Morte induzida por LPS e ATP de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA e sua validação

Resumo

Este protocolo é baseado na morte induzida por LPS e ATP de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA. Usamos citometria de fluxo para analisar a coloração dupla de Anexina V e 7-AAD para detectar morte celular, usando a célula inteira e empregando microscopia eletrônica de varredura para observar a morfologia da membrana celular.

Resumo

A morte celular é um processo fundamental em todos os organismos vivos. O protocolo estabelece um modelo de deposição lipídica diferenciada de forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) induzida por lipopolissacarídeo (LPS) e adenosina trifosfato (ATP) em modelo de macrófago de monócitos humanos (THP-1) para observar a morte celular. O LPS combinado com ATP é um método clássico de indução inflamatória, frequentemente usado para estudar a piroptose, mas a apoptose e a necroptose também respondem à estimulação por LPS/ATP. Em circunstâncias normais, a fosfatidilserina está localizada apenas no folheto interno da membrana plasmática. No entanto, nos estágios iniciais de piroptose, apoptose e necroptose, a membrana celular permanece intacta e exposta à fosfatidilserina e, nos estágios posteriores, a membrana celular perde sua integridade. Aqui, a citometria de fluxo foi usada para analisar a coloração dupla de Anexina V e 7-Aminoactinomicina D (AAD) para detectar a morte celular de células inteiras. Os resultados mostram que células substanciais morreram após estimulação com LPS / ATP. Usando microscopia eletrônica de varredura, observamos as possíveis formas de morte celular em células individuais. Os resultados indicam que as células podem sofrer piroptose, apoptose ou necroptose após estimulação com LPS/ATP. Este protocolo tem como foco observar a morte de macrófagos após estimulação com LPS/ATP. Os resultados mostraram que a morte celular após a estimulação de LPS e ATP não se limita à piroptose e que a apoptose e a apoptose necrótica também podem ocorrer, ajudando os pesquisadores a entender melhor a morte celular após a estimulação de LPS e ATP e escolher um método experimental melhor.

Introdução

A morte celular é um processo fisiológico fundamental em todos os organismos vivos. Nos últimos anos, estudos substanciais mostraram que a morte celular está envolvida na imunidade e no equilíbrio dentro do organismo. Estudar a morte celular nos ajuda a entender melhor o início e o desenvolvimento de doenças. Várias formas de morte celular programada foram descritas, e alguns alvos-chave nesses processos foram identificados. Piroxase, apoptose e necroptose são as três vias de morte celular programada geneticamente definidas envolvidas no equilíbrio interno e na doença¹.

A piroptose é caracterizada pela formação de poros de membrana e pela liberação de conteúdo celular. Caspases ou granzimas ativadas clivam gasderminas para separar seus domínios N-terminais, que então oligomerizam, ligam-se à membrana e formam poros ^2,3,4. O poro da gasdermina fornece um canal de secreção atípico através das membranas celulares, resultando em respostas celulares a jusante, incluindo liberação de conteúdo e influxo de íons ^2,3,4. Em última análise, as células eventualmente experimentam ruptura da membrana plasmática e lise piroptótica facilitada pela ninjurina-1⁵. Na apoptose, Bax e Bak ativados formam oligômeros na membrana externa mitocondrial e liberam o citocromo C, que é regulado por um equilíbrio entre proteínas pró-apoptóticas e antiapoptóticas da família BCL-2, caspases iniciadoras (caspase-8, -9 e -10) e caspases efetoras (caspase-3, -6 e -7)^1,6,7. As alterações morfológicas da apoptose incluem bolhas de membrana, encolhimento celular, fragmentação nuclear, condensação da cromatina e formação de corpos apoptóticos ^6,8. A serina/treonina-proteína quinase 1 (RIPK3) que interage com o receptor e a quinase de linhagem mista semelhante ao domínio (MLKL) são dois componentes centrais a jusante do mecanismo necroptótico¹. RIPK3 recruta e fosforila MLKL, p-MLKL oligomeriza, associa-se à membrana celular, inicia perfurações de membrana, causa influxo de íons, aumenta a osmolaridade intracelular e, eventualmente, a ruptura celular ^6,9. Gasderminas e MLKL ligam-se à membrana plasmática e medeiam piroptose e necroptose, respectivamente, enquanto BAX/BAK medeia a apoptose ligando-se à membrana externa das mitocôndrias⁶.

Embora cada via tenha mecanismos e resultados específicos, eles levam a alterações semelhantes na membrana celular. Em circunstâncias normais, a fosfatidilserina (PS) está localizada apenas no folheto interno da membrana plasmática. No entanto, nos estágios iniciais de piroptose, apoptose e necroptose, o PS será exposto, fora da membrana plasmática. A caspase-3/caspase-7 ativa as famílias TMEM16 e XKR, o que leva a uma membrana celular assimétrica e externaliza o PS durante a apoptose¹⁰. O influxo de Ca²⁺ mediado por Gasdermin D e MLKL leva à perda da simetria da bicamada fosfolipídica na membrana celular e à exposição do PS. A exposição ocorre antes da perda da integridade da membrana celular ^11,12. Com base nas alterações semelhantes na membrana desses três tipos de morte celular programada, usamos citometria de fluxo para analisar a coloração dupla de Anexina V / 7-Aminoactinomicina D (7-AAD) para detectar a morte celular. A anexina V, uma proteína de ligação a fosfolipídios dependente de cálcio, tem alta afinidade pelo PS, que pode servir como uma sonda sensível para detectar o PS exposto na superfície da membrana plasmática¹³. 7-AAD é uma mancha de ácido nucleico que não pode passar por toda a membrana celular. É semelhante ao iodeto de propídio (PI), um corante de ácido nucleico comumente usado. Eles têm características de fluorescência semelhantes, mas o 7-AAD tem um espectro de emissão mais estreito e menos interferência com outros canais de detecção. Devido a essas semelhanças, não é suficiente distinguir entre piroptose, apoptose e necroptose. Usamos citometria de fluxo para detectar a morte celular de células inteiras. Um segundo método é usado para capturar a membrana celular usando microscopia eletrônica de varredura (SEM) para observar as possíveis formas de morte celular em células individuais.

Estabelecemos um modelo de deposição lipídica diferenciada de forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) induzida por lipopolissacarídeo (LPS) e adenosina trifosfato (ATP) em modelo de macrófagos de monócitos humanos (THP-1) para observar a morte celular. Este protocolo se concentra em observar a morte celular em vez de investigar mecanismos.

Protocolo

1. Linhagem celular e cultura celular

1. Cultive a linha celular monocítica humana THP-1 em meio de cultura completo RPMI-1640 com 10% de soro fetal bovino, 1% de penicilina-estreptomicina e 0,05 mM de β-mercaptoetanol. Cultive as células a 37 ° C em ar umidificado com 5% de CO₂ . Subcultura de células a cada 2-3 dias.
   NOTA: THP-1 é uma célula de suspensão, selecione para alterar metade do meio para subcultura. Ao observar muitos fragmentos de células ao microscópio óptico, centrifugue a 300 x g por 3 min em temperatura ambiente. Ressuspenda as células no meio de cultura celular completo fresco pré-aquecido.
2. Use células (nas passagens 4-10) na fase de crescimento logarítmico para todos os experimentos. Quando as células estão em boas condições e fase de crescimento logarítmico, elas são redondas, brilhantes, densas e sem aglomerados e fragmentos de células ao microscópio óptico a 100 x.

2. Diferenciação de células THP-1

1. Prepare uma solução de estoque de PMA com uma concentração de 1 mM (dissolva 1 mg de PMA em 1,62 mL de dimetilsulfóxido). Diluir a solução-mãe de PMA com meio de cultura celular completo até obter uma concentração final de trabalho de 100 nM.
2. Recolher as células da placa de cultura para um tubo de centrifugação estéril de 10 ml. Centrifugue a 300 x g por 3 min à temperatura ambiente, ressuspenda as células com 3 mL de meio de cultura completo contendo PMA.
3. Abra o contador de células e o software de contagem. Pipetar 20 μL de suspensão de células para a placa do contador de células e insira-o na placa do contador de células. Clique em Preview B1, gire o botão na parte inferior direita do instrumento e ajuste a distância focal para tornar as células com centro brilhante com contornos claros no software. Clique em Contar para iniciar a contagem.
4. Com base nos resultados da contagem, use meio de cultura completo contendo PMA para ajustar a densidade celular para 1 x 10⁶ células / mL. Células de sementes em uma placa de 6 poços, incubar a placa por 24 h a 37 ° C e 5% de CO₂ antes de iniciar o tratamento adicional.

3. Tratamento de células THP-1

1. Prepare uma solução estoque de LPS com uma concentração de 1 mg / mL (dissolva 1 mg de LPS em 1 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS)). Diluir a solução-mãe de LPS com meio isento de soro até obter uma concentração final de trabalho de 1 μg/ml. Preparar uma solução-mãe de ATP de Na₂com uma concentração de 500 mM (dissolver 0,3026 g de ATP em 1 ml de PBS).
2. Aspire o meio contendo PMA dos poços e lave com PBS 1x. Adicione meio sem soro ao grupo de controle e meio sem soro contendo LPS ao grupo modelo. Incubar a placa durante 6 h a 37 °C + 5% de CO₂ antes de prosseguir com o tratamento adicional.
3. Após 6 h, adicionar a solução-mãe de ATP ao grupo de modelos até uma concentração final de trabalho de 500 nM. Incubar a placa durante 45 min a 37 °C + 5% CO₂ antes de prosseguir.

4. Análise por citometria de fluxo (método 1)

1. Preparação de amostras experimentais
   1. Semeie e incube as células em placas de 6 poços de acordo com a etapa 2. Estabeleça quatro grupos de controle sem tratamento: um controle sem coloração, dois controles de coloração simples (um para cada mancha) e um controle de coloração dupla. Estabeleça um grupo de tratamento e trate de acordo com a etapa 3.
   2. Após o tratamento, aspirar todo o sobrenadante dos poços e lavar com PBS 2x. Adicione 500 μL de tripsina a 0,05% (não EDTA) a cada poço e incube na incubadora por 30 s.
   3. Adicione 1 mL de meio de cultura completo RPMI-1640 a cada poço para impedir o descolamento da célula e colete as células no tubo de 5 mL. Centrifugue a 300 x g por 3 min em temperatura ambiente.
   4. Adicione 1 mL de PBS para ressuspender as células. Coloque os tubos com células em banho-maria a 37 °C durante 3 min. Centrifugue todas as amostras a 300 x g por 3 min em temperatura ambiente.
   5. Dilua 200 μL de tampão de ligação 5x com 800 μL de água destilada para tampão de ligação 1x. Adicione 100 μL de tampão de ligação 1x para ressuspender as células e transfira as células para o tubo de 5 mL.
   6. Adicione 5 μL de solução de anexina V-PE a um tubo de células do grupo controle por 10 min e 5 μL de solução de 7-AAD a outro tubo de células do grupo controle por 5 min (como controles de coloração simples separadamente). Agite suavemente cada tubo para misturar, corante e incubar as amostras em temperatura ambiente protegida da luz. Adicione 400 μL de PBS a cada tubo e vore suavemente para encerrar a incubação.
   7. Adicione 5 μL de solução de Anexina V-PE aos tubos restantes e incube por 5 min em temperatura ambiente. Agite suavemente cada tubo para misturar, corante e incubar as amostras em temperatura ambiente protegida da luz. Após 5 min, adicione 5 μL de solução de 7-AAD por 5 min em temperatura ambiente. Adicione 400 μL de PBS a cada tubo e vortex suavemente para encerrar a incubação.
   8. Filtrar a suspensão celular com uma malha de nylon de 35 μm que faz parte dos tubos de fundo redondo de poliestireno de 5 ml. Coloque o tubo no gelo e aguarde o teste. Misture suavemente antes de testar e insira-o no instrumento.
2. Citometria de fluxo
   1. Use citômetro de fluxo de classificação de células ativado por fluorescência para teste. Abra o software de análise de dados do citômetro de fluxo e confirme o desempenho do detector e do laser. Clique no citômetro e escolha Inicialização de fluidos, aguarde o sistema estar pronto. Exclua as bolhas da câmara de fluxo clicando em Citômetro > Modos de limpeza > Célula de fluxo de desgaseificação.
   2. Clique em Experimento, selecione em sequência Nova pasta, Experimento, Espécime, Tubo e Editar nome. Uma seta em forma pentagonal na frente do tubo, fica verde quando acende.
   3. Clique no ícone do Citômetro FACSCelesta (um ícone de tecla de atalho), selecione Parâmetro e, em seguida, selecione Sinal FSC, SSC e PE . Clique no ícone de Planilha Global (um ícone de tecla de atalho) para estabelecer o histograma PE. Para o citómetro de fluxo utilizado neste estudo, utilizar PE para a anexina V a 586 nm e traçar uma plotagem no eixo X; PerCP-Cy5.5 para 7-AAD a 700 nm e plotagem no eixo Y.
   4. Insira a amostra de controle não corada primeiro no instrumento. Clique no ícone de Painel de Aquisição (um ícone de tecla de atalho), adquira um mínimo de 10.000 eventos da população desejada. Exclua detritos usando uma porta (P1) em um gráfico de pontos FSC-A e SSC-A. Ajuste a taxa de fluxo para velocidade média e registre dados. Ajuste a tensão para colocar a população de células na diagonal do histograma FSC/SSC e clique em Reiniciar. Ajuste a taxa de fluxo para velocidade média e registre dados.
   5. Clique em Próximo tubo, execute os controles de coloração simples da Anexina V e 7-AAD para ajustar a compensação. Execute os tubos restantes e colete dados.

5. Imagem SEM (Método 2)

1. Preparação de amostras experimentais
   1. Semeie e incube as células em placas de 6 poços de acordo com a etapa 2 e trate de acordo com a etapa 3.
   2. Após o tratamento, aspire todo o sobrenadante dos poços e lave 2x com PBS. Adicione 500 μL de tripsina a 0,05% (não EDTA) a cada poço e incube na incubadora por 30 s.
   3. Adicione 1 mL de meio de cultura completo RPMI-1640 a cada poço para impedir o descolamento da célula e colete as células no tubo de 5 mL. Centrifugue a 300 x g por 3 min em temperatura ambiente.
   4. Fixe as células com 500 μL de fixador de microscópio eletrônico (dialdeído glutárico a 2,5%, sais de fósforo 100 mM) por 2 h à temperatura ambiente, seguido de durante a noite a 4 ° C.
   5. Prepare a solução de alúmen de cromo: Adicione 1,0 g de gelatina a 100 mL de água ultrapura, aquecimento em banho-maria a 70 ° C e mexa uniformemente. Adicione 0,05 g de alúmen de cromo, mexa uniformemente e filtre com papel de filtro. Mergulhe a lamínula limpa em solução de alúmen de crómio durante 2 h a 37 °C e seque-a num forno a 37 °C para utilização posterior.
      NOTA: O objetivo é evitar o descolamento celular durante o experimento.
   6. Colete as células da solução fixa. Centrifugue a 300 x g por 3 min em temperatura ambiente. Adicione 100 μL de PBS e sopre suavemente as células. Deixe cair a suspensão da célula na lamínula e deixe repousar por 5 min. Aspire todo o sobrenadante e lave 3x com PBS por 5 minutos de cada vez.
      NOTA: A operação deve ser realizada suavemente para evitar o descolamento da célula. Não agite vigorosamente, mova-se lentamente e adicione líquido lentamente ao longo da parede.
   7. Adicione 500 μL de fixação de ácido ósmico a 1% por 1 hora. Aspire todo o sobrenadante e lave 3x com PBS por 5 minutos de cada vez.
   8. Desidratar as amostras sucessivamente em uma série de concentrações de etanol (EtOH) (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 100%) por 15 min por solução de EtOH.
      NOTA: Os vidros de cobertura podem ser mantidos em 100% EtOH por vários dias a 4 °C, mas devem secar o mais rápido possível para evitar desidratação excessiva.
   9. Ligue o secador de ponto crítico, abra o tanque de CO₂ , resfrie a câmara a 10 °C. Embrulhe rapidamente a amostra com papel de filtro quando a pressão da câmara for de 0 psi e coloque-a na câmara.
   10. Abra a válvula de entrada, observe através da janela de observação de CO₂ , aumente o nível de CO₂ do líquido entre as duas linhas vermelhas (não exceda o limite superior), feche a válvula de entrada. Mergulhe a amostra por 10 min. Abra as válvulas de admissão e escape simultaneamente para equalizar o CO₂ por 1 min (o CO_{líquido 2} desloca o EtOH). Feche a válvula de escape para elevar o nível de CO₂ do líquido para a posição especificada, feche a válvula de admissão.
   11. Defina a temperatura para 35 °C e a pressão a 1250 psi. Assim que a temperatura e a pressão se estabilizarem, despressurize a 100 psi/min. Retire a amostra quando a pressão da câmara for zero e desligue o instrumento.
   12. Monte as amostras em suportes de amostras de alumínio SEM usando fita condutora. Empregue um revestidor de pulverização catódica para cobrir as amostras com uma camada (2-5 nm) de ouro.
2. Imagiologia
   1. Use SEM de emissão de campo frio de alta resolução para geração de imagens. Defina a tensão de aceleração do SEM para 3 kV. Defina a distância de trabalho para 10 mm. Defina a ampliação para 1.000x para observar o panorama. Defina a ampliação para 5.000x e 20.000x para localizar a membrana plasmática e obter a imagem da amostra.
      NOTA: O processo de visualização de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA via MEV é semelhante a outros tipos de células e tecidos e depende dos instrumentos utilizados. A referência¹⁴ fornece um protocolo SEM detalhado com vídeos de acompanhamento.

Resultados

As amostras de células foram tratadas conforme descrito no protocolo e a detecção por citometria de fluxo foi feita. As células normais não podem ser coradas com Anexina V e 7-AAD (Anexina V-/7-AAD-). Nos estágios iniciais de piroptose, apoptose e necroptose, o PS foi exposto e ligado à anexina V, mas a membrana celular ainda estava intacta e excluiu o 7-AAD do espaço extracelular (anexina V + / 7-AAD-). Nos estágios posteriores, a membrana celular perde sua integridade, as células são coradas simultaneamente ...

Discussão

Neste manuscrito, dois métodos foram usados para detectar a morte induzida por LPS e ATP de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA. A dupla coloração com anexina V/7-AAD foi usada, e os resultados foram analisados por citometria de fluxo da coloração global. Tal como acontece com outras análises de citometria de fluxo, um grupo de células não coradas e dois grupos de células coradas simples foram configurados para excluir resultados falsos positivos e falsos negativos. Os resultados mostram que após a estimula...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% pancreatic enzyme solution (excluding EDTA)	BOSTER Biological Technology co.ltd	PYG0068
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube	CORNING	352235
5 mL centrifuge tube	Labgic Technology Co., Ltd.	BS-50-M
6-well plate	Sorfa Life Science Research Co.,Ltd	220100
Annexin V-PE/7-AAD apoptosis analysis kit	Absin (Shanghai) Biological Technology co.ltd	abs50007	Annexin V-PE, 7-AAD, 5×Binding buffer, Apoptosis Positive Control Solution
celculture CO2 incubator	Esco (Shanghai) Enterprise Development Co., Ltd.	N/A
cell culture dish, 100 mm	Sorfa Life Science Research Co.,Ltd	230301
Cellometer K2 Fluorescent Cell Counter	Nexcelom Bioscience LLC	Cellometer K2
Cellometer SD100 Counting Chambers	Nexcelom Bioscience LLC	CHT4-SD100-002
centrifuge machine	Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd	L530
chromium alum	Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.	PA04354
cover glasses, 9 mm	Labgic Technology Co., Ltd.	BS-09-RC
critical point dryer	Quorum Technologies	K850
dimethyl sulfoxide	BOSTER Biological Technology co.ltd	PYG0040
electron microscope fixative	Servicebio Technology co.ltd	G1102	2.5% glutaric dialdehyde, 100 mM phosphorous salts
electronic balance	SHIMADZU	ATX124
ethanol absolute	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd	2021033102
flow cytometer	Becton,Dickinson and Company	FACSCanto
flow cytometry analysis software	Becton,Dickinson and Company	BD FACSDivaTM Software
gelatin	Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.	PA00256
High resolution cold field emission scanning electron microscope	TITACHI	Regulus 8100
human monocytic cell line THP-1	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd.	CL0233
inverted microscope	Leica Microsystems Co., Ltd	DMi1
IR Vortex Mixer	VELP Scientifica Srl	ZX4
lipopolysaccharide	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	L8880	LPS is derived from Escherichia coli 055:B5
Na2ATP	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	A8270
phorbol-12-myristate-13-acetate	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	P6741
phosphate-buffered saline	Servicebio Technology co.ltd	G4202
Pipette	Eppendorf AG	N/A
pipette tips, 10 μL	Servicebio Technology co.ltd	T-10PL
pipette tips, 1 mL	Servicebio Technology co.ltd	T-1250L
pipette tips, 200 μL	Servicebio Technology co.ltd	T-200L
RPMI-1640 complete culture media	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd.	CM0233	RPMI-1640 + 10% FBS + 0.05mM β-mercaptoethanol + 1% P/S
RPMI-1640 culture media	Shanghai BasalMedia Technologies Co., LTD.	K211104
sheath fluid	BECKMAN COULTER	8546733
sputter coater	Cressington Scientific Instruments Ltd	108
thermostatic water bath	GUOHUA Electric Appliance CO.,Ltd	HH-1