,2 M Na₂HPO₄ ; 348 μL de um estoque KNO₃ de 1 M; 1,084 mL de um estoque de 0,25 M K₂SO₄ .
   2. Adicione 4,0 g de Levedura sintética sem Triptofano; 3,032 g de NaCl; 20,92 g de MOPS; 1,116 g de KCl e 0,124 g de NH₄Cl.
   3. Adicione 9,30 mL de um estoque de ácido L-láctico 1 M; 2,70 mL de um estoque de glicose 1,1 M; 1,75 mL de um estoque de 1 M CaCl_{2,2H 2}O; 1,20 mL de um estoque de N-acetilglucosamina 0,25 M e 1,00 mL de um estoque de FeSO _{4,7H 2}O de 3,6 mM.
   4. Adicione 660 μL de um estoque de triptofano 0,1 M; 606 μL de um estoque de 1 M MgCl_{2.6H 2}O; 0,60 g de ácido desoxirribonucléico de esperma de arenque; 400 μL de um estoque de 250 mg/mL de 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC).
   5. Depois que todos os componentes forem adicionados, ajuste o pH para 6,80 com um estoque de NaOH 5 M. Complete até 500 mL com diH₂O. Esterilize usando um filtro de 0,22 μm e armazene a 4 ° C.
2. Para preparar um estoque de mucina de 10 mg / mL (2x), use um frasco de vidro limpo contendo 250 mL de diH₂O e agitando:
   1. Adicione 5,0 g de mucina do estômago suíno - Tipo II. Misture a suspensão por 10 min. Completar para 500 mL com diH₂O.
   2. Esterilize em autoclave a 121 °C durante 15 min. Conservar a 4 °C até à utilização.
3. Reconstitua o ASM.
   NOTA: Esta etapa precisa ser executada no dia do experimento.
   1. Misture uma proporção de volume de 1:1 do estoque de 2x ASMb e o estoque de mucina de 10 mg/mL.
   2. Vortex completamente antes de usar.

2. Preparação de meios seletivos da comunidade polimicrobiana

NOTA: Abaixo estão as quantidades necessárias para preparar um volume de 1 L de mídia.

1. Para preparar o ágar sal de manitol (MSA) e o ágar de isolamento de Pseudomonas (PIA), siga as instruções do fabricante.
2. Para preparar o Ágar Seletivo Prevotella (PSA), em um frasco de vidro limpo, adicione o seguinte:
   1. 30,0 g de caldo tríptico de soja (TSB). Possui 15,0 g de ágar. Contém 5,00 g de extrato de levedura. 0,50 g de cloridrato de L-cisteína.
   2. 10,0 mL de um estoque de hemina de 0,5 mg / mL. 100 μL de um estoque de menadiona de 10 mg / mL.
   3. Adicione 940 ml de diH₂O e mexa. Esterilize em autoclave a 121 °C durante 15 min.
   4. Quando esfriar (ou seja, a garrafa pode ser segurada com as mãos nuas), adicione mexendo: 50,0 mL de sangue de ovelha desfribrinado. 2,00 mL de um estoque de canamicina de 50 mg / mL. 150 μL de um estoque de vancomicina de 50 mg / mL. 500 μL de um estoque de polimixina B de 10 mg / mL.
3. Para preparar o ágar seletivo para Streptococcus (SSA), em um frasco de vidro limpo, adicione o seguinte:
   1. Possui 30,0 g de TSB. Possui 15,0 g de ágar.
   2. Adicionar 950 ml de diH₂O e mexer. Esterilize em autoclave a 121 °C durante 15 min.
   3. Quando esfriar (ou seja, a garrafa pode ser segurada com as mãos nuas), adicione mexendo: 50,0 mL de sangue de ovelha desfribrinado. 1,00 mL de um estoque de polimixina B de 10 mg / mL. 1,00 mL de um estoque de ácido oxolínico de 10 mg / mL.
      NOTA: Despeje em pratos e mantenha a 4 ° C por no máximo 1 mês. Antes de usar, deixe as placas secarem em temperatura ambiente até 24 h antes de serem inoculadas. O PSA foi validado com P. melaninogenica e Prevotella intermedia. A ASS foi validada com S. sanguinis e o grupo Streptococcus milleri (Streptococcus constellatus, Streptococcus intermedius e Streptococcus anginosus, denotado como SMG). É altamente recomendável validar de novo esses meios seletivos se novas cepas forem testadas.

3. Preparação de meios líquidos bacterianos e condições de crescimento

1. Para cultivar rotineiramente P. aeruginosa e S. aureus, use um meio rico estéril (por exemplo, caldo de lisogenia (LB) ou TSB).
   1. Comece o líquido durante a noite colhendo uma única colônia previamente cultivada em uma placa de ágar LB / TSB por 20-24 h a 37 ° C.
   2. Cultive as culturas de caldo a 37 °C durante a noite com agitação a 250 rpm por 16-18 h.
2. Para cultivar Streptococcus spp., use caldo Todd Hewitt estéril suplementado com 0,5% de extrato de levedura (THB-YE).
   1. Iniciar a cultura líquida durante a noite a partir de uma única colônia previamente cultivada em uma placa de ágar TSB suplementada com 5% de sangue de ovelha desfibrinado (placa de ágar sangue) por 24 h a 37 ° C + 5% de CO₂.
   2. Cultive as culturas de THB-YE anaeróbia ou a 37 °C + 5% de CO₂ durante a noite sem agitar por 18-22 h.
3. Para cultivar Prevotella spp., prepare 1 L de meio de crescimento Prevotella (PGM) adicionando o seguinte a uma garrafa limpa:
   1. Possui 30,0 g de TSB. Contém 5,00 g de extrato de levedura. 0,50 g de cloridrato de L-cisteína. 10,0 mL de um estoque de hemina de 0,5 mg / mL e 100 μL de um estoque de menadiona de 10 mg / mL.
   2. Adicione 990 mL de diH₂O. Esterilize em autoclave a 121 °C por 15 min. Embrulhe a garrafa em papel alumínio para protegê-la da luz.
   3. Cultivar Colónias de Prevotella spp. numa placa de ágar sangue incubada anaerobicamente a 37 °C durante 48 h.
   4. Inocular uma única colónia em PGM e crescer durante a noite sem agitar anaeróbia a 37 °C durante 24 h.
      NOTA: O PGM pode ser mantido em temperatura ambiente por até duas semanas. A realização de testes de esterilidade em cada meio de crescimento é fortemente recomendada antes do uso. Se não estiver usando uma câmara anaeróbica, pode ser necessário iniciar durante a noite líquido de Prevotella spp. a partir de um pedaço de colônias.

4. Preparação do experimento de co-cultura

NOTA: A Figura 1 mostra um fluxo de trabalho experimental resumido. A configuração do experimento pode ser feita em condições óxicas se o tempo de preparação demorar menos de 1 h. Se for previsível que demore mais do que isso, é altamente recomendável realizar o experimento usando uma câmara anaeróbica (com 10% de CO₂, 10% de H₂ e 80% de gás misto de N₂ ). Frascos anaeróbicos também podem ser usados para incubar as amostras experimentais.

1. Preparação das monoculturas e coculturas
   NOTA: Execute todas as etapas de centrifugação a 10.000 x g por 2 min em temperatura ambiente. Para as co-culturas, misture as amostras bacterianas antes de inocular as placas de 96 poços. Normalmente, um volume de 1 mL para cepas de P. aeruginosa e S. aureus é coletado das culturas durante a noite. Para Streptococcus spp. e Prevotella spp., os volumes noturnos podem variar entre 2-4 mL. Esses volumes podem ser ajustados dependendo do número de condições a serem testadas.
   1. Usando o líquido bacteriano das culturas noturnas, execute as seguintes etapas:
      1. Para cepas de P. aeruginosa e S. aureus , lave duas vezes com solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS).
      2. Para Streptococcus spp. e Prevotella spp., lave uma vez com PBS estéril.
         NOTA: Use uma pipeta para descartar cuidadosamente os sobrenadantes, pois os pellets podem ser facilmente perdidos.
      3. Após as lavagens, ressuspenda cada pellet em 1 mL de 1x ASMb diluído em água.
      4. Fazer uma diluição de 1:10 de cada amostra em PBS estéril e medir o OD₆₀₀.
      5. Ajuste todas as culturas para um OD₆₀₀ de 0,2 em ASM.
      6. Usando as suspensões OD₆₀₀ = 0,2, diluir em ASM as amostras bacterianas para um OD₆₀₀ final de 0,01 (para cada micróbio) para as monoculturas e co-culturas.
      7. Vórtice completamente por 5 s.
         NOTA: Por exemplo, para preparar um total de 1 mL de suspensão ASM de monocultura de P. aeruginosa a OD₆₀₀ = 0,01, adicione 50 μL de P. aeruginosa a OD₆₀₀ = 0,2 a um volume de 950 μL de ASM. Para a co-cultura, tomar 50 μL de cada suspensão de P. aeruginosa, S. aureus, Streptococcus spp. e Prevotella spp. a uma DO_{de 600} = 0,2 e adicionar a 800 μL de ASM.
      8. Usando uma pipeta, adicione 100 μl das suspensões de monocultura e cocultura em três poços separados de uma placa de plástico estéril de fundo plano de 96 poços.
      9. Incubar a placa (sem agitar) durante 24 h a 37 °C em condições anóxicas.
         NOTA: Outras tensões de oxigênio (por exemplo, microxia, normóxia) também podem ser usadas aqui. No entanto, o modelo foi desenvolvido e validado com condições anóxicas. Confirme o inóculo inicial diluindo em série as suspensões bacterianas de monocultura e cocultura, e o plaqueamento em PIA, MSA, SSA e PSA é fortemente recomendado. A concentração inicial alvo para cada espécie bacteriana é de 1 × 10⁷ UFC/mL (P. aeruginosa), 3,5 × 10⁶ UFC/mL (S. aureus), 1,2 × 10⁶ UFC/mL (Streptococcus spp.) e 4,6 × 10⁶ UFC/mL (Prevotella spp.). Os inóculos bacterianos também podem ser modificados, conforme descrito por Jean-Pierre e colegas¹⁰.
2. Substitua a mídia após a formação do biofilme.
   1. Após 24 h de incubação, remover as células não aderidas (planctónicas) por aspiração com uma pipeta multicanal.
   2. Reabasteça os biofilmes pré-formados com 100 μL de ASM fresco ou o tratamento desejado (por exemplo, antibióticos, metabólitos, etc.).
   3. Incubar a placa durante mais 24 h a 37 °C em condições anóxicas.
      NOTA: Essas etapas podem ser executadas aeróbicas se executadas rapidamente (ou seja, menos de 1 min). Caso contrário, use uma câmara anaeróbica.

5. Coletando e chapeando as amostras

1. Após as 24 h adicionais de incubação, aspirar as células não aderidas (planctônicas) com uma pipeta multicanal.
   NOTA: A fração planctônica pode ser mantida, diluída em série e revestida em meio seletivo ou descartada.
2. Lave suavemente os biofilmes duas vezes usando 125 μL de PBS estéril e descarte os volumes.
3. Adicione 50 μL de PBS estéril e retire os biofilmes raspando suavemente as células da placa usando um replicador de 96 pinos.
4. Transfira as células de biofilme ressuspensas para a linha A de uma nova placa estéril de 96 poços.
   NOTA: A placa de 96 poços conterá PBS estéril nas linhas B a H.
5. Realize uma diluição serial de 10x das frações planctônica (se necessário) e biofilme.
6. Colocar 3-5 μL de cada amostra de diluição em PIA, MSA, SSA e PSA.
7. Deixe as manchas de inoculação secarem.

6. Incubação das placas seletivas e contagem da unidade formadora de colônias (UFC)

1. Para P. aeruginosa e S. aureus, incubar a 37 °C durante 18-20 h.
2. Para Streptococcus spp, incubar a 37 °C em condições anóxicas durante 24 h.
3. Para Prevotella spp, incubar a 37 °C em condições anóxicas durante 48 h.
4. Após a incubação, contar as colónias (~10-35 por mancha) e calcular o UFC por ml.
5. Plote os dados usando uma ferramenta de visualização.

Resultados

Conforme representado na Figura 2, vários fenótipos foram relatados, incluindo (1) uma redução no número de contagens de células viáveis de P. aeruginosa e S. aureus quando cultivadas em comunidades planctônicas mistas em comparação com a monocultura, (2) um aumento no crescimento polimicrobiano de células de S. sanguinis e, (3) crescimento de comunidades mistas de P. melaninogenica , conforme relatado anteriorm...

Discussão

A utilidade deste sistema de co-cultura in vitro clinicamente informado reside em sua capacidade de detectar funções bacterianas específicas de polimicrobianos. Ou seja, por meio da utilização desse modelo, relatamos fenótipos microbianos que variam de crescimento específico da comunidade de Prevotella spp. (Figura 2) a mudanças na suscetibilidade à FC Abx de linha de frente de P. aeruginosa, S. aureus e S. sa...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)	Fisher Scientific	NC0387928	Prepare a 250 mg/mL stock in chloroform directly in the bottle. Keep at -20°C. Final concentration 200 μg/mL in 2x ASM base.
3-morpholinopropane-1-sulfonic acid (MOPS)	Sigma	M1254	Final concentration 200 mM in 2X ASM base.
96-pin replicator	Fisher Scientific	05-450-9	Disposable replicators can also be used. Cat #NC1567338.
96-well sterile standard plate with lid	Fisher Scientific	62406-081
Agar	Fisher Scientific	DF0145-17-0
AnaeroPack 2.5 L Rectangular Jar	Fisher Scientific	23-246-385
CaCl2*2H2O	Fisher Scientific	C79-500	Prepare a 1 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 3.5 mM in 2x ASM base.
Defribrinated sheep's blood			To prepare growth plates for Streptococcus and Prevotella.
Deoxyribonucleic acid from herring sperm	Sigma	D7290	Final concentration 1.2 mg/mL in 2x ASM base.
FeSO4*7H2O	Fisher Scientific	AA1449830	Prepare a 1 mg/mL stock (3.6 mM) in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Keep wrapped in aluminum foil. Final concentration 0.0072 mM in 2x ASM base.
GasPaks	Fisher Scientific	B260678
Glucose	Fisher Scientific	D16-3	Prepare as a 20% stock (1.1 M) in water and sterilize by autoclave. Final concentration 6 mM in 2x ASM base.
Hemin	Sigma	51280	Dissolve 100 mg of hemin in 2 mL of 1 M NaOH and then bring up volume to 200 mL with water. Store in an amber bottle or a regular bottle wrapped with aluminum foil at 4 °C.
K2SO4	Fisher Scientific	P304-500	Prepare a 0.25 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 0.54 mM in 2x ASM base.
Kanamycin			Prepare a 50 mg/mL stock solution in water. Filter sterilize with a 0.22 μm filter and store at 4 °C.
KCl	Fisher Scientific	P217-500	Final concentration 30.0 mM in 2x ASM base.
KNO3	Fisher Scientific	P263-500	Prepare a 1 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 0.70 mM in 2x ASM base.
L-cysteine hydrochloride	Fisher Scientific	AAA1038922
L-Lactic acid	Sigma	L1750	Prepare a 1 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. pH adjust to 7.0. Final concentration 18.6 mM in 2x ASM base.
L-Tryptophan	Sigma	T0254	Prepare a 0.1 M stock in 0.2 M NaOH and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Keep refrigerated at 4 °C wrapped in aluminum foil. Final concentration 0.132 mM in 2x ASM base.
Mannitol Salt Agar	Fisher Scientific	B11407	Prepare using manufacturer's recommendations.
Menadione	Sigma	M5625	Prepare a 10 mg/mL stock solution dissolved in 96-100% ethanol. Conserve at 4 °C wrapped in aluminium foil. Vortex before use.
MgCl2*6H2O	Fisher Scientific	AA12288A9	Prepare a 1 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 1.21 mM in 2x ASM base.
Mucin from porcine stomach - Type II	Sigma	M2378	Prepare a 10 mg/mL (2x) stock in water; mix thoroughly before autoclaving. Keep at 4 °C.
Na2HPO4	Fisher Scientific	S375-500	Prepare a 0.2 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 2.5 mM in 2x ASM base.
N-acetylglucosamine	Sigma	A8625	Prepare a 0.25 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Keep stock refrigerated at 4 °C. Final concentration 0.6 mM in 2x ASM base.
NaCl	Fisher Scientific	S271-500	Final concentration 103.7 mM in 2x ASM base.
NaH2PO4*H2O	Fisher Scientific	S369-500	Prepare a 0.2 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 2.6 mM in 2x ASM base.
NaOH	Fisher Scientific	S318-500	Prepare a 5 M stock solution. Use to adjust pH of 2x ASM base stock.
NH4Cl	Fisher Scientific	A661-500	Final concentration 4.6 mM in 2x ASM base.
Oxolinic acid			Prepare a 10 mg/mL stock solution 0.5 M NaOH. Filter sterilize with a 0.22 μm filter and store at 4 °C.
Polymixin B			Prepare a 10 mg/mL stock solution in water. Filter sterilize with a 0.22 μm filter and store at 4 °C.
Pseudomonas Isolation Agar	Fisher Scientific	DF0927-17-1	Prepare using manufacturer's recommendations.
Todd Hewitt Broth	Fisher Scientific	DF0492-17-6	Prepare using manufacturer's recommendations.
Tryptic Soy Broth	Fisher Scientific	DF0370-17-3	Prepare using manufacturer's recommendations.
Vancomycin			Prepare a 50 mg/mL stock solution in water. Filter sterilize with a 0.22 μm filter and store at 4 °C.
Yeast Extract	Fisher Scientific	B11929
Yeast Synthetic Dropout without Tryptophan	Sigma	Y1876	Final concentration 8.0 mg/mL in 2x ASM base.