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Resumo

Avaliar as diferenças anatômicas entre as seções transversais das folhas C3 e C4 ajuda a entender a eficiência da fotossíntese. Este artigo descreve a preparação e o exame de seções transversais de folhas à mão livre e semifinas, juntamente com as ressalvas na preparação para as espécies de culturas Triticum aestivum e Zea mays.

Resumo

A eficiência aprimorada da fotossíntese C4 , em comparação com o mecanismo C3 , surge de sua capacidade de concentrar CO2 em células da bainha do feixe. A eficácia da fotossíntese C4 e a eficiência intrínseca do uso da água estão diretamente ligadas à participação do mesofilo e das células foliares do feixe, tamanho e densidade das bainhas do feixe e tamanho, densidade e espessura da parede celular das células da bainha do feixe. A análise microscópica rápida dessas características pode ser realizada em seções à mão livre e semifinas usando microscopia de luz convencional, fornecendo informações valiosas sobre a eficiência fotossintética em culturas C4 por meio da identificação e exame de tipos específicos de células. Além disso, são mostrados erros no preparo à mão livre e semifina que afetam as medidas anatômicas e os diagnósticos do tipo de célula, bem como a forma de evitar esses erros. Essa abordagem microscópica oferece um meio eficiente de coletar insights sobre a aclimatação fotossintética à variação ambiental e auxilia na triagem rápida de culturas para climas futuros.

Introdução

A fotossíntese é um processo fundamental onde a energia luminosa é convertida em energia química, servindo como pedra angular das redes tróficas terrestres. A maioria das plantas segue a via C3 da fotossíntese, onde o principal produto fotossintético é o composto de três carbonos glicerato 3-fosfato. A fotossíntese C3 evoluiu há mais de 2 bilhões de anos na atmosfera abundante em CO2 e baixa em O21. A principal enzima fotossintética ribulose 1,5 bifosfato carboxilase / oxigenase (Rubisco), que evoluiu nessas condições, é subótima para as atuais condições de baixo CO2 alto O2, pois reage competitivamente com O2, iniciando a fotorrespiração2. A fotorrespiração é uma via de desperdício que consome energia em vez de produzi-la e liberar CO2 como subproduto. Consequentemente, é crucial manter alta concentração de CO2 ao redor da Rubisco nos cloroplastos para evitar a oxigenação 3,4. Devido à incapacidade das plantas de C3 de concentrar CO2, há uma redução significativa de CO2 do ar ambiente para os cloroplastos, restringindo a fotossíntese e afetando o crescimento das plantas e a produção de biomassa 2,5,6.

Em plantas C3, a fotossíntese é limitada pela entrada de CO2 através dos estômatos, sua difusão através do mesofilo e a atividade bioquímica das enzimas fotossintéticas. A entrada de CO2 é inicialmente limitada pela condutância estomática, que é controlada por condições ambientais, como temperatura e umidade do ar. Em seguida, o CO2 se difunde através da fase gasosa e líquida interna da folha para Rubisco7. Nas plantas C3, todos os estágios da fotossíntese ocorrem nos cloroplastos das células do mesofilo, e as plantas precisam manter um influxo constante de CO2 da atmosfera para os cloroplastos. A dependência da disponibilidade de CO2 nos cloroplastos na abertura estomática, na arquitetura do mesofilo e nas características individuais das células e do cloroplasto deixa as plantas suscetíveis a restrições ambientais que eventualmente afetam a fotossíntese, como baixa disponibilidade de água e altas temperaturas 7,8,9,10, destacando particularmente sua vulnerabilidade às condições de mudança climática11.

Dados os desafios impostos pelas ineficiências da via C3, bem como as limitações na manutenção de níveis ideais de CO2 e suscetibilidade a fatores ambientais, em certas plantas, outra via, a via de fotossíntese C4, evoluiu. Caracteristicamente, as plantas C4 têm duas vias bioquímicas separadas espacialmente; a fixação inicial do CO2 ocorre nas células do mesofilo pela fosfoenolpiruvato carboxilase, que tem maior afinidade pelo CO2 do que a Rubisco e também não possui atividade de oxigenação. O produto C4 formado é posteriormente transportado para as células da bainha do feixe, onde é descarboxilado, e o CO2 é novamente liberado e fixado por Rubisco (fotossíntese C3) 12 , 13 , 14 . A maior afinidade da PEP carboxilase com o CO2 e as paredes celulares espessas das células da bainha do feixe permite a concentração de CO2 nas células da bainha do feixe e, portanto, as plantas de C4 minimizam a fotorrespiração segregando espacialmente a fixação de CO2 e o ciclo de Calvin. A adoção do caminho C4 mostra a resposta adaptativa da natureza às restrições ambientais, oferecendo insights sobre estratégias potenciais para melhorar a produtividade e a resiliência das culturas em mudanças nas condições climáticas15.

A anatomia especializada da estrutura foliar em plantas C4 é caracterizada por nervuras cercadas por células da bainha do feixe vascular aumentadas contendo cloroplastos e com um arranjo radial de células do mesofilo em um padrão de anel externo ao redor das células da bainha do feixe. As células do mesofilo estão próximas às células da bainha do feixe, o que permite um transporte rápido e contínuo de metabólitos entre os dois tipos de células. O arranjo dessa célula é típico das plantas C4 e é conhecido como anatomia de Kranz16. Nas espécies C3, a especialização e a disposição das células do mesofilo podem variar, mas as células da bainha do feixe são distintamente menores e têm alguns cloroplastos ou nenhum cloroplasto. A anatomia específica de Kranz permite concentrar o CO2 nos cloroplastos nas células da bainha do feixe onde se localiza a enzima carboxilante C3 Rubisco, dificultando efetivamente a fotorrespiração 4,17,18. Apesar de seu arranjo aparentemente complexo, essas mudanças ocorreram independentemente várias vezes na evolução das angiospermas, indicando que é uma via evolutiva relativamente viável 19,20,21, e vários táxons demonstraram estar em um estágio intermediário entre o metabolismo do carbono C 3 e C4, referido como C3-C 4 ou C 2, ter habilidades para se concentrar e reassimilar CO2 22,23,24,25.

Muitas plantas C4 são culturas com alta importância econômica, e a engenharia genética de culturas C3, como o arroz, para melhorar sua resiliência climática e garantir o rendimento tem sido um tópico de interesse nas últimas décadas26,27. No entanto, os esforços de engenharia exigem uma compreensão detalhada da anatomia especializada em C4 e como ela controla a fotossíntese 2,28.

Estabelecer a anatomia de C4 Kranz é um pré-requisito para atingir a ambiciosa meta de projetar a fotossíntese de C4 em culturas C3 25. No entanto, a compreensão atual da regulação da anatomia de Kranz e dos métodos para rastrear rapidamente suas principais características anatômicas é limitada, dificultando a identificação de espécies híbridas. Estudos anteriores mostraram que as principais características que regulam a eficiência fotossintética em plantas C3 e C4 incluem a distância internerval, o diâmetro do complexo da bainha do feixe e o tamanho das células da bainha do feixe14,29. Essas características podem ser facilmente rastreadas usando seções à mão livre e analisadas quantitativamente usando seções semifinas. Aqui, descrevemos o método de avaliação das características que permitem o diagnóstico de diferenciação anatômica C3 e C4 por meio de microscopia cruzada e óptica à mão livre, ou seja, área da bainha do feixe, distância internerval e frequência da veia.

Protocolo

1. Condições de crescimento das plantas

  1. Selecione trigo (Triticum aestivum L. Var. Trigo de inverno, "Fredis") e milho (Zea mays L. Var. Saccharata, "Golden Bantam") como plantas representativas C3 e C4 , respectivamente. Cultive ambas as espécies de plantas em uma câmara de crescimento controlada pelo ambiente a partir de sementes.
  2. Mantenha a umidade relativa em 55% com a temperatura do ar em 25 °C/18 °C (dia/noite) com um período de luz de 12 h. Manter a densidade de fluxo de fótons fotossintéticos (Q) na superfície da planta em 1200 μmol / m2 / s para representar suas condições naturais de crescimento. Cultive todas as plantas a uma concentração ambiente de CO2 de 400 μmol/mol.
  3. Regue as plantas a cada 2dias com água destilada e fertilize com a solução de Hoagland 10 dias após a emergência das mudas. Cultive as plantas nas condições dadas por 60 dias e use folhas totalmente expandidas para análises microscópicas.

2. Preparação e visualização de seções à mão livre

  1. Selecione 3 folhas maduras não senescentes de cada planta e mantenha-as em água destilada. Usando uma nova lâmina de barbear de um lado, faça um corte de nivelamento para formar um ângulo reto com a superfície da folha para garantir que as seções sejam seções transversais perpendiculares à superfície da folha.
  2. Coloque a amostra de folha em uma placa de vidro sobre um pedaço de cera dental para estabilizar a amostra e evitar escorregar. Corte movendo a lâmina diretamente para baixo na amostra da folha para cortar de forma limpa as células. Mantenha as seções transversais em água destilada.
  3. Monte as amostras em uma lâmina de vidro, colocando-as em uma gota de água e cobrindo-as com uma lamínula de vidro para visualização microscópica e imagem. Evite prender bolhas de ar.
  4. Visualize a lâmina sob um microscópio de luz composto com ampliação de 10x e 20x. Salve as imagens de acordo com o guia do software, juntamente com a escala relevante.

3. Preparação de seções semifinas

  1. Corte seções de aproximadamente 3 mm x 5 mm de tamanho das áreas intercostais ao longo da nervura central das folhas de Z. mays e T. aestivum em uma placa de vidro como na etapa 2.2. Certifique-se de que o comprimento da seção cortada corre ao longo do grão da folha.
  2. Coloque o material vegetal em uma seringa com 1 mL de tampão de fixação (aldeído glutárico a 4% em tampão fosfato 0,1 M, pH = 6,9, Tabela 1).
  3. Segure a seringa verticalmente, remova o ar e, segurando um dedo na ponta, bombeie a seringa para criar um vácuo. Repita até que as amostras estejam no fundo da seringa, indicando infiltração bem-sucedida.
  4. Transfira o conteúdo da seringa para um frasco para injetáveis de vidro rotulado e conserve a 4 °C durante 48 h antes do passo seguinte (Tabela 2).
  5. Para cada frasco para injetáveis, remova suavemente o fixador com uma pipeta e adicione o tampão fosfato até que a amostra esteja coberta. Deixe por 30 min. Repita esta etapa 3x.
  6. Remover o tampão fosfato com uma pipeta e adicionar o tetróxido de ósmio (CUIDADO) até cobrir a amostra. Amostras e outras matérias orgânicas ficarão pretas. Use luvas duplas. Deixe por 1 h.
  7. Remover a solução anterior com uma pipeta e cobrir as amostras com água destilada. Deixe por 30 min Repita esta etapa 3x e use luvas duplas.
  8. Retirar a solução anterior com uma pipeta e cobrir as amostras com a solução de água-etanol destilada 50/50. Deixe por 30 min. Repetir este passo com soluções destiladas de água-etanol das seguintes séries: 30/70, 20/80, 10/90 e 2x a 100 % de etanol. As amostras em qualquer uma destas soluções podem ser deixadas durante a noite a 4 °C.
  9. Remover a solução anterior com uma pipeta e cobrir as amostras com 1/3 de solução de resina e etanol. Coloque as amostras em uma placa misturadora e deixe por 2 h. Repita esta etapa com soluções de resina-etanol nas seguintes séries: 1/2, 1/1, 2/1, 3/1 e 2x a 100% de resina. As amostras em qualquer uma destas soluções podem ser deixadas durante a noite a 4 °C.
  10. Cubra as cavidades de um molde de incorporação plano (16 cavidades, dimensões da cavidade: 14 L x 4,8 W x 3 D (mm)) com 100% de resina e coloque as amostras em uma extremidade da cavidade. Prepare etiquetas de papel escritas a lápis para cada amostra e coloque-as na outra extremidade da cavidade.
  11. Preencha completamente todas as cavidades com 100% de resina e endireite as amostras e rótulos se eles se moverem. Cubra o molde com filme de incorporação e polimerize em um forno de acordo com as diretrizes do produto de resina acrílica.
  12. Coloque o bloco polimerizado com a amostra no suporte de amostra do ultramicrótomo. Apare o bloco usando uma faca de vidro áspera até que o tecido se torne visível e o excesso de resina seja eliminado.
  13. Corte seções semifinas transversalmente (1 μm) usando uma faca de vidro ou diamante. Colete as seções usando um laço de inoculação de metal da superfície da água e coloque-as em uma lâmina de vidro. Seque a lâmina numa placa de aquecimento (60 °C) para fixar as secções no vidro.
  14. Manchar as seções fixas com azul de toluidina (solução aquosa a 1%) por 5 s antes de enxaguar com água destilada e secar novamente na placa quente.
    NOTA: Certifique-se de que o processo de fixação química seja realizado sob uma capela de exaustão. As facas de vidro devem ser substituídas periodicamente para garantir cortes afiados que permitam seções sem rasgos ou distorções.

4. Imagem de amostras

  1. Imagem de seções de folhas frescas
    1. Configure o microscópio óptico composto com o software que o acompanha de acordo com o manual.
    2. Coloque a lâmina de vidro no palco. Ajuste a ocular e visualize a seção em 10x para obter uma visão geral, depois em objetivas de 20x e 40x.
    3. Em cada objetivo, navegue no canal ao vivo, concentre-se na área de interesse e localize as células da bainha do feixe ao redor da veia.
    4. Uma vez focado, clique no botão Congelar e adicione a escala pressionando o botão Barra de escala na guia Ferramentas. Salve a imagem em . Formato TIF para análise de imagens.
  2. Imagem de seções infiltradas por resina
    1. Configure o microscópio óptico automatizado em conexão com o software que o acompanha no computador.
    2. Carregue o canal transparente e coloque a lâmina na platina do microscópio. Concentre-se na seção usando uma ampliação objetiva de 40x e ajuste o brilho para garantir que todas as estruturas celulares estejam visíveis.
    3. Defina a área de localização da seção usando a função de navegador para garantir que toda a seção seja visualizada e clique no botão Costurar .
    4. Clique em Concluído e, em seguida, em Iniciar para permitir que o microscópio crie imagens de toda a seção. Abra o software de análise de imagem e abra os ladrilhos tirados pelo microscópio.
    5. Usando o recurso Alinhar, certifique-se de que os blocos não se sobreponham. Depois de gerar a imagem, ajuste o posicionamento, o brilho e a rotação usando a guia Ajustar.
    6. Imprima a escala na imagem antes de salvar em . Formato TIF.
  3. Medidas anatômicas usando o software ImageJ
    1. Abra o software ImageJ e carregue a imagem arrastando-a para a janela.
    2. Usando a ferramenta Linha, calibre a escala da seguinte maneira: Desenhe uma linha sobre a barra de escala, escolha Analisar > Definir escala, altere a distância conhecida para o comprimento da barra de escala e altere a unidade de comprimento para a unidade correta.
    3. Meça a característica prospectiva selecionando a Ferramenta Linha, desenhando uma linha na área de interesse e pressionando a tecla M .
    4. Para medições de área, selecione a Ferramenta de seleção de polígonos e desenhe ao redor do tecido de interesse. Conclua pressionando a tecla M . As medições aparecem como uma janela pop-up, que pode ser copiada para uma planilha para análise posterior dos dados.

Resultados

A Figura 1A mostra a orientação correta para seccionar a folha para seccionamento fresco e microscopia de luz. O método para cortar seções frescas usando uma navalha de um lado e uma folha de cera dental pode ser visto na Figura 1B. As seções resultantes são mostradas na Figura 1C.

A Figura 2 mostra seções à mão livre de folhas representativas da planta C3

Discussão

Neste artigo, discutimos os métodos quantitativos e qualitativos de medição da anatomia foliar e as maneiras pelas quais eles podem ser otimizados. Além disso, a metodologia é aplicada a espécies de culturas representativas para determinar quais características anatômicas são mais úteis na distinção entre as seções transversais C3 e C4 . Compreender essas características é essencial, pois as espécies híbridas, denominadas fotossíntese C2 , estão se tornando uma via de ...

Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

Os autores reconhecem o Programa H2020 da União Europeia (projeto GAIN4CROPS, GA no. 862087). O Centro de Excelência AgroCropFuture Agroecology e novas culturas em climas futuros é financiado pelo Ministério da Educação e Pesquisa da Estônia. Agradecemos à professora Evelin Loit-Harro pelo fornecimento de sementes de T. aestivum e Z. mays, a Paula Palmet e Vaiko Vainola pelo auxílio na preparação dos cortes transversais das folhas, e a João Paulo de Silva Souza pelo auxílio na análise. Todas as imagens foram obtidas da unidade de microscopia da Universidade de Ciências da Vida da Estônia em vários projetos.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Disodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO42H2O) purePENTA, CZ10028-24-7
Embedding Film, 7.8 mil Thick, 8 x 12.5, (203 x 318mm)ACLAR, US10501-10
Ethanol, abs. 100% a.r.Chem-Lab NV, BECL00.0505.1000Danger: Highly inflammable liquid and vapour.
EVOS Invitrogen FL Auto 2 Imaging SystemThermo Fisher Scientific, US
Flat Embedding PTFE Mold with Metal Frame, 16 cavitiesPELCO, US10501
Glass vial 2 mlVWR Life Science, US548-0045
Glutaraldehyde 50% solutionVWR Life Science, US23H2856331Danger: Fatal if inhaled. Toxic if swallowed. Causes severe skin burns and eye damage. May cause respiratory irritation. Wear protective gloves, protective clothing, eyes and face protection.
Histo diamond knifeDiatome, US
LEICA EM UC7Leica Vienna, AT
LR White resin hard gradeElectron Microscopy Sciences, US14383Danger: Causes skin irritation. Causes severe eye irritation May cause respiratory irritation. May cause drowsiness or dizziness Wear protective gloves, protective clothing, eyes and face protection.
Microscope slidesNormax, PT5470308A
Nikon Eclipse E600 and Nikon DS0Fi1 5 MPNikon Corporation, JP
Osmium Tetroxide (OsO4)Agar Scientific Ltd, GBR1019Danger: Fatal if swallowed, in contact with skin or if inhaled. Causes severe skin burns and eye damage Wear double protective gloves, protective clothing, eyes and face protection.
Pipette and pipette tipsThermo Scientific, FIKJ16047
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate (NaH2PO4 . 2H2O) purePENTA, CZ13472-35-0
Syringe 10 mlEcoject, DE20010
Toluidine blue, general purpose gradeFisher Scientific, GB2045836

Referências

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