Pipeline para estudo anatômico tridimensional em várias escalas do coração humano

Resumo

Este protocolo apresenta um pipeline abrangente para analisar amostras obtidas de corações humanos que abrangem as escalas microscópica e macroscópica.

Resumo

O estudo detalhado de corações humanos sem falha rejeitados para transplante oferece uma oportunidade única de realizar análises estruturais em escalas microscópicas e macroscópicas. Essas técnicas incluem limpeza de tecido (imagem tridimensional (3D) habilitada para imunomarcação modificada de órgãos limpos com solvente) e coloração imuno-histoquímica. Os procedimentos de exame mesoscópico incluem dissecção estereoscópica e tomografia computadorizada (TC). Os procedimentos de exame macroscópico incluem dissecção macroscópica, fotografia (incluindo anáglifos e fotogrametria), tomografia computadorizada e impressão 3D do coração dissecado física ou virtualmente ou inteiro. Antes do exame macroscópico, a fixação por pressão-perfusão pode ser realizada para manter a arquitetura 3D e a morfologia fisiologicamente relevante do coração. A aplicação dessas técnicas em combinação para estudar o coração humano é única e crucial para entender a relação entre características anatômicas distintas, como vasculatura coronária e inervação miocárdica, no contexto da arquitetura 3D do coração. Este protocolo descreve as metodologias em detalhes e inclui resultados representativos para ilustrar o progresso na pesquisa da anatomia cardíaca humana.

Introdução

Como a função segue a forma, entender a arquitetura do coração é fundamental para a apreciação de sua fisiologia. Embora inúmeras investigações tenham revelado a anatomia cardíaca de micro a macroescalas ^1,2,3, várias questões permanecem sem solução, especialmente aquelas relacionadas à anatomia cardíaca humana. Isso ocorre em parte porque os estudos básicos com foco na anatomia funcional geralmente utilizaram corações de animais ^4,5,6, que muitas vezes são distintos dos corações humanos ^1,7,8. Além disso, cada estudo individual, mesmo aqueles que usam amostras de coração humano, tende a se concentrar em estruturas muito específicas, o que dificulta a aplicação dos achados no contexto de todo o coração. Isso é ainda mais verdade se as estruturas focadas estiverem em micro ou mesoescalas, como o perínexo⁹ e os plexos ganglionares¹⁰.

Nesse contexto, o estudo estrutural sistêmico do coração humano rejeitado para transplante oferece uma oportunidade única e rara de obter um atlas abrangente das estruturas cardíacas em foco em escalas microscópicas e macroscópicas¹¹. Os protocolos de exame microscópico incluem limpeza de tecido (imagem tridimensional (3D) habilitada para imunomarcação modificada de órgãos eliminados com solvente, iDISCO+^)12,13 e coloração imuno-histoquímica. Os protocolos de exame mesoscópico incluem dissecção estereoscópica, macrofotografia e tomografia computadorizada (TC). Os protocolos de exame macroscópico incluem dissecção macroscópica¹⁴, fotografia (incluindo anáglifos e fotogrametria) ^{15 , 16 , 17} , tomografia computadorizada , dissecção virtual¹⁸ e impressão 3D do coração dissecado física ou virtualmente ou inteiro¹⁷. Na preparação para o exame macroscópico, a fixação por pressão-perfusão é realizada para manter a arquitetura 3D e a morfologia fisiologicamente relevante do coração 14,19,20,21. A aplicação combinada dessas técnicas é única e crucial para correlacionar características anatômicas distintas no contexto da arquitetura 3D do coração humano.

Como a oportunidade de obter uma amostra de coração humano não patológico é extremamente limitada, uma abordagem multiescala descrita aqui maximiza o uso da amostra. Ao aplicar vários procedimentos descritos abaixo, os resultados representativos ilustrarão ao leitor como os achados podem ser utilizados para múltiplos propósitos, incluindo descoberta em pesquisa científica¹¹ (análises abrangentes da inervação cardíaca, distribuição dos plexos ganglionares), melhoria dos procedimentos clínicos (simulação para abordagens cirúrgicas e intervencionistas) e educação anatômica (demonstração 3D real da anatomia cardíaca).

Protocolo

Este estudo usou amostras de tecido não identificadas coletadas de corações humanos de doadores sem falha e foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade da Califórnia, Los Angeles (UCLA). As amostras foram obtidas de corações sem falha que foram rejeitados para transplante. Os corações foram perfundidos por pressão, fixados em paraformaldeído a 4% (PFA) e fotografados antes do processamento do tecido pelos seguintes métodos. A Figura 1 resume o fluxograma da ordem do estudo. Os detalhes dos reagentes e do equipamento utilizado no estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Exame em microescala

1. Limpeza de tecido usando imagem 3D habilitada para imunomarcação modificada de órgãos limpos com solvente (iDISCO+) protocolo.
   1. Disseque o tecido fixado com PFA a 4% com um bisturi para caber na câmara de 3 mm × 16 mm × 25 mm para microscopia confocal. Para obter imagens de tecidos mais espessos, câmaras e/ou espaçadores adicionais podem ser empilhados na lâmina.
   2. Desidratar amostras usando séries graduadas de metanol (MeOH) (20%, 40%, 60%, 80% e 100% MeOH em H₂O deionizado [vol/vol]) por 1 h cada à temperatura ambiente (RT) com agitação.
   3. Lave com 100% MeOH por 1 h em RT e mergulhe em 66% de diclorometano/33% de MeOH em RT com agitação durante a noite.
   4. No dia seguinte, lave duas vezes em MeOH (100%) por 1 h em RT, leve à geladeira a 4 ° C e trate com 5% H₂O₂ em MeOH (vol / vol) durante a noite a 4 ° C.
   5. Reidrate com séries graduadas de MeOH (80%, 60%, 40% e 20% de MeOH) e lave em 0,01 mol/L PBS por 1 h cada em RT com agitação.
   6. Lave os tecidos duas vezes em 0,01 mol / L PBS com 0,2% de Triton X-100 por 1 h em RT.
   7. Prepare-se para a imunomarcação permeabilizando em PBS 0,01 mol/L, 20% de dimetilsulfóxido (DMSO), 0,2% de Triton X-100 e 0,3 mol/L de glicina por 2 dias a 37 °C com agitação.
   8. Bloqueie em PBS 0.01 mol/L com 10% de DMSO, 0.2% de Triton X-100 e 5% de soro de burro normal por mais 2 dias a 37 °C com agitação.
   9. Marcação com um anticorpo primário compatível com MeOH conjugado a fluoróforos diluídos em PBS 0,01 mol/L com 10 mg/mL de heparina (PTwH), Tween-20 a 0,2%, DMSO a 5% e soro de burro normal a 3% por 3-4 dias a 37 °C com agitação.
   10. Reabastecer a solução de anticorpos e incubar por mais 3-4 dias a 37 °C com agitação.
   11. Após 1 semana de incubação em solução primária de anticorpos, lave 4 a 5 vezes em PTwH durante a noite em RT.
   12. Incubar com anticorpo secundário conjugado a fluoróforos diluídos em PTwH, soro de burro normal a 3% por 3 dias a 37 °C com agitação.
   13. Reabastecer a solução de anticorpos secundários e incubar durante mais 3 dias a 37 °C com agitação.
   14. Após 6 dias de incubação em solução de anticorpos secundários, lave em PTwH 4-5 vezes durante a noite em RT.
   15. Desidratar com uma série graduada de MeOH (20%, 40%, 60%, 80%, 100% e 100% MeOH). A amostra pode ser armazenada durante a noite em RT.
   16. Incubar em diclorometano a 66% / MeOH a 33% por 3 h em RT com agitação.
   17. Lave duas vezes em diclorometano a 100% por 15 min em RT com agitação.
   18. Incubar e armazenar amostras em éter benzílico. Encha o tubo para minimizar o ar de oxidação da amostra.
2. Imagem da amostra limpa de tecido
   1. Fixe uma câmara contendo adesivo em uma lâmina e aplique esmalte ao redor do perímetro da câmara. Para tecidos mais espessos, câmaras e/ou espaçadores adicionais podem ser empilhados na lâmina.
   2. Coloque o tecido limpo na câmara, encha com éter benzílico e aplique uma lamínula.
   3. Aplique esmalte ao redor da lamínula para criar uma vedação.
   4. Obtenha imagens de tilescan e pilha Z usando um microscópio confocal de varredura a laser vertical com uma lente de 5x ou 10x para obter imagens em uma profundidade até a distância de trabalho da lente.
   5. Imagem com resolução de 1024 x 1024 usando linhas de laser apropriadas para espectros de emissão de fluoróforos usados. A autofluorescência muscular é visível usando a linha de laser de 488 nm.
   6. Certifique-se de que o tamanho do passo do eixo z seja compatível com a amostragem de Nyquist com base na abertura numérica da objetiva especificada¹¹.
   7. Costure imagens e use software para visualização 3D.
   8. Crie figuras usando imagens de projeção de intensidade máxima (MIP) de pilhas Z para canais individuais e mesclados (Figura 2).
3. Imuno-histoquímica
   NOTA: Depois que o tecido é embebido em parafina²², o procedimento a seguir é usado para criar lâminas para estudo imuno-histoquímico.
   1. Preparação da solução de correspondência do índice de refração (RIMS).
      1. Prepare o tampão fosfato 0,1 mol / L adicionando 10,9 g de Na₂HPO₄ (anidro) e 3,1 g de NaH₂PO₄ (monohidratado) ao H₂O deionizado a um volume total de 1 L (pH 7,4). Filtre a solução e guarde-a em RT.
      2. Dilua o tampão fosfato para 0,02 mol/L.
      3. Dissolva o Histodenz em 30 mL de tampão fosfato 0,02 mol / L agitando a solução por 10 min com uma barra de agitação magnética no frasco de armazenamento final que pode ser lacrado para minimizar a evaporação e a contaminação.
      4. Adicione azida de sódio a uma concentração total de 0,01% (p / v) e ajuste o pH para 7,5 com NaOH.
      5. Ajuste o RI variando a concentração final de Histodenz.
      6. Armazene o RIMS no RT por meses. Descarte se for observada contaminação microbiana.
         NOTA: NÃO autoclave nenhuma solução que contenha azida sódica.
   2. Preparação de lâminas para estudo imuno-histoquímico
      1. Crie seções de 5 μm de espessura com micrótomo. Aplique a seção de tecido nas lâminas carregadas.
      2. Remova a parafina incubando as lâminas em xileno >75% por 10 min. Mova as lâminas para um segundo recipiente com xileno por mais 10 min.
      3. Remova o xileno imergindo as lâminas em 100% de EtOH por 10 min, depois em 95% de EtOH por 5 min e 70% de EtOH por 5 min.
      4. Enxágue as lâminas com H₂O deionizado por 5 min.
      5. Mergulhe as lâminas em tampão de recuperação de antígeno por 25 min a 90-95 ^{° C.}
      6. Deixe o recipiente esfriar até RT por 1 h com agitação.
      7. Mergulhe as lâminas em tampão de imersão (0.01 mol/L PBS + 0.4% Triton X-100) por 30 min a 4^°C.
      8. Circunde o tecido com uma caneta PAP. Adicione PBS a cada lâmina e coloque-a em uma câmara umidificada para evitar a dessecação.
      9. Lave as lâminas com PBS em RT com agitação por 5 min.
      10. Bloqueie com tampão de bloqueio (0,01 mol / L PBS + 10% de soro de burro + 0,1% de TX-100) por 1 h com agitação.
      11. Incubar com um anticorpo primário diluído em tampão de bloqueio durante a noite a 4 ^°C.
      12. No dia seguinte, deixe os slides aquecerem até o RT por 15 min.
      13. Lave as lâminas 3 vezes com 0,01 mol/L PBS + 0,2% TritonX-100 por 5 min.
      14. Incubar com um anticorpo secundário diluído em tampão de bloqueio por 1 h em RT com agitação.
      15. Lave as lâminas 3 vezes com 0,01 mol/L PBS + 0,2% TritonX-100 por 5 min.
      16. Lave as lâminas 3 vezes com 0,01 mol/L PBS por 5 min.
      17. Coloque 1 gota de RIMS com um conta-gotas e aplique uma lamínula.
      18. Aplique esmalte ao redor da lamínula para criar a vedação.
      19. Como controlo negativo, executar uma amostra sem o anticorpo primário para demonstrar a ausência de coloração específica.
   3. Lâminas imunocoradas por imagem
      1. Visualize as lâminas com um microscópio confocal de varredura a laser com lentes objetivas de 10x, 20x e 40x.
      2. Imagem com resolução de 1024 x 1024 usando linhas de laser apropriadas para os espectros de emissão dos anticorpos secundários usados.
      3. Crie figuras usando imagens de projeção de intensidade máxima (MIP) de pilhas Z para canais individuais e mesclados (Figura 3).

2. Exame em mesoescala

1. Dissecção estereoscópica
   1. Realize dissecções delicadas com foco em estruturas minúsculas ou finas, como nó atrioventricular, artéria do nó atrioventricular e plexo nervoso cardíaco (escala submilimétrica a milimétrica) com uma lâmpada de mesa de aumento com pinça, telescópios cirúrgicos ou estereomicroscópio.
2. Microtomografia computadorizada
   NOTA: A tomografia computadorizada é realizada após perfusão e fixação por pressão e em qualquer estágio da dissecção usando uma tomografia por emissão de micropósitrons (PET)/tomografia computadorizada (Figura 4).
   1. Aqueça a fonte de raios-X da TC por 25 minutos antes da imagem da amostra.
   2. Coloque a amostra de coração na base do scanner.
   3. Mova a base do scanner para uma posição horizontal de 544 mm e uma posição vertical de 14 mm para centralizar o coração no campo de visão (FOV) da TC.
   4. Adquira a imagem de TC a 80 kVp, 150 μA, com 720 projeções durante o tempo de varredura de 1 minuto a uma resolução espacial de 200 μm.
   5. Reconstrua os dados de TC com um campo de visão de 12 cm x 12 cm x 10 cm e uma matriz de 600 x 600 x 500 voxels e salve como um arquivo DICOM.

3. Exame em escala macro

1. Perfusão e fixação por pressão
   NOTA: Os autores modificam as técnicas de perfusão e fixação por pressão descritas anteriormente e as aplicam aos corações humanos sem falha rejeitados para transplante 14,19,20,21.
   1. Use bombas de alto fluxo para fixação de perfusão. Use 100% de etanol¹⁴, 4% de PFA ou 10% de formalina para o fixador.
      NOTA: O coração é recuperado com a aorta ascendente, o tronco pulmonar e ambas as veias cavas e as veias pulmonares ressecadas o mais distalmente possível e entregues na solução²³ da Universidade de Wisconsin.
   2. Use duas cânulas cirúrgicas 20-24 Fr para perfusão cardíaca direita e esquerda. Para perfusão cardíaca direita, canule a veia cava superior e coloque uma ventilação no tronco pulmonar ou na artéria pulmonar com seringas plásticas de 12 a 30 mL cortadas pela metade com pontas Luer-Lock presas a torneiras de três vias.
   3. Oclua a veia cava inferior e a outra artéria pulmonar com barbante depois de colocar uma seringa de plástico meio cortada de tamanho apropriado ou tubo de centrífuga de 1,5-5,0 mL.
      1. Para perfusão anterógrada do coração esquerdo, canule uma das veias pulmonares e coloque uma abertura na extremidade distal cortada da aorta com as seringas plásticas de 12 a 30 mL meio cortadas com pontas Luer-Lock presas a torneiras de três vias.
      2. Para a perfusão retrógrada do coração esquerdo, canule um dos ramos do arco aórtico e coloque uma abertura em outro ramo do arco aórtico. Coloque as pontas das cânulas em ambos os ventrículos.
   4. Ocluir outros orifícios do recipiente com barbante depois de inserir uma seringa de plástico meio cortada de tamanho apropriado ou um tubo de microcentrífuga de 1,5-5,0 mL. Use uma gaze fina para cobrir a parte de inserção das seringas/tubos/cânulas para evitar vazamentos e deslizamentos. Corrija grandes vazamentos usando sutura, bandagem ou aglomeração. Pequenos vazamentos são permitidos.
   5. Suspenda o coração em um recipiente de plástico.
   6. Conecte o tubo de plástico macio 22-24 Fr a cada cânula e insira a outra extremidade do tubo no recipiente cheio de fixador.
   7. Circule o fixador pelos circuitos do coração direito e esquerdo usando uma bomba de alto fluxo ajustada em aproximadamente 100-300 mL / min para o coração direito e 200-400 mL / min para o coração esquerdo para atingir aproximadamente 20 mmHg no ventrículo direito e 80 mmHg no ventrículo esquerdo, respectivamente.
   8. Manter a perfusão a 4 °C durante 24 h.
   9. Lave o coração com 0,01 mol / L PBS por 30 min com agitação quatro vezes.
   10. Armazene o coração em 0,01 mol / L PBS / 0,02% de azida de sódio a 4 ° C.
       NOTA: A fixação por pressão-perfusão só é eficaz para um coração fresco, não para um coração recuperado de um cadáver embalsamado.
2. Dissecção macroscópica
   1. Realize a dissecção progressiva com registros fotográficos em cada estágio da dissecação.
   2. Para manter a relevância clínica, preste atenção especial para evitar distorcer/deformar quaisquer estruturas para manter a morfologia fisiológica do coração.
   3. Estruturas alvo de imagens usando orientação clinicamente relevante, como orientação oblíqua anterior direita.
3. Fotografia
   1. Coloque o coração fixo e perfundido sob pressão em um tripé com uma plataforma montada com vários pinos e a capacidade de girar 360^o.
   2. Fotografe o coração usando uma câmera reflex digital de lente única (Figura 5)²⁴ enquanto usa vários painéis de luz de diodo emissor de luz colocados nos suportes C e um amplo pano de fundo preto de edredom.
   3. Fotografe usando a lente com uma distância focal longa (200 mm) para uma distância de trabalho de 4-6 pés para minimizar a distorção do assunto¹⁴.
4. Anaglyphs
   1. Para exibir imagens anaglíficas, reconstrua um par de fotografias ou imagens renderizadas em volume a partir de conjuntos de dados de TC com uma diferença de 10° no ângulo de rotação no plano horizontal.
   2. Converta um conjunto dessas imagens bidimensionais (2D), chamadas de estereograma, em anáglifos usando freeware¹⁶.
   3. Para visualizar um anáglifo, use óculos vermelhos/cianos.
5. Fotogrametria
   NOTA: A fotogrametria é a ciência aplicada de gerar uma reconstrução tridimensional renderizada na superfície a partir de várias fotografias bidimensionais tiradas em ângulos variados¹⁷.
   1. Suspenda a amostra em C-Stands ou coloque-a na mesa giratória para obter centenas de fotografias multidirecionais com um smartphone.
   2. Gere o modelo 3D no formato FBX usando software disponível comercialmente.
6. Tomografia computadorizada (TC)
   NOTA: A tomografia computadorizada pode ser realizada após perfusão e fixação por pressão e em qualquer estágio da dissecção.
   1. Suspenda a amostra de coração de uma barra colocada na parte superior do recipiente. Para evitar que o coração balance durante o exame, apoie a base do coração com pinos de plástico fixados no fundo do recipiente. Assim, o ar servirá como um contraste negativo.
   2. Realize a tomografia computadorizada usando um tomógrafo de linha multidetectores disponível comercialmente com os seguintes parâmetros: tensão do tubo de 120 kV, corrente do tubo de 800-900 mA e rotação do pórtico de 280 ms. O produto de duração da dose é geralmente 500-1200 mGy.cm.
   3. Reconstrua os dados da imagem axial usando os seguintes parâmetros: uma espessura de seção, 0,6 mm; um intervalo incremental, 0,3 mm; um campo de visão, o menor possível (geralmente 100-200 mm); e uma matriz, 512 × 512.
7. Dissecação virtual
   1. Analise as imagens de tomografia computadorizada usando software disponível comercialmente para gerar imagens de dissecção virtual.
      NOTA: A dissecção virtual é uma modificação do processo de renderização de volume em que o foco é deslocado para as paredes das câmaras e vasos cardíacos¹⁸. Nesse processo, o limite manual praticamente remove a câmara aprimorada dos conjuntos de dados originais.
   2. Visualize as paredes, septos e válvulas sem realce com dissecção virtual para produzir imagens semelhantes à dissecção macroscópica. Ao contrário da dissecção macroscópica das amostras cardíacas, os planos de corte durante a dissecção virtual são praticamente ilimitados. Quase qualquer visualização pode ser recriada para visualizar as estruturas de interesse conforme necessário.
8. Impressão 3D
   1. Abra o arquivo compatível da amostra de coração no software da impressora 3D.
   2. Use o perfil de 0,10 mm Fast DETAIL para as configurações de impressão na impressora 3D e reduza a velocidade de impressão para 20 mm/s. Ative Gerar material de suporte.
   3. Use o perfil de filamento TPU para "Configurações de filamento" na impressora 3D.
   4. Use o profile do bocal Original Prusa MK4 Input Shaper 0.4 para "Configurações da impressora" na impressora.
   5. Após a conclusão do fatiamento, salve o arquivo BGCODE em uma unidade flash USB para impressão 3D.
   6. Use o filamento TPU de 1,75 mm para imprimir em 3D a amostra do coração humano. Antes da impressão 3D, secar o filamento TPU durante 6 h com um secador de filamentos.
   7. Para reduzir a tensão do filamento durante a impressão 3D, coloque o carretel de filamento em um suporte de carretel com um rolamento embutido para facilitar a rotação do carretel de filamento. Realize a impressão 3D usando uma impressora 3D disponível comercialmente com uma chapa de aço revestida a pó texturizada.
   8. Remova cuidadosamente os materiais de suporte quando a impressão 3D estiver concluída.

Resultados

Exames em microescala
A aplicação de limpeza de tecido permite a aquisição de imagens de grandes volumes de tecido em 3D usando microscopia confocal. No coração, podem ser visualizados gânglios contendo neurônios cardíacos e o padrão neural da inervação miocárdica (Figura 2). A Figura 3 mostra uma imagem confocal do miocárdio do ventrículo esquerdo humano imunomarcado para nervos e células musculares lisas. Observa-se que os v...

Discussão

O presente estudo demonstra o pipeline abrangente para analisar amostras obtidas de corações humanos inteiros. Os resultados representativos mostram exames anatômicos em micro a macroescala realizados rotineiramente em um único coração. Como uma amostra de coração humano é extremamente preciosa, uma abordagem em várias escalas é ideal e eficaz para não desperdiçar nenhuma parte da amostra aplicando vários protocolos para vários fins, incluindo descoberta em pesquisa científica, melhoria de procedimentos c...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P3813
3D Viewer	Microsoft
647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch Laboratories	711-605-152
647 AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG	Jackson ImmunoResearch Laboratories	713-605-147
AF Micro-NIKKOR 200 mm f/4D IF-ED lens	Nikon
Anti-Actin, α-Smooth Muscle - Cy3 antibody	Sigma-Aldrich	C6198
Antigen Retrieval Buffer (100x EDTA Buffer, pH 8.0)	Abcam	ab93680
Anti-PGP9.5 (protein gene product 9.5)	Abcam	ab108986
Anti-TH (tyrosine hydrox ylase)	Abcam	ab1542
Anti-VAChT (vesicular acetylcholine transporter)	Synaptic Systems	139 103
Benzyl ether	Sigma-Aldrich	108014
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A4503-10G
Cheetah 3D printer filament (95A), 1.75 mm	NinjaTek
Coverslip, 22 mm x 30mm, No. 1.5	VWR	48393 151
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch Laboratories	711-165-152
Dichloromethane	Sigma-Aldrich	270997-100ML
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8418-500ML
Ethanol, 100%	Decon laboratories	2701
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126-500G
GNEXT PET/CT	SOFIE Biosciences
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma-Aldrich	H3149-50KU
Histodenz	Sigma-Aldrich	D2158-100G
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	H1009-500ML
Imaging software	Zeiss	ZEN (black edition)
Imaging software	Oxford Instruments	Imaris 10
iSpacer	Sunjin Labs	iSpacer 3mm
KIRI Engine	KIRI Innovation
Laser scanning confocal microscope	Zeiss	LSM 880
LEAD-2 - Vertical & Multi-channels Peristaltic Pump	LONGER
Lightview XL	Brightech
Methanol (Certified ACS)	Fischer Scientific	A412-4
Nikon D850	Nikon
NinjaTek NinjaFlex TPU @MK4	NinjaTek
Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch Laboratories	017-000-121
Original Prusa MK4 3D printer	Prusa Research
PAP pen	Abcam	ab2601
Paraformaldehyde, 32%	Electron Microscopy Sciences	15714-S
Polycam	Polycam
Primary antibody
PrusaSlicer 2.7.1	Prusa Research
SARA-Engine	pita4 mobile LLC
Scaniverse	Niantic
Secondary antibody
SlowFade Gold Antiface Mountant	Invitrogen	S36936
Sodium azide, 5% (w/v)	Ricca Chemical Company	7144.8-32
SOMATOM Definition AS	Siemens Healthcare
Standard Field Surgi-Spec Telescopes,	Designs for Vision
Stereomicroscope System SZ61	OLYMPUS
StereoPhoto Maker	Free ware developed by Masuji Suto
Superfrost Plus Microscope Slides, Precleaned	Fisher Scientific	12-550-15
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-50ML
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416-100ML
Xylene	Sigma-Aldrich	534056-4L
Ziostation2	Ziosoft, AMIN